Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Ce système sphéroïde de co-culture 3D est conçu pour imiter l’angiogenèse physiologique. Il sera efficace pour évaluer les modulateurs angiogéniques potentiels et fournit des informations prévisibles avant les études in vivo. Ce système utilise des sphéroïdes de co-culture formés par deux cellules progénitrices vasculaires et peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires, la germination et la maturation tubulaire de l’angiogenèse physiologique.

Si nous pouvons utiliser des cellules patientes pour former des sphéroïdes de co-culture, nous pouvons utiliser ce système pour développer des traitements personnalisés pour les maladies anormales liées à l’angiogenèse, comme le cancer. Ce système d’analyse peut augmenter la sensibilité et l’efficacité des études sur l’angiogenèse et le développement de médicaments. Commencez par utiliser 05% trypsine-EDTA pour détacher les ECFC et les CSM de 80 à 90% cultures cellulaires confluentes pendant trois ou cinq minutes dans un incubateur de culture cellulaire, respectivement.

Inactivez la trypsine avec un milieu DMEM complet frais, et pipette les cellules à quelques reprises pour générer une suspension à cellule unique. Recueillir les cellules par centrifugation, suivie de deux lavages avec un milieu sans sérum. Après le deuxième lavage, diluer les ECFC à trois fois 10 à six cellules par millilitre de concentration moyenne et les CSM à deux fois 10 à six cellules par millimètre de concentration moyenne dans les tubes de microcentrifugeuse individuels de deux millilitres.

Pelleter les cellules par centrifugation, et aspirer soigneusement tous sauf les 15 à 25 derniers microlitres de supernatant de chaque échantillon cellulaire. Ensuite, resuspendez chaque granulé dans 250 microlitres de Diluant C à partir d’un kit de teinture fluorescente, et pipette doucement les suspensions cellulaires pour assurer une dispersion complète. Ajouter 250 microlitres de PKH67 20 micromolaires fraîchement préparés au tube des CEFC.

Ajouter 250 microlitres de PKH26 de 12 micromolaires au tube des CSM. Mélanger immédiatement les deux suspensions cellulaires. Après cinq minutes à température ambiante avec secousses, à l’abri de la lumière, arrêter le processus de coloration avec une incubation d’une minute en 0,5 millilitres de FBS par tube.

À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation, et retirer soigneusement le supernatant, suivie de deux lavages en deux millilitres de milieu complet frais par lavage. Puis suspendre les cellules dans un milieu respectif dans des tubes de 15 millilitres. Pour la génération sphéroïde, après le deuxième lavage, diluer d’abord les suspensions cellulaires dans la concentration appropriée du milieu de croissance des cellules endothéliales MV2 complété par une solution de cellulose méthyle à 20 % et une concentration de sérum bovin fœtal de 5 %.

Ensuite, ajoutez chaque suspension cellulaire dans un réservoir rectangulaire en polystyrène stérilisé. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter environ 125 gouttelettes de cellules microlitres sur le couvercle d’une plaque de culture de 150 millimètres. Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, inverser le couvercle sur le fond d’un plat contenant 15 millilitres de PBS, et placer les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.

Le lendemain, rincer les couvercles du plat avec cinq millilitres de PBS dans un tube de 50 millilitres par plat. Rincer les couvercles avec cinq millilitres supplémentaires de PBS pour recueillir les sphéroïdes restants, et pelleter les sphéroïdes par centrifugation. Jetez soigneusement tous sauf les 100 à 200 derniers microlitres de supernatant, et appuyez doucement sur la paroi du tube afin que les sphéroïdes soient librement suspendus dans le supernatant restant.

Ajouter le volume approprié de MV2 moyen de croissance cellulaire endothéliale complété par 5% de sérum bovin fœtal et 40% de solution de cellulose méthyle à chaque tube pour résuspendre les sphéroïdes à un 100 sphéroïdes par millilitre de concentration moyenne. Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre coupée à un diamètre de trois à cinq millimètres pour mélanger délicatement les suspensions sphéroïdes. Utilisez une nouvelle pipette large d’un millilitre pour mélanger la solution de suspension sphéroïde avec un gel de collagène neutralisé de type I à un rapport un pour un sur la glace.

Ajouter 900 microlitres de chaque solution de gel de collagène sphéroïde-suspension dans les puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Laissez les suspensions polymériser pendant 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, avant de couvrir les sphéroïdes de 100 microlitres de MV2 moyen de croissance cellulaire endothéliale complétés par 2,5 % FBS et 50 nanogrammes par millilitre de VEGF aux sphéroïdes ECFC seulement et moyennement complétés par FBS uniquement pour les cultures sphéroïdes MSC et ECFC-plus-MSC. Placez ensuite chaque plaque dans un enregistreur cellulaire en temps réel installé dans un incubateur de culture cellulaire, et concentrez-vous au hasard sur cinq à dix sphéroïdes à un grossissement de 10 x pour surveiller la formation de germination de chaque sphéroïde étiqueté fluorescence toutes les heures pendant 24 heures.

Pour quantifier la germination des sphéroïdes, importez les fichiers d’image à ImageJ et mesurez le nombre et la longueur des germes exprimant le signal fluorescent approprié à partir de cinq sphéroïdes choisis au hasard par groupe expérimental. Pour les sphéroïdes ECFC-plus-MSC, le nombre de germes et la longueur cumulative des pousses sont significativement plus élevés que ceux des sphéroïdes ECFC seulement à tous les points de temps. Les sphéroïdes mscs seulement ne forment pas de germes, mais démontrent une migration individuelle du MSC en dehors des sphéroïdes.

L’étiquetage de l’ECFC avec colorant vert-fluorescent et MSC avec colorant rouge-fluorescent avant de combiner pour générer ecfc-plus-MSC sphéroïdes démontre que les structures de germes ECFC- médiatisées sont couvertes de MSCs, suggérant que les MSCs combinés fonctionnent comme cellules périvasculaires pendant la formation de germes, améliorant la stabilité et la durabilité des germes par l’association étroite entre deux cellules vasculaires. Les sphéroïdes ECFC-plus-MSC prétraités avec un inhibiteur de l’angiogenèse montrent une diminution du nombre de germes et une longueur cumulative des germes d’une manière dépendante de la dose par rapport aux sphéroïdes ECFC-plus-MSC. Dans des expériences parallèles, les sphéroïdes ecfc-seulement prétraités avec l’inhibiteur suivi de la stimulation avec VEGF démontrent également un nombre diminué de pousse induite par facteur de croissance et la longueur cumulative de pousse d’une manière dose-dépendante.

Il convient de noter qu’une concentration plus élevée d’inhibiteur de l’angiogenèse est nécessaire pour inhiber les sphéroïdes ECFC-plus-MSC par rapport aux sphéroïdes ECFC seulement. La croissance de tumeur est sensiblement inhibée dans les animaux inhibiteurs-traités d’angiogenèse de haut dose comparés aux animaux témoins-traités et aux animaux inhibiteurs-traités d’angiogenèse de bas dose dans un modèle humain de souris de tumeur de xénogreffe. La concentration plasmatique de bévacizumab chez les souris traitées à haute dose était de 568 plus ou moins 40,62 microgrammes par millilitre, ce qui était plus proche de la valeur IC50 du bévacizumab pour inhiber la longueur cumulative des pousses chez les sphéroïdes ECFC-plus-MSC plutôt que les sphéroïdes ECFC seulement.

Ceci suggère que le système de sphéroïde de co-culture d’ECFC-plus-MSC est approprié pour prévoir des concentrations efficaces de plasma avant une étude animale. L’utilisation d’une pipette large d’un mL pour mélanger doucement les sphéroïdes pendant qu’ils sont dans le gel de collagène sur la glace est important pour protéger l’intégrité des sphéroïdes. Nous pouvons modifier ce système pour introduire d’autres types de cellules telles que les cellules immunitaires et d’autres matrices extracellulaires pour étudier la tige croisée cellule-matrice pendant l’angiogenèse.