Traitement de l'embryon, de la coquille d'œuf et de la culture fongique pour la microscopie électronique à balayage

Nous avons des protocoles normalisés de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons de tortues peintes, de coquilles d’œufs rigides et de cultures fongiques à l’aide de microscopie électronique à balayage. Ces méthodes complètes utilisent des modifications subtiles aux protocoles connus pour traiter trois tissus délicats permettant la différenciation entre les structures originales et le traitement des artefacts. Jessica Gibbons, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec moi.

Avant de recueillir les œufs de tortues sur un site de champ pendant la saison de nidification, faire de quatre à six trous de 0,25 centimètre le long des côtés des boîtes en plastique et sur leurs couvercles pour permettre l’aération. Avant de remplir les boîtes d’un mélange humide de vermiculite et de mélange de literie de mousse de tourbe à un rapport un pour un. Au site de nidification, retirer délicatement le sol pour découvrir les œufs et essuyer la surface de chaque œuf de tortue avec une teinture diluée d’iode pour se protéger contre la contamination microbienne pendant l’incubation.

Placez un maximum de huit à neuf œufs par boîte dans la même orientation et l’alignement qu’ils ont été pondus, en gardant les couvées individuelles séparées les unes des autres. Lorsque tous les œufs ont été recueillis, enterrer manuellement les œufs à moitié dans la literie et placer les boîtes lidded à l’intérieur d’un incubateur de 30 degrés Celsius pendant 10 à 17 jours pour obtenir des stades embryonnaires 12, 13 et 18 embryons respectivement. Ajouter de l’eau distillée pour mouiller partiellement le milieu de literie tous les deux jours afin d’éviter la déshydratation et pour maintenir le niveau d’humidité pour le développement normal de l’embryon.

Au stade approprié du développement, utiliser des ciseaux pointus pour faire une coupe sur un côté de la coquille d’œuf dorsale et la membrane jaune ensemble, verticale à l’axe long de l’œuf. Ensuite, couper l’autre côté de l’œuf le long de l’axe court, et utiliser des forceps pour peler la pièce excisée avec le côté embryon vers le haut. Couper l’autre côté latéral de la coquille d’œuf et placer le morceau de coquille excisée dans PBS.

À l’aide d’un stéréomicroscope et de forceps, peler l’embryon et la membrane jaune de la coquille d’œuf. Utilisez les forceps et les micro ciseaux pour enlever les membranes embryonnaires supplémentaires, et utilisez une cuillère embryonnaire pour transférer l’embryon dans une boîte de Pétri de PBS frais. Après avoir lavé le sang et le jaune, placer jusqu’à trois embryons par puits d’une plaque de 12 puits, contenant 4% de paraformaldéhyde à quatre degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Lorsque les échantillons semblent blancs, utilisez des inserts en polystyrène avec des fonds en maille de polyester pour rincer les embryons avec trois lavages de cinq minutes en PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, déshydrater les échantillons dans une série ascendante d’éthanol pendant une heure par concentration. Après la deuxième immersion d’éthanol, séchez les embryons dans une série de concentrations de SMDH à des concentrations d’éthanol pendant 20 minutes par immersion avec les boîtes de Pétri partiellement couvertes.

Placez ensuite les embryons dans une solution 100% HMDS finale, complètement ou partiellement recouverte d’une hotte de fumée pendant la nuit. Un séchage lent en augmentant progressivement la concentration de HDMS à l’éthanol est important pour révéler une excellente structure de surface chez les embryons. Le lendemain matin, utilisez du ruban conductrice au carbone à double bâton pour monter soigneusement les échantillons complètement séchés sur un talon d’épingle en aluminium standard.

Lorsque tous les échantillons ont été montés, introduisez les échantillons dans la chambre du revêtement de pulvérisateur pour enrober les spécimens d’une très mince pellicule d’or pendant 60 à 120 secondes à un pulvérisateur de 35 milliamp. Attachez ensuite solidement les vis réglées pour monter les talons sur les plaques de coulée correspondantes. Utilisez l’outil d’échange d’échantillons pour transférer le support de l’échantillon dans la chambre d’échantillon du microscope électronique à balayage pour l’imagerie.

Pour préparer les coquilles d’œufs à la numérisation de la microscopie électronique, placez les coquilles d’œufs dans de l’eau distillée pendant au moins une heure après la récolte de l’embryon afin d’éliminer toute contamination par le jaune ou l’albumine. Ensuite, séchez à l’air les coquilles d’œufs nettoyées sur des lingettes antistatiques délicates dans le capot de fumée pendant la nuit. Conserver les coquilles d’œufs séchées dans des bouteilles propres, étiquetées par nombre et stade embryonnaire.

Puis, monter, pulvériser le pelage et l’image des spécimens coquille d’œuf comme il suffit de le démontrer pour les embryons. Pour établir des cultures fongiques de glissière, utilisez un scalpel stérile pour couper des blocs de moitié à trois quarts de pouce de l’agar solide de dextrose de pomme de terre, et placez les blocs sur les glissières individuelles de microscope en verre. Placez des cure-dents stériles sur le fond des boîtes de Pétri propres pour soulever les toboggans hors d’eux pour créer une tension de surface entre l’assiette et la lame.

Placer chaque toboggan sur les cure-dents dans la boîte de Pétri. Ensuite, utilisez une boucle stérile pour transférer les champignons de l’inoculum du spécimen à chacun des quatre côtés latériaux d’un bloc d’agar. Ajouter quelques gouttes d’eau distillée stérile à la boîte de Pétri autour de la lame pour assurer l’humidité des champignons en croissance.

Sceller partiellement la plaque avec du film de paraffine et placer la plaque dans l’incubateur de 30 degrés Celsius pour la période d’incubation appropriée pour les espèces fongiques. À la fin de l’incubation, retirez la lame de la boîte de Pétri et utilisez des forceps stériles pour transférer le bloc d’agar étroitement adhérent de la glissière à un contenant de 3 % de glutaraldehyde pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, déshydrater les échantillons dans une série ascendante d’éthanol pendant 15 minutes par concentration.

Après l’immersion de 90 %, traiter les échantillons pour la déshydratation finale avec deux changements de 30 minutes dans 100 % d’éthanol afin d’assurer une saturation complète avant de placer les échantillons déshydratés dans la chambre de l’appareil critique de séchage des points. Sceller la chambre et ouvrir les vannes pour permettre au dioxyde de carbone liquide de s’évacuer et de laisser l’éthanol s’évacuer jusqu’à ce que le dioxyde de carbone liquide remplisse complètement la chambre. Ensuite, scellez et chauffez lentement la chambre pour atteindre un point critique quand la pression de la chambre dépasse 1000 livres de pression par pouce carré, la température dépasse 31 degrés Celsius, et l’espace liquide et gazeux de dioxyde de carbone est en équilibre.

Puis drainez lentement le dioxyde de carbone de la chambre et de l’échantillon sous forme de gaz, afin d’éviter tout effet de tension de surface sur l’échantillon, et montez, plaquez et imagez les spécimens fongiques comme démontré. Une vue latérale de micrographe électronique de balayage d’un embryon peint de tortue de stade 12 indique comment la proéminence maxillaire s’étend au-delà du mandibulaire et limite médilement une fosse nasale bien marquée. Cinq arches pharyngéales peuvent également être observées.

Dans un embryon de stade 15, les somites nouvellement formés sont visibles à la région postérieure de la queue de l’embryon, et les bourgeons du membre antérieur pointent plus cortally que ventrally. Une excroissance bien définie d’une crête de carapace peut également être visualisée le long de toute la région du flanc interlimb de l’embryon. À l’étape 18, un museau à faible projet s’est formé avec un bec inférieur légèrement renversé avec un crochet terminal qui s’insère dans l’encoche centrale du bec supérieur.

La mâchoire supérieure présente un aspect cranté, et une petite dent d’œuf peut être vu se former à la pointe de la mâchoire supérieure. L’analyse ultrastructurale de la coquille d’œuf chrysemys picta et de la membrane de la coquille en scannant la microscopie électronique, révèle une couche externe de coquille d’œuf calcarinus, fermement attachée à la membrane intérieure de la coquille filamenteuse. La surface extérieure de la coquille d’œuf se compose d’unités de coquille minéralisées bien distinguées faites de nodules sphériques globulaires disposés en groupes et entre les unités de coquille adjacentes, avec une concentration de petites dépressions arrondies ou de pores de différentes tailles.

Les méthodologies communes ne peuvent pas être généralisées pour que tous les spécimens biologiques atteignent une qualité d’image décente en utilisant sem. Des altérations uniques telles que démontrées sont essentielles pour un type spécifique de tissu. La méthode de séchage chimique et d’air pourrait également être utilisée pour d’autres échantillons organiques, et la technique de culture des toboggans couplage pourrait être utilisée pour toutes les cultures microbiennes douces et robustes.