Name: Anti-RDL et Anti-mGlutR1 Récepteurs Test des anticorps dans les sections du cerveau des abeilles à laide de CRISPR-Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez l'édition génique CRISPR-Cas9 dans le cerveau d'abeilles adultes pour étudier les récepteurs GABAA et glutamate métabotropes. Cette méthode permet d'évaluer la spécificité des anticorps et les mécanismes d'apprentissage.

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Ce travail a été appuyé par les prix suivants à BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Le peptide et les anticorps de DmGluRA ont été conçus dans le laboratoire Dr Serge Birman (Marseille, Luminy, France) lorsque l'IS a été soutenu par le Programme d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 de la Fondation pour la Recherche Médicale. Nous sommes reconnaissants à Daniela Junqueira Marosi et Alex Hanter de Integrated DNA Technology (IDT) pour l'aide à la conception des guides RDL et qPCR essais de dépôt.

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Caractérisation de l'anti-RDL et anti-mGlutR1 Tout d'abord, nous avons caractérisé les anticorps anti-RDL et anti-mGlutR1 par immunoblot et pré-adsorption sur les tranches des cerveaux fixes d'abeille de miel. Chaque anticorps a été fait pour reconnaître tous ses isoformes connus, et l'analyse occidentale montrent qu'ils reconnaissent les bandes qui correspondent à leur poids moléculaire prévu. Ensuite, les deux anticorps ont été bloqués par le peptide conjugué contre lequel ils ont été produits sur des sections de cerveau d'abeille de miel.
L'un des premiers objectifs de notre étude était d'établir que les anticorps produits contre le peptide conjugué spécifique sont spécifiques à sa protéine dans le tissu cérébral fixe. À cette fin, nous avons profité du système CRISPR-Cas9. Nous avons conçu des guides spécifiques pour l'abeille domestique RDL et mGlutR1 et utilisé chacun d'eux pour faire CRISPR-Cas9 étiqueté avec la sonde fluorescente ATTO550. Pour chaque récepteur, nous avons injecté un mélange de trois ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9 différentes dans l'ocelli pour réduire la quantité de protéine ciblée dans le cerveau adulte d'abeille domestique en éliminant le gène correspondant dans les cellules qui ont pris notre système Conçu Cas9. Dans notre étude, nous avons accompli cette étape.
L'une des premières étapes cruciales pour le succès de ces expériences est la conception du guide approprié ARN. Nous vous recommandons de concevoir jusqu'à cinq ARN guides, situés au début, au milieu et à la fin de la séquence génétique. Dans le le résultat de nos travaux préliminaires, nous les avons testés dans diverses combinaisons sur trois à cinq abeilles. Nous avons également essayé différentes concentrations d'injections, ainsi que des temps après l'injection, et divers mélanges de RNP dans les injections. Nous avons disséqué les cerveaux et les avons traités à l'aide d'anticorps anti-RDL et anti-mGlutR1. Dans ces premiers tests, nous avons établi la combinaison appropriée, le temps post-injection, ainsi que la concentration et la quantité de CRISPR-Cas9 pour l'injection. Ces premiers tests ont servi de base à la mise en place des expériences que nous avons décrites en détail ici.
L'objectif était double : 1) de démontrer chez une abeille que notre coloration d'anticorps a été réduite après traitement avec CRISPR-Cas9 et 2) pour travailler par les meilleures conditions expérimentales pour des études comportementales. Ainsi, nous montrons que si de nombreux noyaux cellulaires contiennent CRISPR-Cas9 48 h après injection, la réduction de la coloration anti-RDL et anti-mGlutR1 est significative. En outre, cela démontre que les anticorps testés reconnaissent spécifiquement la protéine mGlut1 et RDL dans la préparation du cerveau des abeilles mellifères et qu'ils peuvent être utilisés pour des études de localisation dans le cerveau des abeilles.
Réglage expérimental CRISPR-Cas9 pour l'étude comportementale Ensuite, nous avons mis en place les expériences afin que CRISPR-Cas9 puisse être utilisé dans des études comportementales. Huit ou neuf abeilles ont été recueillies pour des traitements de contrôle et expérimentaux. Ils ont été examinés comportementalement avant et après l'injection, puis leurs cerveaux ont été traités pour ATTO550 et/ou immunocytochemistry pour déterminer les régions de cerveau qui ont montré la réduction de la protéine cible. Ici, il est essentiel de noter que le nombre d'abeilles prises pour une série d'expériences a été limité à pas plus de 8-9 abeilles pour le contrôle et les conditions expérimentales. De cette façon, les deux conditions pourraient être testées le même jour. Aussi, une fois que nous avons préparé les mélanges CRISPR-Cas9 pour l'injection, nous ne les avons jamais gelés. Le mélange CRISPR-Cas9 n'a pas changé de puissance lorsqu'il est utilisé 3 jours d'affilée et maintenu à 4-8 oC. Cependant, nous ne l'avons pas testé après 3 jours.
Comme nous l'avons décrit dans la section Résultats pour les deux séries d'injections expérimentales et pour les deux anticorps, seulement trois abeilles de 16 testées ont montré une grande distribution ATTO550 dans le corps de champignon, protocerebrum, et lobes d'antenne. Dans toutes les autres abeilles, la distribution de CRISPR-Cas9 était limitée au corps des champignons, au complexe central et/ou au protocerebrum postérieur. Il est essentiel de comprendre pour toutes les études comportementales que l'utilisation de cette méthode d'injection de la réduction de la protéine cible sera limitée uniquement au corps des champignons dans la plupart des abeilles. Il ne s'étendra pas au lobe d'antenne ou au ganglion subesophageal. Ainsi, la technique d'injection que nous utilisons est appropriée pour étudier l'effet de la réduction des récepteurs dans le corps des champignons et le complexe central dans les expériences comportementales, tandis qu'une méthode différente d'introduction CRISPR-Cas9 sera plus approprié pour l'étude d'autres régions du cerveau.
En conclusion, notre étude a démontré l'application réussie de CRISPR-Cas9 comme commande pour la coloration d'anticorps dans le cerveau. Pour les deux anticorps (anti-RDL et anti-mGlutR1), lorsque l'entrée en mGlutR1-CRISPR-Cas9 ou RDL-CRISPR-Cas9 a été couronnée de succès, le niveau de coloration correspondante des anticorps a également été réduit de manière significative. En outre, il est essentiel de noter que l'injection dans l'ocelli a conduit à une distribution de CRISPR-Cas9 dans le cerveau qui n'était pas homogène. La distribution variait d'une zone minimale entourant l'ocelli et le corps des champignons à de nombreuses cellules dans l'ensemble du cerveau. La variabilité de l'apport de mGlutR1-ou de RDL-CRISPR-Cas9 par les cellules était probablement due à la variation des injections. Nos données montrent que le système CRISPR-Cas9 fonctionne chez les abeilles mellifères, mais la méthode d'injection doit être améliorée pour réduire la variabilité de l'apport de CRISPR-Cas9 dans les différents cerveaux d'abeilles. Dans le cadre de ces restrictions, il est maintenant possible d'utiliser cette technique pour manipuler des gènes chez les abeilles adultes pour des expériences comportementales.

Le système CRISPR/Cas9 récemment découvert est un outil puissant qui a été utilisé pour modifier l'ADN génomique dans divers systèmes modèles et organismes. Il a accéléré la recherche biomédicale et les percées technologiques majeures en rendant la modification du génome plus efficace et robuste que les méthodes précédentes1. Originaire des bactéries S. pyogenes, le système repose sur une endodoucane Cas9, dont l'activité conduit à des ruptures à double brin (DSB) dans l'ADN, et un ARN guide (gRNA) qui dirige la protéine Cas9 à un endroit spécifique, dépendant de la séquence2. Les pauses à double brin générées par CRISPR/Cas9 peuvent être réparées par l'intermédiaire d'une jointure finale non homologue (NHEJ), un processus sujet aux erreurs qui peut conduire à des changements de cadre, ou à une réparation directe de l'homologie lorsqu'un modèle de donneur est présent. Le gRNA lui-même se compose d'un ARN CRISPR spécifique à la cible (crRNA) et d'un crRNA trans-activant universel (tracrRNA) qui peut être synthétisé chimiquement et livré avec la nucléase Purifiée De Cas9 comme complexe de ribonucléoprotein (RNP)2,3. L'étiquetage fluorescent de la nucléase gRNA ou Cas9 peut permettre la détection et la visualisation intracellulaire des composants moléculaires par microscopie fluorescente4.
Dans notre travail actuel, nous profitons du système CRISPR-Cas9 pour réduire les niveaux de protéines dans les cerveaux adultes d'abeilles domestiques. Nous avons étudié le récepteur du glutamate métabotropique (mGluR) et les anticorps récepteurs anti-mGlutR1 et les anticorps sous-unit DE récepteur sabre RON lett.A. et les anticorps anti-RDL. Nous avons développé une méthode simple pour réduire la quantité de protéines dans le cerveau de l'abeille domestique adulte et l'avons utilisée pour conduire des tests supplémentaires des anticorps développés contre les protéines correspondantes. La surveillance de la fluorescence de CRISPR-Cas9 nous a permis d'estimer les zones et les cellules impliquées dans la réduction de la protéine.
En utilisant cette méthode, nous avons également caractérisé les anticorps anti-mGlutR1 qui ont été fabriqués chez les lapins contre le peptide conjugué. Le génome de l'abeille mellifère code un AmGluRA très conservé (nommé mGlutR1 selon la nomenclature NCBI) récepteur du glutamate métabotropique5. Le gène mGlutR1 d'abeille de miel a quatre variantes prévues d'épissage selon la base de données de NCBI. Il a été rapporté qu'il est exprimé dans le système nerveux central (SNC) des stades d'abeille pupal et adulte et il est impliqué dans la formation de mémoire à long terme5. Les anticorps développés contre le mGlutR1 peuvent être un outil essentiel pour l'étude du système glutamatergique dans le processus d'apprentissage et de mémoire chez les abeilles.
Dans nos études, nous avons également caractérisé les anticorps anti-RDL développés chez les lapins immunisés avec des peptides conjugués de la sous-unité de récepteur apis mellifera RDL. Le gène Del d'abeille, AmRdl (XM_006565102.3, base de données NCBI), a 14 variantes d'épissage prévues. Un fragment partiellement cloné a été signalé dans la base de données NCBI AF094822.1. La fonction des récepteurs RDL et sa physiologie est bien étudiée chez les insectes6,7,8, y compris les abeilles9,10,11. Les anticorps développés contre l'anti-RDL peuvent être un outil essentiel pour étudier le système GABAergic dans le processus d'apprentissage et de mémoire chez les abeilles.
Une étude antérieure sur le rôle des récepteurs d'octopamine et de tyramine a utilisé l'ARNi injecté dans le cerveau avec un test ultérieur de la quantité de protéines par Western blot12,13. Cependant, l'ARNi a des limites importantes. Il n'y a qu'une courte fenêtre de temps après l'injection d'ARNI dans laquelle une réduction de la protéine se produit13. CRISPR-Cas9 a été utilisé très récemment dans les embryons d'abeilles mellifères pour supprimer ou modifier les gènes de l'ensemble de l'animal14,15,16. Nous avons signalé l'utilisation de CRISPR-Cas9 pour réduire la quantité de protéines dans l'abeille domestique adulte. Nous avons développé cette approche pour les abeilles en raison de la capacité de le coupler à des études comportementales de l'apprentissage et la mémoire dans des conditions de laboratoirecontrôlées 17.
Dans le présent travail, nous avons développé des anticorps contre deux récepteurs et les avons testés sur les sections adultes du cerveau des abeilles domestiques après que la protéine a été réduite par injection CRISPR-Cas9. Dans le même temps, nous avons établi une conception expérimentale qui permet l'utilisation de la méthode pour des expériences comportementales.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td> western <td>blot</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>western blot</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>utilisé avec de l’eau distillée pour fixer le cerveau de l’abeille mellifère dans les blocs</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Laboratoires de recherche</td><td>711-546-152</td> anticorps <td>secondaire pour révéler les anticorps primaires du</td></tr><tr><td>lapin Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>avec l’ARN guide désingéré, il crée l’ARNg</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 nucléase V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>enzyme utilisée pour fabriquer la ribonucléoprotéine pour le système CRISPR</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-mGlutR1</td><td>Covalab (FRANCE)/21st Century Biochimique</td><td>caractérisé par les auteurs dans le présent article</td><td>Utilisé pour l’incubation primaire de mGlut 1 chez les abeilles</td></tr><tr><td>Anticorps anti-RDL</td><td>21st Century Biochemical</td><td>caractérisé par les auteurs dans le présent article</td><td>Utilisé pour l’incubation primaire des RDL chez les abeilles</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Barraquer Ciseaux à iris Lame de 7 mm Pointe pointue</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>utilisé pour la dissection cerveau d’abeille mellifère</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Lame (cassable) pour porte-lame</td><td>Outil de science fine</td><td>10050-00</td><td>dissection pour western blot</td></tr><tr><td>Porte-lame et briseur</td><td>Outil de science fine</td><td>15309</td><td>dissection pour transfert western</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>pour procédure d’injection</td></tr><tr><td>Substrat de détection par western blot chimiluminescent</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>western blot</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>western blot</td></tr><tr><td>DNA easy kit</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Extraction d’ADNUJ</td></tr><tr><td>Kit sans ADN</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Utilisé pour prélever l’ADN</td></tr><tr><td>Pipette Eppendorf Research plus, paquet de 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 puits Polystyrène Multiwell Falcon</td><td></td><td>351147</td><td>Multiwell</td></tr><tr><td>Capsules d’enrobage à fond plat Multiwell, Microscopie électronique en polyéthylène</td><td> Science</td><td>70021</td><td>panier pour sections de cerveau</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5 (paire)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td><td>pour la dissection du cerveau d’abeille mellifère de la tête</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5S (paire)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td><td>pour nettoyer le cerveau de la trachée avant la dissection</td></tr><tr><td>Gene Expression Master Mix</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1055770</td><td>qPCR drop off assay</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>utilisé pour la préparation de conjugués peptidiques pour le contrôle de la péabsorption</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td> western <td>blot, milieu d’enrobage</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blot</td></tr><tr><td>Hydrophobe Nylon filtré Spectrum</td><td>Labs</td><td>145910</td><td>pour le fond du panier pour les sections de cerveau</td></tr><tr><td>Isopropyle alcool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Trou de serrure limpet hémocyanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>utilisé pour la préparation de conjugués pour le</td></tr><tr><td>contrôle LSM800 microscope cofocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>conçu ARN guide pour CRISPR-Cas 9. Ciblez les séquences génomiques de mGlutR1</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td> ARN guides conçus par <td>IDT</td><td></td><td>pour CRISPR-Cas 9. Ciblez les séquences du génome mGlutR1</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td> ARN guides conçus par <td>IDT</td><td></td><td>pour CRISPR. Séquences du génome cible mGlutR1</td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>western blot</td></tr><tr><td>Microplaque PCR 96 puits</td><td>Biosystème appliqué</td><td>4346907</td><td>test de chute qPCR et qRT-PCR</td></tr><tr><td>Microplaque PCR 384 puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>pour procédure d’injection</td></tr><tr><td>Modèle p87 Extracteur de micropipette brun flamboyant</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Préparation capillaire</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>pour solution d’enrobage</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000</td> World Precision Instruments <td>Appareil d’injection</td><td>Nanoliter</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Research Laboratories</td> AB_2337258 <td>agent bloquant pour l’immunocytochimie</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre non immunitaire</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>agent bloquant pour l’immunobuvardage</td></tr><tr><td>Tampon sans nucléases</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Tampon sans nucléases utilisé dans la préparation de l’injection CRISPR-Cas9</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>Eau sans nucléases utilisée dans la préparation du système CRISPR-Cas 9</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>utilisé avec du PBS pour fabriquer un fixateur pour le cerveau des abeilles</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>Inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Tampon de phosphate Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Utilisé avec le paraformaldéhyde comme fixateur ; tampon pour les anticorps</td></tr></tbody></table>

anti-rdl et anti-mglutr1 récepteurs test des anticorps dans les sections du cerveau des abeilles à l'aide de crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) est une technique d'édition génétique largement utilisée dans les études de la fonction génique. Nous utilisons cette méthode dans cette étude pour vérifier la spécificité des anticorps développés contre l'insecte GABAA récepteur sous-unité Résistance à la Dieldrin (RDL) et un récepteur du glutamate métabotropique mGlutR1 (mGluRA). Les anticorps ont été générés chez les lapins contre les peptides conjugués spécifiques aux mouches des fruits (Drosophila melanogaster) ainsi qu'aux abeilles domestiques (Apis mellifera). Nous avons utilisé ces anticorps dans les sections du cerveau des abeilles mellifères pour étudier la distribution des récepteurs dans le cerveau des abeilles mellifères. Les anticorps ont été purifiés d'affinité contre le peptide et examinés avec l'immunoblotting et la méthode classique de preadsorption avec des conjugués de peptide pour montrer que les anticorps sont spécifiques aux conjugués correspondants de peptide contre lesquels ils ont été soulevés. Ici, nous avons développé la technique CRISPR-Cas9 pour tester la réduction des cibles protéiques dans le cerveau 48 h après l'injection CRISPR-Cas9 avec guide ARN conçus pour le récepteur correspondant. La méthode CRISPR-Cas9 peut également être utilisée dans les analyses comportementales chez les abeilles adultes lorsqu'un ou plusieurs gènes doivent être modifiés.

Tests d'anticorps anti-RDL Les anticorps ont été produits contre les conjugués de peptides RDL comme le montre la figure 1A. La première étape dans la caractérisation des anticorps anti-RDL est de vérifier l'homogénéisation de la protéine extraite du cerveau des abeilles à l'aide d'une tache occidentale avec des anticorps anti-RDL et un anticorps secondaire igG de chèvre étiqueté HRP(figure 1A, insert). Les deux anticorps anti-RDL reconnaissaient la bande située à 50-60 kD (flèche), correspondant au poids estimé des protéines isoformes sous-uniformes de RDL. Pour démontrer que les anticorps anti-RDL reconnaissaient le peptide dans les tranches de cerveau, nous avons utilisé un contrôle de la preadsorption (Figure 1B,C). Quand les anticorps ont été préincubtés avec les peptides conjugués, la coloration sur la section était absente. Ceci a démontré que les anticorps anti-RDL ont reconnu le peptide conjugué contre lequel ils ont été soulevés. Afin de démontrer que les anticorps anti-RDL reconnaissent la protéine dans le tissu cérébral fixe, nous avons utilisé CRISPR-Cas9 pour assommer le gène RDL qui produit la protéine RDL dans les cellules. Figure 1D1-3, montre les sections de cerveau frontal d'abeille de contrôle qui ont été étiquetées avec des anticorps anti-RDL. Cette abeille n'a pas été injectée avec RDL-CRISPR-Cas9 RNP. Dans la figure 1D1, l'anti-RDL étiquette les neuropils dans la section frontale du cerveau des abeilles. La même section frontale de la figure 1D2 montre l'absence de fluorescence de l'ATTO550, parce que le complexe RDL-CRISPR-Cas9 n'a pas été injecté.
Figure 1E1-E3 montre une section du cerveau d'une abeille injectée avec RDL-CRISPR-Cas 9, puis traitée avec la même quantité d'anticorps que le cerveau témoin dans la figure 1D1-D3. La coloration anti-RDL a été significativement réduite dans l'ensemble du cerveau 48 h après l'injection, et la distribution de la coloration ATTO550 dans le cerveau (Figure 1E2) montre le succès des injections RDL-CRISPR-Cas 9 dans l'ocelli médian d'abeille. Les cellules dispersées multiples du cerveau montrent ATTO550. L'injection réussie de RDL-CRISPR-Cas 9 a réduit l'expression des protéines par rapport au contrôle (Figure 1E1-3). De huit cerveaux immunosifiés d'abeille, seulement un cerveau a eu un niveau élevé de distribution du RDL-CRISPR-Cas9 dans les cellules du corps de champignon, du protocerebrum, et du lobe d'antenne, alors que d'autres cerveaux ont eu la coloration de cellules avec ATTO550 dans le calice de corps de champignon, complexe central, mais pas lobe d'antenne. Il est important de noter que chez ces abeilles, la réduction de l'immunostaining anti-RDL n'était pas aussi dramatique que dans le cerveau montré dans la figure 1E1.
Ensuite, pour estimer le niveau de l'ADNc RDL modifié chez les abeilles 48 h après l'injection RDL-CRISPR-Cas9, nous avons effectué un test de dépôt qPCR, où la sonde de dépôt a été conçue pour correspondre à la zone de l'un des gRNAs RDL. Dans ces expériences, dans les cerveaux d'abeilles injectés avec RDL-CRISPR-Cas 9, la réduction relative de la fluorescence correspondait au nombre de l'Adn gané modifié dans les échantillons. Dans nos tests, la zone correspondant à ce guide en gDNA chez 12 abeilles injectées avec RDL-CRISPR-Cas9 était de 64 % (moyenne de 30 % SD) par rapport à l'ADNc chez les abeilles non injectées(figure 3A).
Ensuite, pour estimer le niveau de l'ARN RDL chez les abeilles 48 h après l'injection, nous avons effectué qRT-PCR dans un groupe distinct d'abeilles (Figure 3B). Nous avons comparé le niveau d'ARN RDL des abeilles injectées RDL-CRISPR-Cas 9 (n - 19) avec le niveau d'ARN chez les abeilles qui n'ont pas été injectées (n - 12). Dans ces expériences, la réduction relative de l'ARNm RDL était de 59 % (moyenne de 15 % DE SE) par rapport au niveau d'ARN chez les abeilles non injectées. Quand nous avons examiné le niveau de RDL RNA dans chaque abeille individuellement, seulement 13 abeilles sur 19 abeilles ont montré une réduction significative de l'ARN. Ces données indiquent que l'injection de RDL-CRISPR-Cas9 par l'ocelli pourrait ne pas toujours atteindre un grand nombre de cellules du cerveau, ce qui confirme les données avec RDL souillé souillant D'autres abeilles injectées RDL-CRISPR-Cas9. Dans ces préparations, une seule abeille sur 8 avait RDL CRISP-Cas9 dans de nombreuses cellules du cerveau (corps de champignon, protocerebrum, et lobe d'antenne) par rapport à d'autres cerveaux d'abeille, où la distribution du RDL-CRISPR-Cas9 a été concentrée dans les cellules dans le protocerebrum (champignon du corps calyx et complexe central) mais pas le lobe d'antenne (Figure 4A-D).
Tests d'anticorps anti-mGlutR1 Nous avons utilisé les anticorps anti-mGlutR1 produits chez le lapin contre les peptides conjugués spécifiques au melanogaster Drosophila (Figure 2A). La séquence de ce peptide montre une identité de 94% avec le peptide d'abeille (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figure 2A. Tout d'abord, nous avons vérifié les anticorps contre la protéine du cerveau des abeilles à l'aide d'immunoblotting. L'homogénéisme de cerveau d'abeille a été séparé par 10% SDS-PAGE et électrophorétiquement transféré d'à une membrane de nitrocellulose et souillé avec anti-mGlutR1. L'encart de la figure 2A montre deux bandes dont le poids est estimé (103 et 83 kD) correspondant à deux isoformes. Lorsque nous avons testé cet anticorps sur les cerveaux d'abeilles mellifères, nous avons constaté qu'ils étiquetent les profils neuropilaires et les cellules dans les sections du cerveau des abeilles comme illustré dans la figure 2B,D. Après la prépréorption de l'anticorps anti-mGlutR1 avec le peptide conjugué-mGlutR1, la coloration spécifique a disparu dans la tranche de cerveau d'abeille (figure 2C). Cela confirme que les anticorps anti-mGlutR1 reconnaissent le peptide (figure 2C). Ensuite, nous avons injecté un mélange de mGlutR1-CRISPR-Cas9 dans l'ocelli médian et utilisé le contrôle noguideRNA. Chez les abeilles témoins (n - 7), la fluorescence d'ATTO550 n'était pas concentrée dans les cellules. Certains cerveaux avaient la fluorescence dispersée ATTO550 étiquetage. Ainsi, la préparation de contrôle dans la figure 2D1-3 montre la coloration anti-mGlutR1 dans le cerveau, mais pas la fluorescence ATTO550. Lorsque le mGlutR1-CRISPR-Cas9 a été injecté dans l'ocelli et repris par de nombreuses cellules, le niveau de fluorescence des anticorps secondaires a été considérablement réduit dans la zone qui recèle le mGlutR1RNP fonctionnel(figure 2E1-3). Les abeilles ont été surveillées pendant 48 h, et une abeille de chaque condition expérimentale a été trouvée morte. Ainsi, dans cette expérience, nous avons vérifié sept abeilles témoins et huit abeilles CRISPR-Cas9. Toutes les abeilles injectées avec CRISPR-Cas9 avaient des cellules qui ont pris en mGlutR1-CRISPR-Cas9. La plupart de ces cellules étaient dans le calice de corps de champignon, complexe central, et protocerebrum postérieur. Seulement deux abeilles sur sept ont montré l'étiquetage ATTO550 dans beaucoup de cellules dans le corps de champignon, complexe central, et le lobe d'antenne. Un exemple de l'une de ces abeilles est illustré dans la figure 2E. La réduction du niveau de coloration mGlutR1 dans ces préparations était significative. Les cinq autres abeilles ont l'étiquetage ATTO550 correspondant à la livraison réussie du mGlutR1 CRISPR-Cas9 dans le corps des champignons et le protocerebrum postérieur, mais pas dans les lobes d'antenne.
Ensuite, pour estimer le niveau de l'ADNnm mGlutR1 modifié chez les abeilles 48 h après l'injection, nous avons effectué un test de débarquement à base de qPCR, où la sonde de débarquement a été conçue pour se siévisser dans la zone proche du guide mGlutR1. Dans ces expériences, dans les cerveaux d'abeilles injectés avec mGlutR1-CRISPR-Cas 9, la modification relative de l'ADNc chez 12 abeilles était de 59 % (moyenne de 33 % SD) comparativement à l'ADNc chez les abeilles non injectées(figure 3A).
Ces résultats ont également été confirmés par des tests qRT-PCR dans un groupe différent d'abeilles, où nous avons estimé les niveaux d'ARN mGlutR1 en utilisant qRT-PCR chez les abeilles 48 h après injections avec RNPmGlutR1mix (Figure 3B). Nous avons comparé le niveau d'ARN mGlutR1 des abeilles injectées par mGlutR1-CRISPR-Cas9 (n - 6) avec les niveaux d'ARN chez les abeilles qui n'ont pas été injectées (n - 6). Dans ces expériences, la réduction relative de l'ARNmGlutR1 chez les abeilles injectées était de 53 % (moyenne de 18 % SE) par rapport aux abeilles non injectées(figure 3B).
La section de quatre abeilles différentes qui a exprimé le RNP RDL-CRISPR-Cas9 dans la cellule De Kenyon du corps de champignon est montrée dans la figure 4A-D. L'exemple d'abeille avec la fluorescence ATTO550 dans le corps des champignons et le lobe d'antenne est montré dans la figure 4E,F.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Guides</td>
			<td>Séquences</td>
			<td>gRNA (en)</td>
			<td>Rnp</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuclease]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGACCCCCGCT</td>
			<td>GRDL1 (en)</td>
			<td>RRDL1 (en anglais seulement)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2 (en)</td>
			<td>RRDL2 (en anglais seulement)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3 (en)</td>
			<td>RRDL3 (en anglais seulement)</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAGTTATCTGACGGTGTGTGT</td>
			<td>GMGL1 GMGL1 GMGL1</td>
			<td>RMGL1 (en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCATTCAT TTCAACGagaGCAAGTTCATTCAT TTCAACGagaGCAAGT</td>
			<td>GMGL2 GMGL2 GMGL2</td>
			<td>RMGL2 RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3 GMGL3</td>
			<td>RMGL3 RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Séquences de guides nucléotides conçus pour RDL et mGlutR1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> Figure 1 : Caractérisation des anticorps anti-RDL. (A) Schématique de la sous-unité RDL, où les cercles roses indiquent la localisation du peptide 2 (extracellulaire CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amide) dans le N-terminus et le peptide 1 (intracellulaire CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amide) dans le C-terminus. L'encart dans A montre les bandes dans la tache occidentale des extraits de cerveau d'abeille de miel traités avec les anticorps anti-RDL correspondants (un avec le pep1 anti-RDL et le pep2 d'anti-RDL). Chaque immunoblot montre la taille apparente de la protéine de 50 à 60 kD, correspondant aux poids estimés des différents isoformes des sous-unités RDL. (B,C) Preadsorption des anticorps anti-RDL avec le peptide conjugué 1. L'image en C montre une réduction de la coloration dans la section lorsque les anticorps ont été préincubtés avec du peptide conjugué 1. Le corps en forme de ventilateur (Fb) et le corps ellipsoïde (eb) sont des structures complexes centrales dans le cerveau. M - lobe médial du corps de champignon. (D1-3) La coloration anti-RDL d'un contrôle, section non injectée de cerveau d'abeille après 48 h. Vert indique le profil positif d'anti-RDL dans le cerveau. (D2) Cette abeille n'a pas été injectée et ne contient pas de fluorescence ATTO550. (D3) Images fusionnées de D1 et D3. (E1-3) L'injection de RDL-CRISPR-Cas9 a réduit la coloration anti-RDL après 48 h. (E2) LA fluorescence ATTO550 dans les noyaux cellulaires a indiqué la livraison réussie de RDL-CRISPR-Cas9. (E3) L'image fusionnée de l'anti-RDL (vert) et ATTO550 (rouge). Barre d'échelle de 100 m (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> Figure 2 : Caractérisation des anticorps anti-mGlutR1. (A) Schématique de GCPR mGluR qui montre le peptide de melanogaster de Drosophila utilisé pour la vaccination. À titre de comparaison, le peptide Apis mellifera est montré ci-dessous. Le cercle indique la localisation du peptide dans le terminus N du domaine extracellulaire du récepteur mGlutR1. L'encart dans A montre que les anticorps anti-mGlutR1 ont reconnu deux bandes dans la tache occidentale des cerveaux d'abeille 103 kD et 83 kD qui correspondent aux poids estimés des isoformes connus. (B,C) Contrôle de preadsorption de l'anticorps anti-mGlutR1 dans deux sections consécutives du lobe d'antenne glomeruli. L'image de l'anti-mGlutR1 dans la section glomeruli d'antenne en C montre la réduction de la coloration en raison de la préincubation du peptide anti-mGlutR1 avec l'anticorps anti-mGlutR1. Cette procédure provoque l'anticorps de précipiter hors de la solution, ce qui abolit la coloration par rapport à B (contrôle, absence du peptide dans la préincubation). (D1) montre la coloration de l'anti-mGlutR1 dans une tranche de cerveau d'abeille après une injection de contrôle dans l'ocellus médian. Cette injection manquait le gRNA mGlutR1 qui permet de faire tomber les récepteurs mGlutR1 par CRISPR-Cas9, et donc la coloration de l'anticorps anti-mGlutR1 n'a pas été réduite (vert). (D2) L'absence de fluorescence ATTO550 indique l'absence de CRISPR-Cas9 fonctionnel dans le cerveau. (D3) Images fusionnées d'anti-mGlutR1 et ATTO550. (E1-E3) montrer la coloration de l'anti-mGlutR1 dans une section du cerveau où mGlutR1 a été définitivement renversé 48 h après injection avec mGlutR1-CRISPR-Cas 9 dans l'ocellus médian. Ainsi, la coloration dans ce cerveau est considérablement réduite en raison du knock-out réussi du mGlutR1 dans de nombreuses cellules. (E2) ATTO550 coloration dans de nombreux noyaux cellulaires dans le cerveau des abeilles indique que l'injection de mGlut1-CRISPR-Cas 9 a été un succès. (E3) Image fusionnée d'ATTO550 (rouge) et anti-mGlutR1 (vert). Barre d'échelle de 10 m (B,C); 100 m (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> Figure 3 : Évaluation de l'AIndn modifié et expression de l'ARNm de RDL et de mGlutR1 dans les cerveaux d'abeille 48 h après injection avec 345 nL de RPN CRISPR-Cas9 correspondant. (A) Le test d'essai de chute basé sur qPCR pour évaluer la quantité d'ADNc avec une zone de modification a été calculé à l'aide de la méthode 2-Ct et normalisé contre le contrôle, les cerveaux non injectés. Les données sont exprimées comme étant moyennes - SD. (B) Le test TheqRT-PCR a été utilisé pour évaluer la quantité d'ARNm dans les abeilles injectées et non injectées crispR-Cas9. AmActin a été utilisé comme gène de référence. L'expression relative du gène a été calculée à l'aide de 2 méthodes dect et normalisée contre le contrôle, les cerveaux non injectés. Les données sont exprimées comme moyen - SE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> Figure 4 : Exemple de distribution de RNP CRISPR-Cas9 dans le cerveau des abeilles par fluorescence ATTO550. (A-D) Les sections de cerveau de quatre abeilles différentes qui ont exprimé le RDL-CRISPR-Cas9 de RNP dans la cellule de Kenyon du corps de champignon. (E,F) Exemple de deux cerveaux 48 h après injection avec RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Barre d'échelle de 150 m (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Présenté ici est un protocole pour utiliser le système CRISPR-Cas9 pour réduire la production d'une protéine dans le cerveau adulte d'abeille de miel pour tester la spécificité d'anticorps.

Anti-RDL et Anti-mGlutR1 Récepteurs Test des anticorps dans les sections du cerveau des abeilles à l'aide de CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Pour la première fois, nous avons établi une modification des gènes codés pour gabaa ionotropique et récepteurs de glutamate metabotropic dans les sous-ensembles de neurones dans le cerveau adulte abeille mellifeutique. L’édition des gènes CRISPR-Cas9 peut être utilisée pour modifier un ou plusieurs gènes dans le cerveau des abeilles adultes afin d’explorer leur rôle dans l’apprentissage et la mémoire dans des conditions de laboratoire contrôlées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la fonction de protéines spécifiques chez les abeilles adultes, ainsi que pour tester la spécificité des anticorps contre leurs protéines correspondantes.Lev Kurtzman et Hyun Choi, anciens étudiants de premier cycle de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Irina Sinakevitch. Pour tester l’expression de RDL et mGlutR1 par analyse immunocytochimique après l’injection CRISPR-Cas9, d’abord, utilisez un outil CRISPR-Cas9 en ligne pour concevoir les guides à l’aide de la séquence d’ADN guide d’apis mellifera, RDL et mGlutR1. Pour préparer les formations complexes d’ARN guide pour chaque ARN guide, étiquetez un tube à essai pour chaque guide avec le nom de l’ARN guide, et ajoutez 92 microlitres de tampon sans nucléotide, quatre microlitres de 100 fluorophore micromolaire, étiquetés transactivant l’ARN CRISPR, et quatre microlitres de la solution d’ARN guide appropriée à chaque tube.Lorsque tous les matériaux ont été ajoutés, mélanger les solutions doucement et faire tourner le contenu du tube dans une centrifugeuse de banc pendant cinq secondes pour sédimenter la solution. Ensuite, gardez les solutions à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour créer un complexe d’ARN guide suivi d’un refroidissement de 10 minutes à température ambiante. Pour préparer les formations complexes de ribonucléoprotéine ajouter six microlitres de chaque solution d’ARN de guide et six microlitres de 0,5 microgrammes par microlitre SP-Cas9 nucléase V3 aux tubes correctement étiquetés.Après un mélange doux, incuber les solutions à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes Pour faire des mélanges de ribonucléoprotéine RNP pour injection, à la fin de l’incubation ajouter quatre microlitres de chaque ribonucléoprotéine à la RDL appropriée. Pour effectuer un contrôle, la solution ARN sans guide mélange quatre microlitres d’ARN traceur avec 92 microlitres de tampon et quatre microlitres d’eau. Après l’ajout d’eau, garder la solution pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius et laisser refroidir le mélange jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante.Ensuite, mélangez six microlitres de la solution arn sans guide avec six microlitres de 0,5 microgramme par microlitre Cas9 nucléase V3. Pour l’injection de mélange de ribonucléoprotéines, après avoir capturé des abeilles individuelles dans des flacons avec un petit trou dans les bouchons, immobiliser les abeilles pendant pas plus de trois minutes sur la glace et fixer chaque abeille dans des supports métalliques préalablement préparés avec du ruban adhésif. Avec le thorax arrière, les ailes et la tête exposées. Utilisez une seringue de cinq millilitres pour nourrir les abeilles avec une solution de saccharose molaire jusqu’à ce qu’elles n’ont plus faim, et placez les abeilles sécurisées dans une boîte avec une serviette en papier humide pour l’humidité.Ensuite, placez de la cire à l’intérieur des couvercles de deux boîtes de Pétri de 35 millilitres et placez le fond des plats sur la cire. Injectez un saccharose molaire entre le couvercle et le fond de chaque plat, et placez une boîte de Pétri d’alimentation dans la boîte blanche avec une glissière en verre et placez l’autre dans la boîte noire avec une glissière en verre. Ensuite, placez un petit peigne dans chaque boîte et chargez un système de microinjection avec le mélange RDL CRISPR-Cas9.Pour l’injection RDL CRISPR-Cas9, injecter les ocelli médianes de huit abeilles avec 345 nanolitres de ribonucléoprotéine RDL mélange suivi de l’alimentation avec un saccharose molaire avant de libérer les abeilles dans la boîte expérimentale noire. Nourrissez un deuxième ensemble de huit abeilles sous forme de commandes sans injections et relâchez-les dans la boîte de contrôle blanche. Ensuite, placez les deux boîtes dans un récipient en polystyrène avec du papier humide, en observant les abeilles deux fois par jour pour s’assurer qu’elles ont suffisamment de nourriture et une bonne humidité.48 heures après l’injection, immobiliser les abeilles sur la glace pendant 30 secondes et utiliser des ciseaux pour décapiter chaque insecte. Placez les têtes dans le paraformaldéhyde de 4% dans PBS sous un microscope disséquant dans un capot de fumée, et utilisez des ciseaux d’iris barraquer pour enlever soigneusement mais rapidement les antennes, les yeux composés, et l’exosquelette supérieur. Laissez les têtes s’asseoir dans la solution fixative pendant 10 minutes avant d’enlever le reste du squelette exo de la tête et toute la trachée restante.Ensuite, placez chaque cerveau dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant au moins un millilitre de 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit à quatre à huit degrés Celsius. Le lendemain matin, ajouter 3,8 grammes d’argrose à 50 millilitres d’eau distillée dans un flacon erlenmeyer et cuire au micro-ondes la solution jusqu’à ce que l’argrose liquéfie. Transférer trois à quatre cerveaux fixes d’abeilles mellifeuaux dans une nouvelle boîte de Pétri de 35 millimètres et utiliser du papier de soie pour éliminer l’excès fixatif.Versez soigneusement l’argrose liquide sur le cerveau et orientez les échantillons dans l’argrose de sorte que les lobes des antennes soient orientés vers le haut. Une fois que l’argrose s’est solidifiée, utilisez un scalpel pour découper des blocs individuels d’argrose contenant un seul cerveau et remplir chaque puits d’une plaque de 24 puits chargée d’un panier avec un fond de maille hydrophobe et 600 microlitres de PBS par puits. Ensuite, utilisez un vibratome pour acquérir des sections transversales de 70 micromètres du tissu cérébral à partir de chaque bloc argrose.Placer les sections d’un seul cerveau sur la maille du même panier qu’elles sont acquises. Après avoir étiqueté les sections avec des anticorps conjugués au fluorophore, selon les protocoles standard, intégrer chaque diapositive avec des sections d’un seul cerveau à l’aide d’une goutte de milieu de montage et visualiser les échantillons par microscopie de fluorescence. Anti-RDL étiquettes neuropils dans la section frontale de type sauvage, mais pas CRISPR-Cas9 RDL knockout cerveaux d’abeille.Une spécificité similaire a été observée pour les anticorps anti-mGlutR1. Dans ces tests de chute de PCR quantitatifs dans les cerveaux d’abeilles injectés avec RDL CRIPSR-Cas9, la réduction relative de la fluorésence correspondait au nombre de l’ADN guide modifié dans l’échantillon. Après l’injection de CRISPR-Cas9 mGlutR1, la modification relative de l’ADN du guide était d’environ 59 % dans le cerveau des abeilles injectées par rapport à l’ADN guide observé dans le cerveau des abeilles non injectées.Dans ce groupe quantitatif rt-PCR ina distinct d’abeilles, la réduction relative de l’ARN rdl d’ARN messager était approximativement 59% comparée au niveau d’ARN dans les abeilles non injectées, et la réduction relative de l’ARN mGlutR1 messager dans les abeilles injectées était approximativement 53%Notamment, l’injection de RDL CRISPR-Cas9 par l’ocelli pourrait ne pas toujours atteindre un grand nombre de cellules de cerveau. Par exemple, dans ces préparations, seulement un être sur huit avait RDL CRISPR-Cas9 dans un grand nombre de cellules cérébrales par rapport à d’autres cerveaux d’abeille. Avec le RDL CRISPR-Cas9 concentré dans les cellules du protocerebrum, mais pas le lobe antennel.Assurez-vous d’éviter l’ARN congelé et recongelé. Prenez soin de ne pas trop rééquiper les abeilles. Harnais-les immédiatement une fois que l’arrêt se déplace dans le flacon.Cette technique peut être utilisée pour étudier les effets de la réduction des récepteurs ionotropiques et metabotropes inhibiteurs dans le corps des champignons et le complexe central sur le comportement des abeilles mellifères.

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