Name: Système hybride de micropropulsion avec sonde opto-Silicon récupérable et tetrode pour lenregistrement à haute densité de dual-Site dans les souris en mouvement libre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez un système de micropropulsion hybride combinant tétrôdes et sonde opto-silicon récupérable pour l'enregistrement électrophysiologique et la manipulation optogénétique simultanées chez la souris en mouvement libre.

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Ce travail a été soutenu en partie par la Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (HO), Le Programme des boursiers dotés (TK), le Human Frontier Science Program (TK), la Brain Research Foundation (TK), faculty Science and Technology Acquisition et Le Programme de rétention (TK), la Fondation pour la recherche sur le cerveau et le comportement (TK) et la subvention de recherche de la Fondation Sumitomo (JY), la subvention de recherche pour les jeunes chercheurs du NARSAD (JY). Nous remercions W. Marks pour ses précieux commentaires et suggestions lors de la préparation du manuscrit.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole montre comment construire et implanter un réseau hybride de micropropulsion qui permet l'enregistrement des activités neuronales à partir de deux zones du cerveau à l'aide de tétrodes réglables indépendantes et d'une sonde de silicium chez les souris qui se comportent librement. Il démontre également des expériences optogénétiques et la récupération de la sonde de silicium après des expériences. Tandis que la sonde de silicium réglable33 ou l'implantation de sonde d'opto-silicium<sup ...

Il est crucial de comprendre comment l'activité neuronale soutient le processus cognitif, comme l'apprentissage et la mémoire, en étudiant comment différentes régions du cerveau interagissent dynamiquement les unes avec les autres. Pour élucider la dynamique de l'activité neuronale sous-jacente aux tâches cognitives, l'électrophysiologie extracellulaire à grande échelle a été menée chez des animaux en mouvement libre à l'aide de réseaux de micropropulsion s'ilsnesontpasdotés de 2,3, 4. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs types de micropropulsion ont été développés pour implanter des électrodes dans de multiples régions du cerveau pour les rats5,6,7,8 et les souris9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12. Néanmoins, les conceptions actuelles de micropropulsion ne permettent généralement pas l'utilisation de plusieurs types de sondes, ce qui oblige les chercheurs à choisir un seul type d'électrode avec des avantages et des limitations spécifiques. Par exemple, les tableaux de tétrode fonctionnent bien pour les régions du cerveau densément peuplées telles que l'hippocampe dorsal CA11,13, tandis que les sondes de silicium donnent un meilleur profil géométrique pour l'étude des connexions anatomiques14 , 15.
Les tetrodes et les sondes de silicium sont souvent utilisées pour l'enregistrement chronique in vivo, et chacune a ses propres avantages et inconvénients. Il a été prouvé que les tetrodes présentent des avantagessignificatifs dans un meilleur isolement unitaire que les électrodes 16,17, en plus de la rentabilité et de la rigidité mécanique. Ils fournissent également des rendements plus élevés des activités unitaires lorsqu'ils sont combinés avec des microdrives8,18,19,20. Il est essentiel d'augmenter le nombre de neurones enregistrés simultanément pour comprendre la fonction des circuits neuronaux21. Par exemple, un grand nombre de cellules sont nécessaires pour étudier de petites populations de types de cellules fonctionnellement hétérogènes telles que le temps liéà 22 ou la récompense codant23 cellules. Des nombres de cellules beaucoup plus élevés sont nécessaires pour améliorer la qualité de décodage des séquences de pointes13,24,25.
Les tétrodes, cependant, ont un inconvénient dans l'enregistrement des cellules spatialement distribuées, comme dans le cortex ou le thalamus. Contrairement aux tétrodes, les sondes de silicium peuvent fournir la distribution spatiale et l'interaction des potentiels locaux de champ (LFP) et des activités de pointe au sein d'une structure locale14,26. Les sondes de silicium multi-tiges augmentent encore le nombre de sites d'enregistrement et permettent l'enregistrement à travers les structures simples ou voisines27. Cependant, ces tableaux sont moins flexibles dans le positionnement des sites d'électrodes par rapport aux tétrodes. En outre, des algorithmes complexes de tri des pointes sont nécessaires dans les sondes à haute densité pour extraire des informations sur les potentiels d'action des canaux voisins pour refléter les données acquises par les tétrodes28,29,30. Par conséquent, le rendement global des unités individuelles est souvent inférieur à celui des tétrodes. De plus, les sondes de silicium sont désavantageuses en raison de leur fragilité et de leur coût élevé. Ainsi, le choix des sondes de tetrodes vs de silicium dépend de l'objectif de l'enregistrement, qui est une question de savoir si l'obtention d'un rendement élevé d'unités uniques ou de profilage spatial sur les sites d'enregistrement est prioritaire.
En plus d'enregistrer l'activité neuronale, la manipulation optogénétique est devenue l'un des outils les plus puissants en neurosciences pour examiner comment des types de cellules spécifiques et / ou des voies contribuent aux fonctions du circuit neuronal13,31, 32,33. Cependant, les expériences optogénétiques exigent la considération additionnelle dans la conception de réseau de microdrive pour attacher le connecteur de fibre aux sources lumineuses de stimulation34,35,36. Souvent, la connexion de la fibre optique nécessite une force relativement importante, ce qui peut conduire à un changement mécanique de la sonde dans le cerveau. Par conséquent, il n'est pas une tâche triviale de combiner une fibre optique implantable à des réseaux de micropropulsion conventionnels.
Pour les raisons ci-dessus, les chercheurs sont tenus d'optimiser le choix du type d'électrode ou d'implanter une fibre optique en fonction de l'objectif de l'enregistrement. Par exemple, les tétrodes sont utilisées pour obtenir un rendement unitaire plus élevé dans l'hippocampe1,13, tandis que les sondes de silicium sont utilisées pour étudier le profil de profondeur laminaire des zones corticales, telles que le cortex entorhinal médial (MEC)37. Actuellement, des microdrives pour l'implantation simultanée de tétrodes et de sondes de silicium avaient été signalés pour les rats5,11. Cependant, il est extrêmement difficile d'implanter plusieurs tétrodes et sondes de silicium chez la souris en raison du poids des microdrives, de l'espace limité sur la tête de la souris et des exigences spatiales pour concevoir le microdrive pour employer différentes sondes. Bien qu'il soit possible d'implanter des sondes de silicium sans micropropulsion, cette procédure ne permet pas l'ajustement de la sonde et abaisse le taux de réussite de la récupération de silicium-sonde12,38. En outre, les expériences optogénétiques nécessitent des considérations supplémentaires dans la conception de réseaux de micropropulsions. Ce protocole montre comment construire et implanter un réseau de micropropulsion pour l'enregistrement chronique chez les souris en mouvement libre, ce qui permet l'implantation de neuf tétrodes réglables indépendamment et d'une sonde opto-silicium réglable. Ce réseau de micropropulsionfacilite également les expériences optogénétiques et la récupération de la sonde de silicium.

<table><tbody><tr><td>Vis #00-90</td><td>J.I. Morris</td><td>#00-90-1/8</td><td>Vis EIB</td></tr><tr><td>#0-80 Écrou</td><td>Petites pièces</td><td>B00DGB7CT2</td><td>écrou en laiton pour maintenir le porte-virole en fibreVis</td></tr> <tr><td></td><td>B000FMZ57G</td><td>en</td> laiton pour le <td>montage du connecteur de sonde, le support de virole en fibre et le cône de blindage</td></tr><tr><td>Tubes en polyétheréthercétone Ga</td><td>Petites pièces</td><td>SLPT-22-24</td><td>pour la fixation à la navette, 0,025 pouces de diamètre intérieur</td></tr><tr><td>Tube en acier inoxydable 23 Ga</td><td>Petites pièces</td><td>HTX-23R</td><td>pour tétrode</td></tr><tr><td>Fil inoxydable 23 Ga Petites</td><td>pièces</td><td>HTX-23R-24-10</td><td>pour fil en forme de L/fil de support</td></tr><tr><td>Fil inoxydable 26 Ga Petites</td><td>pièces</td><td>GWX-0200</td><td>pour poteaux de guidage</td></tr><tr><td>Fil inoxydable 30 Ga</td><td>Petites pièces</td><td>HTX-30R</td><td>pour tétrode</td></tr><tr><td>Logiciel de CAO 3D</td><td>Dassault Syst&egrave ; mes</td><td>SolidWorks 2003</td><td></td></tr><tr><td>Imprimante 3D</td><td>FormLab</td><td>Form2</td><td></td></tr><tr><td>5.5mil tubes isolants en polyimide</td><td>HPC Medical</td><td>72113900001-012</td><td></td></tr><tr><td>ruban adhésif en aluminium</td><td>Tyco</td><td>Tyco Adhesives 617022 Ruban</td> adhésif en aluminium <td>pour le cône de blindage alternatif</td></tr><tr><td>Pâte conductrice</td><td>YSHIELD</td><td>HSF54</td><td>pour cône</td></tr> <tr><td>de blindagevis sur mesure pour sonde en silicium microdrive</td><td>AMT</td><td>UNM1.25-HalfMoon</td><td>demi-lune vis inox 1,5 mm de diamètre, 300 &micro ; Vis personnalisées à filetage m</td></tr><tr><td>pour tetrode microdrive</td><td>AMT</td> Vis inox à fente <td>Yamamoto_0000-160_9mm</td><td>, 0,5 mm de diamètre, 160 &micro ; m pas de filetage, sur mesure sur commande pour notre acrylique</td></tr><tr><td>dentaire</td> design <td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>modèle dentaire résine</td><td>FormLab</td><td>RS-F2-DMBE-02</td><td></td></tr><tr><td>Outil rotatif Dremel</td><td>modèle 800</td><td>un foret broyeur</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tool</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>carte d’interface électrique</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-Narrow</td><td></td></tr><tr><td>époxy</td><td>Devcon</td><td>GLU-735.90</td><td>5 minutes</td></tr><tr><td>pommade oculaire</td> époxy <td>Dechra</td><td>Puralube Pommade ophtalmique</td><td>pour empêcher les yeux des souris de se dessécher pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>feuille de polissage de fibre</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P</td><td>pour le polissage de la fibre optique</td></tr><tr><td>pince fine</td><td>Protech International</td><td>15-368</td><td>pour le chargement/récupération de la sonde de silicium</td></tr><tr><td>or broches</td><td>Neuralynx</td><td>EIB Pins Petit</td><td></td></tr><tr><td>fil de terre</td><td>A-M Systems</td><td>781500</td><td>0,010 pouce fil d’argent nu</td></tr><tr><td>préampli de scène de tête</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36</td><td></td></tr><tr><td>impédancemètre</td><td>BAK electronics</td><td>Modèle IMP-2</td><td>1 kHz fréquence d’essai</td></tr><tr><td>huile minérale</td><td>ZONA</td><td>36-105</td><td>pour la lubrification des vis et des fils fibre</td></tr><tr><td>optique</td><td>Doric</td><td>MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT</td><td></td></tr><tr><td>Système d’enregistrement</td><td>Neuralynx</td><td>Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr><tr><td>scribe en fibre rubis</td><td>Thorlabs</td><td>S90R</td><td>pour le clivage de la graisse</td></tr><tr><td>silicone</td> pour fibre optique <td>Fine Science Tool</td><td>29051-45</td><td></td></tr><tr><td>sonde en silicium</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-Edge-5mm-20-177</td><td>Fig. 3, 4A, 4B, 5</td></tr><tr><td>sonde en silicone</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-6mm-50-177</td><td>Fig. 4C</td></tr><tr><td>solution de lavage de sonde en silicium</td><td>Alcon</td><td>AL10078844</td><td>nettoyant pour lentilles de contact</td>graisse</tr><tr><td>de silicone</td><td>Smooth-On</td><td>Dragon Skin 10 FAST</td><td>pour la préparation du moule à micro-entraînement</td></tr><tr><td>peinture argentée</td><td>GC électronique</td><td>22-023</td><td>impression argentique II revêtement, utilisé pour les fils de terre</td></tr><tr><td>vis crâne</td><td>Otto Frei</td><td>2647-10AC</td><td>Diamètre 0,8 mm, filetage de 0,200 mm</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux standard</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Appareil stéréotaxique</td><td>Kopf</td><td>Modèle 942</td><td></td></tr><tr><td>super colle</td><td>Loctite</td><td>LOC230992</td><td>pour l’application sur les poteaux de guidage</td></tr><tr><td>pince à épiler chirurgicale</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Tetrode Twister</td><td>Jun Yamamoto</td><td>TT-01</td><td></td></tr><tr><td>fils de tétrode</td><td>Sandvik</td><td>PX000004</td><td></td></tr></tbody></table>

système hybride de micropropulsion avec sonde opto-silicon récupérable et tetrode pour l'enregistrement à haute densité de dual-site dans les souris en mouvement libre

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

Les enregistrements neuronaux multirégionaux peuvent fournir des informations cruciales pour comprendre les interactions à l'échelle des temps fins entre plusieurs régions du cerveau. Cependant, les conceptions conventionnelles de micropropulsion permettent souvent seulement l'utilisation d'un type d'électrode pour enregistrer à partir de régions simples ou multiples, limitant le rendement des enregistrements de profil d'une unité ou de profondeur. Il limite également souvent la capacité de combiner des enregistrements d'électrodes avec des outils optogénétiques pour cibler l'activité spécifique de la voie et/ou du type cellulaire. Présenté ici est un tableau hybride de microdrive pour les souris en mouvement libre pour optimiser le rendement et une description de sa fabrication et la réutilisation du tableau de microdrive. La conception actuelle utilise neuf tétrodes et une sonde opto-silicium implantée dans deux zones cérébrales différentes simultanément chez des souris en mouvement libre. Les tétrodes et la sonde opto-silicium sont réglables indépendamment le long de l'axe dorsoventral dans le cerveau pour maximiser le rendement des activités unitaires et oscillatoires. Ce tableau de micropropulsion intègre également une configuration pour la lumière, la médiation de la manipulation optogénétique pour étudier les réponses régionales ou de type cellulaire-spécifiques et les fonctions des circuits neuronaux à longue portée. En outre, la sonde opto-silicium peut être récupérée et réutilisée en toute sécurité après chaque expérience. Étant donné que le réseau de micropropulsions se compose de pièces imprimées en 3D, la conception des microdrives peut être facilement modifiée pour s'adapter à divers paramètres. La conception du réseau de micropropulsions et la façon d'attacher la fibre optique à une sonde de silicium pour des expériences d'optogénétique, suivies de la fabrication du faisceau de tétrodes et de l'implantation du tableau dans un cerveau de souris. L'enregistrement des potentiels locaux de champ et de l'unité de pointe combiné avec la stimulation optogénétique démontrent également la faisabilité du système de réseau de microdrive chez les souris librement en mouvement.

Le réseau de micropropulsion a été construit dans les 5 jours. La chronologie de la préparation des micropropulsions est décrite dans le tableau 2. Utilisant ce microdrive, neuf tétrodes et une sonde de silicium ont été implantées dans le CA1 hippocampal et le MEC de la souris [21 semaines/29 g de poids corporel mâle pOxr1-Cre (C57BL/6 fond)], respectivement. Cette souris transgénique exprime Cre dans mec couche III neurones pyramidaux. La souris a été injectée avec 200 nL d'AAV5-DIO-ChR2-YFP (titer: 7.7...

Ce protocole décrit la construction d'un réseau hybride de micropropulsion qui permet l'implantation de neuf tétrodes réglables indépendamment et d'une sonde opto-silicium réglable dans deux régions du cerveau chez des souris en mouvement libre. Une méthode de récupération et de réutilisation sécuritaire de la sonde opto-silicium à des fins multiples est également démontrée.

Système hybride de micropropulsion avec sonde opto-Silicon récupérable et tetrode pour l'enregistrement à haute densité de dual-Site dans les souris en mouvement libre

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Notre conception de micropropulsion hybride permet aux expérimentateurs non seulement d’enregistrer à partir de plusieurs régions du cerveau, mais aussi de choisir différents types d’électrodes pour optimiser le rendement et la stabilité. Nous avons combiné neuf tetrodes, une sonde linéaire en silicium et des fibres optiques réglables et réutilisables dans un réseau de micropropulsion pour des expériences in vivo avec des souris librement mobiles. Cette technique peut facilement être adaptée à d’autres animaux plus gros comme les rats ou les marmosets.Les sondes de silicium sont extrêmement fragiles. Nous devons être prudents lorsque nous traitons avec les sondes, par exemple, lors de l’adaptation de la fibre optique et lors de la rotation de l’assemblage de la navette dans le micropropulsion. Le tableau de micropropulsion se compose de cinq parties.Pour préparer la vis microdrive pour la sonde de silicium d’abord 3D imprimer un modèle en plastique de la micropropulsion et placer du ruban adhésif autour du modèle pour faire un mur temporaire autour du modèle. Verser le gel de silicium liquide dans le motif et enlever les bulles d’air avec des secousses douces. Lorsque le silicium est guéri, retirez soigneusement le moule en gel de silicium du motif.Ensuite, utilisez un broyeur rotatif pour couper les longueurs de 18 et 9,5 mm du tube métallique en acier inoxydable de calibre 23 et utilisez le broyeur pour rugueuser les 2 à 3 mm les plus hauts des tubes. Appliquer un petit volume d’huile de silicium sur une vis personnalisée et mettre les tubes et visser dans le moule. Verser l’acrylique dentaire dans le moule et utiliser une seringue pour éliminer les bulles d’air autour des tubes et de la vis.Lorsque l’acrylique dentaire a complètement guéri enlever la vis microdrive du moule et utiliser des pinces pour plier 6mm d’une extrémité de la pointe de fil de 18mm à un angle de 60 degrés. À l’aide d’un outil de rotation, faites pivoter la vis microdrive pour vérifier la qualité, puis installez la vis microdrive dans le corps du réseau de micropropulsion et tournez la vis pour vérifier si elle est capable de monter et descendre en douceur. Pour préparer la navette pour la sonde de silicium utiliser des ciseaux pointus pour couper deux longueurs de 5mm de PEEK et aligner les tubes des deux côtés de la navette.Collez les tubes à la navette avec de l’époxy et appliquez un petit volume d’huile de silicium sur les poteaux de guidage. Lorsque l’époxy a séché, placez la navette sur les poteaux de guidant du corps du réseau de micropropulsion pour vérifier la qualité. La navette doit se déplacer en douceur sans frottement excessif.Pour préparer l’optorode utiliser un coupeur Rubi pour fendre un morceau de fibre optique à 21mm de longueur et moudre la pointe de la fibre jusqu’à ce qu’il soit plat et brillant. Lorsque la pointe est prête, placez doucement la fibre optique sur le côté avant de la sonde de silicium 200 à 300 micromètres au-dessus du dessus des sites d’électrodes et fixez temporairement la fibre avec du ruban transparent, puis collez la fibre optique à la base de la sonde de silicium avec un petit volume d’époxy et laissez l’époxy guérir pendant cinq heures. Pour attacher la navette à la sonde de silicium appliquer un petit volume d’époxy à l’arrière de la base de sonde de silicium et tenir doucement la partie inférieure de la navette contre la base de sonde de silicium pendant deux à trois minutes pour éviter la formation d’un espace entre la navette et la base de sonde de silicium.Lorsque l’époxy a complètement durci tenir la rainure de la navette avec des pinces fines et utiliser un microscope pour placer soigneusement les tubes de navette sur les postes de guidage du corps principal. Tournez la vis pour insérer la vis microdrive dans le trou de vis et insérez la pointe du tube en forme de L dans la rainure de la tête de la navette pour engager la sonde de silicium et la vis microdrive. Ensuite, coupez deux vis numéro 0 à une longueur de fil de 3,5 mm et moudre les pointes pour enlever les bavures.Placez le support du connecteur de sonde sur le corps du tableau et insérez le connecteur électrique de sonde de silicium dans le support. Insérez les vis numéro 0 pour tenir le support du connecteur de sonde. Utilisez l’époxy pour fixer le connecteur de sonde de silicium dans le support en prenant soin de ne pas coller la sonde au corps du réseau de micropropulsion.Pour fixer le support de ferrule à la sonde opto-silicium et au corps du réseau de microdrive, coupez deux vis numéro 0 sur une longueur de fil de 6 mm et broyez les pointes. Moudre l’extérieur de deux écrous à vis de machine numéro 0 pour faire de petites noix d’hex avec 2,5 à 3 mm de diamètres extérieurs et insérer la vis numéro 0 dans le composant A du support. Collez les têtes de vis avec de l’époxy.Appliquer un petit volume de graisse de silicium sur les composants A et B pour réduire le frottement avec le corps. Utilisez des pinces inversées pour insérer temporairement le composant A dans le corps et placer le composant B sur les vis du composant A.Thread les écrous personnalisés sur les vis et utiliser des pinces pour serrer les écrous pour fixer le support de ferrule sur le corps. Insérez la fibre ferrule dans la rainure du support de ferrule de fibre en prenant soin que la fibre ferrule colle 4 à 5mm hors du support.Appliquer une petite quantité d’époxy entre la furule et la rainure du support. Lorsque l’époxy est guéri, desserrer les écrous et tourner la vis microdrive pour vérifier la navette et le support de ferrule pour le mouvement lisse, puis confirmer que la pointe de la sonde se rétracte complètement dans le corps lorsque le support de ferrule est à la position supérieure et les tubes de navette sont toujours associés aux postes de guidage. Pour fixer le cône de bouclier, attachez deux vis numéro 0 de 3,5 mm de l’extérieur du cône pour maintenir le micropropulsion en place.Le tableau de micropropulsion peut être mis en place dans les cinq jours si la construction est terminée selon le calendrier décrit dans le tableau. Après l’ajustement des tetrode, les performances comportementales peuvent être testées sur une piste linéaire et en champ ouvert. Dans les deux types d’expériences, la souris est autorisée à explorer librement pendant environ 30 minutes tandis que les signaux électrophysiologiques sont enregistrés sans bruit lié au mouvement sévère tout au long de la session d’enregistrement.La stimulation lumineuse peut alors être effectuée au cortex entorhinal médial pour stimuler la couche médiale de cortex entorhinal 3 neurones qui projettent au sous-champ CA1 de l’hippocampe. Des activités spontanées de spiking et des potentiels locaux de champ sont alors enregistrés des tetrodes et de la sonde de silicium quand la souris dort. Dans cette expérience représentative, les potentiels du champ gauche enregistrés dans les tetrodes ont démontré de grandes activités d’ondulation suggérant que tous les tetrodes étaient positionnés à proximité de la couche pyramidale de cellules CA1.Des activités réactives induites par la lumière dans cet essai ont d’abord été observées dans le cortex entorhinal médial suivi des activités dans CA1 avec 13 à 18 millisecondes de latence. Prenez soin d’insérer la sonde opto-silicium dans le corps microdrive dans un environnement électrostatique libre. Le cône de blindage peut être remplacé par des matériaux tels qu’une feuille de papier et du ruban adhésif.Cela permettra de réduire le taux de micropropulsion jusqu’à 20%Notre conception microdrive offre des choix flexibles pour une combinaison efficace d’électrodes d’enregistrement pour mesurer et manipuler plusieurs régions du cerveau et d’étudier la dynamique et les interactions des différentes structures cérébrales.

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