Isolement des sous-ensembles macrophages et des cellules stromales des spécimens myocardiques humains et de souris
17 décembre 2019
Présenté ici est un protocole pour isoler divers sous-ensembles de macrophages et d'autres cellules non immunisées du myocarde humain et de souris en préparant une suspension de cellules simples par la digestion enzymatique. Des schémas de gating pour l'identification et la caractérisation basées sur la cytométrie de flux sont également présentés.
Le cœur contient une population hétérogène de cellules immunitaires qui jouent un rôle crucial dans l’inflammation cardiaque ainsi que la réparation. Afin de comprendre l’hétérogénéité des cellules immunitaires et d’obtenir un meilleur aperçu de leur fonction, il est important d’avoir une méthode qui permettra la récupération de ces cellules du cœur. Cette technique peut aider à découvrir la diversité cellulaire immunitaire ainsi que non immunisée qui réside dans le cœur sain ou maladie.
Cette technique présente trois avantages majeurs. Tout d’abord, il s’agit d’un flux de travail simple qui conduit à la génération de suspension cellulaire unique de différents types de cellules dans les trois heures suivant. Deuxièmement, il conduit à un rétablissement élevé des populations viables de cellules immunitaires et non immunes.
Et troisièmement, c’est une méthode très polyvalente et peut être appliquée sur les tissus cardiaques chez d’autres espèces ainsi. Il est important de prêter attention à la quantité de tissu utilisée pour une seule réaction de digestion. Utilisez des ciseaux stériles, disséquez le spécimen de tissu de la paroi apical ou latérale du ventricule gauche dans la solution saline froide ou HBSS.
Disséquer soigneusement la graisse épicurienne et chordae tendineae du spécimen. À l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux, disséquer les morceaux de tissu en morceaux pesant environ 200 milligrammes. Après avoir euthanasié la souris, ouvrez la cavité thoracique à l’aide de ciseaux pointus.
Utilisez des hémostats contondants pour soulever le cœur vers le haut. Imprènuez le cœur avec du PBS froid à l’aide d’une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue de cinq millilitres. Perfuser jusqu’à ce que le cœur semble blanchi en couleur.
Retirer le cœur et le placer dans une boîte de Pétri stérile sur la glace. Placer 200 milligrammes de tissus cardiaques humains ou de cœur murin dans une boîte de Pétri stérile. Hacher finement le tissu à l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux.
Pour mettre en place des digestions, dans un tube conique de 15 millilitres, préparer un volume de digestion final de trois millilitres pour chaque morceau de tissu cardiaque humain ou un cœur murin avec des enzymes collagène I, DNase I, et hyaluronidase à des concentrations de 450, 60 et 60 unités par millilitre. Ajouter 2,5 millilitres de DMEM dans le tube. À l’aide de forceps propres, placez le tissu finement haché dans chaque tube de réaction.
Bien mélanger par vortex doux. Digérer pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur secouant réglé à une vitesse d’agitation faible à moyenne. Après une heure de digestion, sortir les tubes de l’incubateur et les placer sur la glace.
Installez des tubes coniques de 50 millilitres avec une passoire cellulaire de 40 microns sur le dessus. Mouiller les filtres avec deux millilitres d’enzyme désactivant tampon. Ensuite, désactivez les enzymes de digestion en ajoutant huit millilitres d’enzyme désactivant tampon à chaque tube de digestion.
Versez ensuite les 13 millilitres de mélange total résultant à travers la passoire cellulaire de 40 microns dans les tubes coniques de 50 millilitres. Transférez les échantillons filtrés dans des tubes coniques frais de 15 millilitres. Faites tourner les échantillons à 400 fois g pendant six minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le supernatant en laissant 0,5 millilitres de médias. Resuspendez la pastille cellulaire par pipetting doux et ajoutez un millilitre de tampon de lyse d’ACK. Faites tourbillonner doucement le tube et incubez à température ambiante pendant cinq minutes pour effectuer la lyse des globules rouges.
Après cinq minutes dans le tampon ACK, ajouter neuf millilitres de DMEM à l’échantillon. Remettre le couvercle sur les tubes et inverser délicatement les tubes pour mélanger. Filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 microns et recueillir le filtrate dans des tubes coniques de 15 millilitres.
Centrifuger les tubes à 400 fois g pendant six minutes et jeter le supernatant. Ajouter un millilitre de tampon FACS et resuspendre la pastille. Ensuite, transférez-le dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifugeuse à nouveau à 400 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 100 microlitres de tampon FACS. Une suspension à cellule unique est maintenant prête pour la coloration des anticorps.
Ajouter un panneau d’anticorps humain typique aux échantillons de cœur à une à 50 dilution. Utilisez différents anticorps pour les cellules stromales et les macrophages cardiaques murins. Incuber de 30 à 40 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Ajouter un millilitre de tampon FACS, doucement vortex et centrifugeuse à 400 fois g pendant cinq minutes. Répétez cette étape de lavage une deuxième fois. Puis résuspendez l’échantillon en 350 microlitres de tampon FACS et ajoutez dapi pour atteindre une concentration finale d’un micromolaire.
Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse facs. Dans ce protocole, l’isolement des macrophages de la souris et du myocarde humain a été réalisé. Ce chiffre montre le noyau humain non traité et traité de LVAD.
Le schéma de gating pour le tri de flux des macrophages humains négatifs et CCR2 positifs de CCR2 du myocarde humain aussi bien que pour des cellules stromal négatives de CD45 de la cardiomyopathie ischémique humaine ont été présentés. Les images de Wright taché FACS triés CD45 positif et CD45 cellules négatives montrent membrane cellulaire intacte indiquant la viabilité. Le schéma de gating pour trier les macrophages à partir d’un cœur de souris a également été un succès.
Le poids du tissu utilisé pour la réaction enzymatique est essentiel pour une digestion efficace. N’utilisez pas plus de 200 milligrammes de tissu pour les concentrations enzymatiques indiquées dans le protocole. Suivant cette méthode, les cellules peuvent être cultivés pour des analyses de stimulation in vitro.
Les cellules peuvent être triées pour le séquençage en vrac de l’ARN ou le séquençage à cellule unique. Cette méthode a servi de technique inestimable pour découvrir l’hétérogénéité macrophage précédemment non reconnue qui est présente dans le cœur humain sain ou maladie. En utilisant cette méthode suivie d’un séquençage à cellule unique, des études sont en cours pour découvrir comment diverses cellules immunitaires et non immunisées varient du cœur maladie au cœur sain.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode permettant d'isoler divers sous-ensembles de macrophages et de cellules non immunitaires à partir du myocarde humain et murin. En préparant une suspension unicellulaire par digestion enzymatique, les chercheurs peuvent mieux comprendre l'hétérogénéité des cellules immunitaires dans l'inflammation cardiaque et la réparation tissulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cardiovasculaire
- Immunologie
Contexte
- Le cœur contient une population diversifiée de cellules immunitaires.
- Ces cellules jouent des rôles cruciaux dans l'inflammation cardiaque et la réparation.
- Comprendre leur hétérogénéité est essentiel pour l'étude de la santé cardiaque.
- Cette technique facilite la récupération des cellules immunitaires et non immunitaires du cœur.
Objectif de l'étude
- Isoler et caractériser les macrophages et d'autres types cellulaires provenant du myocarde.
- Mettre en évidence la diversité des cellules immunitaires et non immunitaires dans les cœurs sains et malades.
- Fournir une méthode fiable pour l'étude des réponses immunitaires cardiaques.
Méthodes utilisées
- Digestion enzymatique pour préparer des suspensions uniques de cellules.
- Cytométrie en flux pour l'identification et la caractérisation des cellules.
- Isolation de divers types cellulaires à partir du myocarde humain et murin.
- Protocole simple à réaliser en moins de trois heures.
Résultats principaux
- Fort rendement en populations cellulaires immunitaires et non immunitaires viables.
- Isolation efficace des sous-populations de macrophages.
- Mise en évidence de l'hétérogénéité des cellules immunitaires dans le tissu cardiaque.
- Facilitation de recherches ultérieures sur les mécanismes d'inflammation et de réparation cardiaques.
Conclusions
- Cette technique fournit un outil précieux pour la recherche cardiaque.
- Elle améliore la compréhension des rôles des cellules immunitaires dans la santé cardiaque.
- Des études futures pourront exploiter cette méthode afin d'explorer les maladies cardiaques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Comprendre l'hétérogénéité des macrophages dans le tissu cardiaque est essentiel pour réduire les risques liés à la validation de cibles en découverte de médicaments cardiovasculaires. Ce protocole permet l'isolement reproductible de sous-populations immunitaires et stromales à partir du myocarde humain et murin, soutenant ainsi des études mécanistiques qui éclairent la pertinence des cibles et la priorisation des portefeuilles de recherche. La simplicité de la méthode et son applicabilité trans-espèces renforcent la continuité translationnelle, de la découverte à la validation préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les fonctions des sous-populations de macrophages dans les voies d'inflammation cardiaque et de réparation.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole standardisé pour l'isolement de cellules immunitaires et non immunitaires viables, avec une variation minimale d'un jour à l'autre.
- Valeur stratégique : Soutient la validation ciblée fondée sur des hypothèses en précisant les cellules contribuant aux phénotypes de la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des populations cellulaires purifiées adaptées aux tests fonctionnels et aux applications omiques en aval.
- Valeur opérationnelle : Assure un rendement élevé de cellules viables en moins de trois heures, permettant la standardisation des essais.
- Valeur stratégique : Permet une préparation évolutive de systèmes pertinents pour les maladies, destinés au criblage de composés et aux études d'engagement des cibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la comparaison directe des profils des cellules immunitaires et stromales entre les cœurs humains sains et malades.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec le séquençage de l'ARN en masse et en cellule unique, pour la découverte de biomarqueurs et l'identification mécanistique des facteurs de risque.
- Valeur stratégique : Soutient les décisions d'avancement pondérées par le risque en reliant les phénotypes cellulaires aux états pathologiques à travers les espèces.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles à la recherche préclinique, permettant l'isolement de types cellulaires mécaniquement pertinents pour des analyses fonctionnelles et génomiques.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en isolant des sous-populations définies de macrophages et de cellules stromales.
- Criblage : Produit des suspensions cellulaires standardisées et viables adaptées au développement de tests et au criblage de composés.
- Analytique : Génère des échantillons quantitatifs destinés à la cytométrie en flux, au séquençage et à des lectures fonctionnelles, permettant ainsi l'analyse comparative entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes fondamentales à la continuité préclinique grâce à une applicabilité interspécifique et à l'utilisation d'échantillons pertinents pour la maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour le profilage immunitaire dans divers modèles de maladies cardiovasculaires et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans la pathologie cardiaque immuno-médiée.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et l'extensibilité grâce à un protocole simple et efficace en termes de temps.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en fournissant une détection précoce des risques biologiques associés aux cibles cardiovasculaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque fondée sur des mécanismes cellulaires validés dans des modèles de maladie humaine et murine.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissociation tissulaire enzymatique, en cytométrie en flux et en manipulation stérile des cellules.
- Dépend de l'accès au collagénase I, à la DNase I, à l'hyaluronidase, au tampon de lyse ACK et à des instruments compatibles avec la cytométrie en flux (FACS).
- Exige des protocoles standardisés de dissection tissulaire (par exemple, fragments de 200 mg provenant des régions apicale et latérale du ventricule gauche) afin d'assurer une efficacité de digestion.
- Requiert l'adaptation de panels d'anticorps pour des marqueurs spécifiques aux macrophages et aux cellules stromales selon les espèces (par exemple, CCR2 pour les humains, CD45 pour les souris).
- Est limité par la qualité et la quantité du tissu initial ; des rendements sous-optimaux peuvent survenir avec des échantillons fibrosés ou calcifiés.
