Test de diagnostic immunochromatographique rapide sur le terrain postmortem pour les paramètres limités par les ressources avec d’autres applications moléculaires

Ce protocole peut être utilisé pour le diagnostic post mortem de la rage animale de la vue initiale de la diction sur le terrain à la conformation moléculaire dans un niveau centralisé d’activité. L’essai rapide de diagnostic immunochromatographic est une alternative utile pour des traits ruraux et ruraux en Afrique et en Asie dans lesquels les matériaux de référence pour le diagnostic de rage ne sont pas disponibles. Simon Bonas, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.

Ibrahima Dicko, technicion du Laboratoire Central Veterinaire de Bamako au Mali, fera la démonstration de la première partie de la procédure. Pour accéder au magnum foramen, utilisez un couteau pour enlever la tête de l’animal avant les premières vertèbres cervicales. Et utilisez un outil approprié pour recueillir un échantillon de tige cérébrale.

Comme une pipette jetable, boire de la paille, pince, ou dropper comme indiqué ici. Le tronc cérébral est alors clairement visible comme démontré ici avec la pointe de cette pipette. Utilisez un outil approprié pour recueillir une partie de ce tronc cérébral comme une paille potable.

Insérez-le soigneusement et tournez doucement pour recueillir le tissu cérébral. N’oubliez pas de brancher la paille avec votre doigt avant de l’enlever, afin de recueillir la biopsie. L’utilisation d’une pince est également possible.

Afin de recueillir de plus gros morceaux de tronc cérébral au niveau du magnum foramen. Alternativement, il est possible d’utiliser directement le dropper fourni dans le kit pour recueillir le tronc cérébral. De même que la paille à boire, insérez soigneusement le dropper tout en appuyant et tournez doucement pour recueillir le tissu cérébral.

Ensuite, aspirez le tissu cérébral et placez-le dans un récipient comme le bouchon d’un tube. Pour un diagnostic précis, il est essentiel de recueillir le tronc cérébral qui contient la medulla ablongata, au cours de la collecte de l’échantillon. Écraser soigneusement le matériau cérébral directement dans le tube contenant le tampon avec l’écouvillon ou le dropper pendant environ 30 secondes jusqu’à ce qu’une suspension homogène soit obtenue.

À l’aide du dropper, déposer quatre gouttes d’environ 100 microlitres de la suspension dans l’entrée de l’échantillon sur le dispositif d’essai. En cas de retard dû à une suspension de viscosité élevée ou pour accélérer le début de la migration, grattez doucement le fond du site de dépôt de l’appareil avec le dropper. Attendez la migration complète de l’échantillon, une à cinq minutes avant de lire le dispositif de test.

Un échantillon est considéré comme positif à la rage lorsque deux lignées sont visibles. Négatif, si seulement la ligne de contrôle est présente. Et invalide si seulement la ligne de test ou pas de lignes sont visibles.

Pour extraire l’ARN d’un échantillon d’appareil, ouvrez soigneusement l’appareil et retirez le papier filtre. Recueillir la zone de dépôt de l’échantillon et placer l’échantillon dans un millilitre de trireagent LS. Après une heure à température ambiante avec agitation manuelle douce régulière, extraire l’ARN des tubes supernatants selon les protocoles standard d’extraction de l’ARN. Ajout de deux microlitres de glycogène pour faciliter les précipitations d’ARN selon les recommandations des fabricants.

Réglez le volume final de la résuspension de l’ARN à 50 microlitres avec de l’eau sans nucléase. Et préparer la solution de réaction de mix master pour les trois différents tests PCR quantitatifs transcriptase inverse selon le tableau. Utilisation des amorces et des sondes comme indiqué dans le tableau.

À cinq microlitres des échantillons dilués d’ARN. Et 15 microlitres de master mix à chacun des trois tests différents en double dans les 96 plaques de réaction de puits appropriées. Ajoutez les contrôles positifs et négatifs appropriés pour chaque analyse à chaque plaque en double.

Ensuite, exécutez les différents analyses suivant les conditions de cycle thermique comme indiqué dans le tableau. Les résultats peuvent être analysés tels qu’ils sont décrits dans le tableau. La collecte d’une biopsie du cerveau est aussi simple que possible pour garantir la collecte d’échantillons de haute qualité.

Par rapport à la technique de référence, la sensibilité et la spécificité du test diagnostique immunochromatographic rapide étaient élevées dans tous les laboratoires utilisant ces protocoles. Basé sur le nombre cumulatif d’échantillons testés, la sensibilité et la spécificité globales étaient plus de 95%Le test diagnostique immunochromatographic rapide est approprié pour détecter le lisavirus dans les biopsies de cerveau des animaux infectés. Cependant, comme le niveau d’antigènes à lisavirus est important pour le diagnostic de la rage, la limite de détection demeure élevée lors des tests de suspensions de virus titrées.

Dans ces résultats représentatifs, obtenus après détection d’ARN par double ciblage quantitatif combiné de PCR de transcriptase de transcriptase de transcriptase de la polymérase virale du lisavirus, un panneau de 51 essais diagnostiques immunochromatographic rapides positifs ont été exécutés. En outre, le génotypage pourrait être effectué pour quatorze des échantillons utilisant le ciblage PCR hemi-imbriqué du gène partiel de nucléoprotéine. Diagnostic et extraction de la bande d’essai pour le génotypage basé sur après RT PCR, ou par pour l’analyse supplémentaire des cordes longues.

Le test de diagnostic immunochromatographic rapide peut fournir un diagnostic rapide et précis de rage. Ce qui est crucial pour maintenir la fonction d’onde dans les systèmes continus de surveillance et de contrôle basés sur les ondes. Et minimiser humannnes.