Name: Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Apprenez une méthode mécanique pour perturber la connexine 43 et mesurer son impact sur la biomécanique endothéliale via les tractions et contraintes intercellulaires. Applicable à la métastase cancéreuse et l'athérosclérose.

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Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage de l'Université de Floride centrale et le National Heart, Lung, And Blood Institute du National Institute of Health sous le prix K25HL132098.

1. Fabrication de gels polyacrylamide (PA)
<ol><li>
Préparation du plat Petri
	<ol>
<li>Préparer la solution de silane de liaison en mélangeant 200 ml d'eau ultrapure avec de l'acide acétique de 80 l et 50 l de méthacrylate de 3-(trimethoxysilyl)propyl. Bind silane est une solution utilisée pour fonctionnaliser la surface du plat Petri à fond de verre pour l'attachement hydrogel.</li>
		<li>Remuer la solution de silane de liaison sur une plaque à remuer pendant au moins 1 h.</li>
		<li>Traiter le centre du plat Petri avec une solution de silane de liaison pendant 45 min.</li>
		<li>Retirer la solution de silane de liaison et rincer le plat Petri avec de l'eau ultra-pure 2x-3x.</li>
		<li>Séchez la surface du plat Petri et conservez-la à température ambiante pour une utilisation future.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution hydrogel
	<ol>
<li>Mélanger l'eau ultra-pure, 40% d'acrylamide, et 2% de bis-acrylamide dans un tube centrifugeuse de 15 ml selon le tableau 1.</li>
		<li>Ajouter 80 l de perles fluorescentes à la solution hydrogel.</li>
		<li>Secouez doucement le tube pour mélanger les perles avec la solution de gel.</li>
		<li>Resserrer légèrement le bouchon du tube sur le tube de centrifugeuse et placer dans une chambre à vide.</li>
		<li>Degas la solution de gel pendant au moins 45 min dans la chambre à vide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polymérisation hydrogel
	<ol>
<li>Tout d'abord, ajouter 75 l de persulfate d'ammonium de 10 % (dissous dans de l'eau ultra-pure) et ajouter 8 L de TEMED (N,N,N',N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) à la solution hydrogel.</li>
		<li>Placer 24 ll de solution hydrogel au centre du plat Petri (voir tableau 2).</li>
		<li>Utilisez un bordereau de 18 mm pour aplatir l'hydrogel. Cela donnera une hauteur de 100 m.</li>
		<li>Attendez au moins 30-40 min pour la polymérisation de gel.</li>
		<li>Immerger l'hydrogel polymétédans dans de l'eau ultra-pure pour prévenir la déshydratation des gels.</li>
		<li>Couvrir le plat Petri de papier d'aluminium pour éviter le photoblanchiment des perles fluorescentes et conserver à 4 oC. REMARQUE: Les hydrogels peuvent être stockés sur une période allant jusqu'à 3 mois, mais il est suggéré que ces gels ne soient pas utilisés plus d'une semaine après la fabrication pour obtenir les meilleurs résultats.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Culture cellulaire
<ol><li>Culture cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) dans la culture cellulaire moyenne 200 (voir Tableau des matériaux) complétée par 1% pénicilline-streptomycine sur 0,1% flacons recouverts de gélatine à 37 oC et 5% CO2.</li>
</ol>3. Préparation au pochoir Micropattern
<ol><li>Cure d'une fine couche de polydiméthylsiloxane (PDMS) dans un plat Petri de 100 mm en mélangeant la base de silicone avec l'agent de durcissement en silicone à un rapport de 20:1 (base : agent de durcissement). REMARQUE : Il est possible d'utiliser d'autres ratios de base pour guérir les agents (p. ex. 10:1 ou 30:1). Cependant, une base inférieure au rapport d'agent de durcissement donnera un modèle plus rigide, alors qu'une base plus élevée au rapport d'agent de traitement produira un modèle plus doux.</li>
	<li>Préparer une solution PDMS de 20:1 (agent de traitement de base) et mélanger soigneusement dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Inverser le tube à l'envers et secouer vigoureusement plusieurs fois pour assurer un bon mélange de la solution PDMS, car le mélange non uniforme entraînera une polymérisation incomplète.</li>
	<li>Enlever les bulles qui ont été introduites de l'étape ci-dessus en centrifuge antaissant la solution PDMS pendant 1 min à 190 x g.</li>
	<li>Verser 5-6 ml de solution PDMS au centre d'un plat Petri de 100 mm et agiter le plat jusqu'à ce que la solution PDMS couvre toute la surface du plat Petri.</li>
	<li>Cure de la solution PDMS pendant la nuit à 50-60 oC. Le PDMS peut également être guéri à température ambiante.</li>
	<li>Retirez un pochoir PDMS circulaire de 16 mm de diamètre à l'air d'un perforateur à trous.</li>
	<li>Utilisez un poinçon de biopsie pour créer de petits trous dans le pochoir PDMS. Ce protocole utilise un poinçon de biopsie de 1,25 mm de diamètre.</li>
	<li>Stériliser les pochoirs PDMS en les submergeant d'abord dans 70 % d'éthanol pendant 2-3 min, en aspirant l'excès d'éthanol, puis en les plaçant sous une lumière UV pendant 5 min.</li>
</ol>4. Enduit d'hydrogel De collagène-I
<ol><li>Retirer la glissière de couverture de l'hydrogel et aspirer tout excès de liquide.</li>
	<li>Placez le pochoir PDMS sur la surface de l'hydrogel. REMARQUE : Les pinces peuvent être utilisées pour appliquer une pression légère sur le pochoir PDMS afin d'assurer un joint étanche entre le pochoir PDMS et la surface de l'hydrogel. Nos pochoirs PDMS sont étanches à l'eau et empêchent ainsi l'accès à l'eau entre la surface supérieure du gel et la surface inférieure du pochoir PDMS. En outre, la rigidité hydrogel n'a pas besoin d'être ajusté en ce qui concerne la rigidité PDMS.</li>
	<li>Couvrir la surface de l'hydrogel avec sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) dissous dans un HEPES de 0,1 M (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulsulfonic acide) à une concentration de 1 : 1000 et place sous un UV lampe (puissance 36 W) pendant 8 min.</li>
	<li>Aspirez l'excès de sulfo-SANPAH et de la solution HEPES et rincez l'hydrogel deux fois avec 0,1 M HEPES suivi de deux rinçages supplémentaires avec de l'eau ultra-pure.</li>
	<li>Aspirez l'excès d'eau ultra-pure et enrobez les hydrogels avec 0,1 mg/mL de collagène-I pendant la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Couvrez la vaisselle et protégez les perles fluorescentes contre le photoblanchiment. REMARQUE : Les pochoirs PDMS sont utilisés pour créer des monocouches à micromotif. Les monocouches à micromodèle sont utilisées car elles permettent d'observer simultanément plusieurs monocouches de la même géométrie et des dimensions au cours de chaque expérience. Toutefois, si les micromodèles ne sont pas désirés, les étapes ci-dessus peuvent être suivies à l'exception de l'étape 4.2.</li>
</ol>5. Création de monocouches HUVEC sur hydrogels
<ol><li>Utilisez 1x trypsine pour détacher les cellules des flacons de culture tissulaire pendant 3-5 min dans l'incubateur.</li>
	<li>Après la trypsinisation, ajouter le support de culture cellulaire à la solution trypsine et ajouter au tube de centrifugeuse de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeuse la solution cellulaire pendant 3 min à 1710 x g. Une petite pastille blanche de cellules doit être visible au bas du tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules dans les médias à une concentration de 50 x 104 cellules/mL.</li>
	<li>Retirer le collagène-I de l'hydrogel et rincer 1x avec PBS.</li>
	<li>Ajouter 75 x 103 cellules au sommet du pochoir PDMS et laisser les cellules se fixer à la surface de l'hydrogel pendant au moins 1 h dans l'incubateur à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
	<li>Retirer le pochoir PDMS et ajouter au moins 2 ml de support au plat Petri. Immerger le pochoir PDMS dans 10x trypsine pour enlever les cellules attachées et stériliser en pulvérisant avec 70% d'éthanol, puis en plaçant sous la lumière UV pendant 5 min.</li>
	<li>Placer le plat Petri dans l'incubateur et attendre au moins 36 h ou jusqu'à ce qu'une monocouche confluente soit observée.</li>
</ol>6. 2,5 traitement à la dihydroxychalcone pour la perturbation du Cx43
<ol><li>Dissoudre 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) dans le diméthylsulfoxide (DMSO) pour faire une solution de stock de 0,1875 mg/mL.</li>
	<li>Diluer la solution de stock avec le support de culture cellulaire pour faire une faible concentration de chalcone (0,2 g/mL) aliquot et une concentration élevée de chalcone (2 g/mL) aliquot.</li>
</ol>7. Acquisition de données
<ol><li>Localiser les îles cellulaires à l'école avec un microscope.</li>
	<li>Acquérir des images de contraste de phase et de perles pour imager la morphologie cellulaire et les déplacements d'hydrogel, respectivement. REMARQUE : Ce protocole a utilisé un objectif de 10x pour l'acquisition de données.</li>
	<li>À la fin de l'expérience, détacher les cellules avec 10x trypsine et acquérir une image de la surface du gel sans cellules (image de référence).</li>
</ol>8. Immunostaining
<ol><li>Fixer les monocouches avec 4 % de formaldéhyde et incuber à 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Retirer 4 % du formaldéhyde et ajouter 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 min à 37 oC pour perméabiliser les cellules.</li>
	<li>Retirez 0,2 % Triton X-100 et rincez les monocouches avec PBS 2x-3x.</li>
	<li>Cochez la monocouche avec une solution d'albumine de sérum bovin (BSA) de 2 % pendant 45 min à 37 oC.</li>
	<li>Retirez la solution BSA à 2 % et rincez les monocouches avec PBS 2x-3x.</li>
	<li>Ajouter l'anticorps primaire Cx43 à une concentration de 1:400 à l'échantillon et incuber toute la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Retirez l'anticorps primaire et rincez l'échantillon avec PBS 2x-3x.</li>
	<li>Ajouter les anticorps secondaires à une concentration de 3:200 et incuber pendant 2 h à 37 oC. REMARQUE : Les échantillons doivent être couverts pour éviter le photoblanchiment.</li>
	<li>Retirez l'anticorps secondaire et rincez avec PBS 2x-3x.</li>
	<li>Couvrir l'échantillon avec le milieu de montage (Fluromount-G DAPI) et sceller avec un bordereau de couverture de 18 mm.</li>
</ol>9. Mise en œuvre de la microscopie de force de traction (TFM) et de la microscopie de contrainte monocouche (MSM)
<ol><li>
Calcul de la déformation d'hydrogel REMARQUE : Une procédure de calcul du déplacement étape par étape à l'aide de MATLAB est donnée ci-dessous.<ol>
<li>Ouvrez le fichier traction.m principal dans MATLAB (pour toutes les routines MATLAB voir Matériaux supplémentaires). REMARQUE : Suivez les instructions fournies dans le code pour définir l'annuaire MATLAB.</li>
		<li>Définissez les variables suivantes : format d'image, conversion pixel-micron, modulus de Young, ratio de Poisson et objectif microscope.</li>
		<li>Localisez la perle, l'image trypsine et l'image de phase à l'aide de la sous-routine OpenFiles. REMARQUE : Pour les grands ensembles de données, il est préférable de nommer les fichiers dans l'ordre séquentiel. Par exemple, les fichiers doivent être nommés "filename1.tif", "filename2.tif", etc.</li>
		<li>Définir un roi-retour carré (région d'intérêt) autour de la monocouche cellulaire et exécuter la sous-routine de la cellule cropper pour recadrer l'image originale.</li>
		<li>Exécutez la sous-routine de déplacement-finder pour calculer les déplacements.</li>
		<li>Exécutez la sous-routine Dedrift pour éliminer tout déplacement non cellulaire supplémentaire qui pourrait être dû à la dérive au stade du microscope.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcul des tractions REMARQUE : Ici, les tractions sans contrainte sont calculées à l'aide de notre routine MATLAB personnalisée. Le calcul de traction étape par étape à l'aide de la routine MATLAB mentionnée précédemment est donné ci-dessous.<ol>
<li>Définissez les variables suivantes dans la routine traction.m : état limite, épaisseur de gel, hauteur de gel, et dérivation.</li>
		<li>Exécutez la sous-routine de traction-finder pour calculer les tractions et exécutez la sous-routine de traction de parcelle pour tracer des tractions. Toutes les tractions dans la direction x (Tx) et y-direction (Ty) ainsi que leurs emplacements de pixels correspondants peuvent être trouvés dans un fichier traction.dat qui sera généré par le code.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcul des contraintes intercellulaires REMARQUE : Les instructions étape par étape pour le calcul du stress intercellulaire à l'aide de la routine MATLAB mentionnée précédemment sont données ci-dessous.<ol>
<li>Exécutez la sous-routine de la marque-circular-domaine pour spécifier la limite de monocouche. Cette routine incitera toutes les images de phase recadrées séquentiellement pour l'utilisateur à tracer manuellement une limite autour de la monocouche. Gardez une note des nXPts générés dans la fenêtre de commande et utilisez-les plus tard comme paramètres de grille dans l'axe X et l'axe Y pour l'analyse FEM (voir l'étape 9.3.2).</li>
		<li>Exécutez Run-StressCode pour calculer les contraintes intercellulaires. Cette sous-routine lit directement les paramètres du fichier "model.in" et exécute "island.exe" pour effectuer l'analyse FEM. Avant d'exécuter cette routine, assurez-vous que tous les paramètres du fichier model.in, c'est-à-dire les paramètres de grille en X et Y, la conversion pixel à micron, le modulus du gel de Young, le ratio de Poisson, la hauteur de la monocouche et le motif monocouche (bande ou trou), sont modifiés correctement.</li>
		<li>Tracez tous les résultats DE la FEM à l'aide de la sous-routine de l'intrigue FEM.- REMARQUE : Tous les résultats générés seront automatiquement stockés dans le dossier Résultats dans l'annuaire MATLAB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Notre groupe, ainsi que d'autres, a été avec succès l'aide de TFM et MSM pour sonder l'influence des jonctions cellules-cellules dans divers processus cellulaires pathologiques et physiologiques in vitro7,15,18,27 . Par exemple, Hardin et coll. ont présenté une étude très perspicace qui suggère que la transmission intercellulaire du stress guide la formation de lacunes paracellulaires dans les ...

Le champ qui se réfère à l'étude des effets des forces physiques et des propriétés mécaniques sur la physiologie et la pathologie cellulaires et tissulaires est connu sous le nom de mécanobiologie1. Quelques techniques utiles qui ont été utilisées dans la mécanobiologie sont la microscopie de contrainte de monocouche et la microscopie de force de traction. La microscopie de force de traction permet le calcul des tractions générées à l'interface cellule-substrat, tandis que la microscopie de contrainte de monocouche permet le calcul des contraintes intercellulaires générées entre les cellules adjacentes dans une monocouche2 ,3,4,5,6. Les résultats obtenus à partir de méthodes antérieures ont suggéré que les contraintes mécaniques d'origine cellulaire jouent un rôle crucial dans la détermination du sort d'une foule de processus cellulaires3,4,5. Par exemple, lors de l'exposition à une force mécanique externe, un groupe de cellules qui migrent en tant que collectif peut modifier leur morphologie et polariser leur forme pour s'aligner et migrer le long de la direction de la force appliquée en générant, en partie, des tractions7, 8. Les tractions fournissent une mesure qui peut être utilisée pour évaluer la contractilité cellulaire et sont calculées à l'aide de la microscopie de force de traction (TFM). La microscopie de force de traction (TFM) commence par la détermination des déformations de substrats induites par les cellules suivies du calcul du champ de traction à l'aide d'une approche computationnelle mathématiquement rigoureuse et basée sur la mécanique. Depuis la capacité de calculer les tractions a été autour depuis un certain temps, les chercheurs ont utilisé TFM pour révéler l'impact des tractions ont sur une foule de processus, y compris le cancer9, la cicatrisation des plaies10 et l'évaluation de l'ingénierie cardiaque tissu11.
La mise en œuvre de TFM et de MSM ensemble peut être divisée en trois étapes essentielles qui doivent être exécutées dans l'ordre suivant : premièrement, les déformations d'hydrogel produites par les cellules sont déterminées ; deuxièmement, les tractions sont récupérées à partir de déformations hydrogel; et troisièmement, une approche d'élément fini est employée pour calculer les contraintes intercellulaires normales et de cisaillement dans le monocouche entier. Pour calculer les déplacements de gel, des images de perles de fluorescence avec des cellules ont été comparées à l'image de perle de référence (sans cellules) en utilisant une routine de vélocimétrie d'image de particule sur mesure (PIV). La taille et le chevauchement des fenêtres de corrélation croisée pour l'analyse PIV ont été choisis pour être de 32 x 32 pixels et 0,5, respectivement. À cette époque, les changements de pixels ont été convertis en microns en se multipliant avec un facteur de conversion pixel-micron (pour notre microscope, ce facteur de conversion est de 0,65) pour obtenir des déplacements dans les avions. Les erreurs associées à l'ignorance des déplacements hors avion sont négligeables12,13. Après le calcul des déplacements de gel, il y a deux types de mesures de traction qui peuvent être employées, tractions contraintes et tractions sans contrainte8,14. Les tractions sans contrainte fournissent le champ de traction pour l'ensemble du champ de vision (y compris les régions avec et sans cellules), tandis que les tractions contraintes fournissent le champ de traction uniquement pour les régions qui incluent les cellules14. Ensuite, les contraintes intercellulaires sont calculées à l'aide de la microscopie de contrainte monocouche (MSM), qui est une extension de la microscopie de force de traction. La mise en œuvre de MSM est basée sur l'hypothèse que les tractions locales exercées par une monocouche de cellules à l'interface cellule-substrat doivent être équilibrées par des forces mécaniques transmises entre les cellules à l'interface cellule-cellule comme l'exigent les lois de Newton7 ,12,13. Une hypothèse clé ici est que la monocouche cellulaire peut être traitée comme une mince feuille élastique parce que la distribution de traction dans la monocouche est connue et l'équilibre de force ne dépend pas des propriétés du matériau cellulaire. Une autre hypothèse clé est que les forces de traction sont équilibrées par des contraintes intercellulaires locales dans le champ de vision optique (dans le monocouche) et l'influence de cet équilibre de force est minime dans la région distale (en dehors de la monocouche)13. Par conséquent, les conditions limites définies par les contraintes intercellulaires, les déplacements ou une combinaison des deux à la limite de la monocouche sont cruciales pour effectuer MSM13. En tenant compte des informations ci-dessus, nous utilisons MSM pour effectuer une analyse d'éléments finis (FEM) pour récupérer le stress principal maximum(max) et le stress principal minimum(min)en faisant pivoter le plan de stress à chaque point dans le Monocouche. Ces contraintes principales sont ensuite utilisées pour calculer le stress intercellulaire normal moyen 2D [(max'min) /2] et le stress intercellulaire maximum de cisaillement 2D [(max- min) /2] dans la monocouche entière 12,13. Cette procédure est décrite plus en détail par Tambe et al.12,13
La microscopie de contrainte monocouche (MSM) permet le calcul des contraintes intercellulaires de cellules-cellules générées dans un monolayer6,7,8,12,13. Ces contraintes intercellulaires ont été suggérées pour être importantes pour la croissance et la réparation de tissu, la guérison de blessure, et la métaste de cancer12,15,16,17. En outre, les contraintes intercellulaires ont été suggérées pour être également importantes dans la migration endothéliale de cellules et la fonction de barrière endothéliale17,18. Tandis que les jonctions de cellules-cellules telles que les jonctions serrées et les jonctions d'adhérents ont été suggérées pour jouer un rôle critique dans la génération et la transmission intercellulaires de stress endothélial, le rôle des jonctions d'écart demeure insaisissable. Les jonctions d'écart relient physiquement les cellules adjacentes et fournissent une voie pour que le courant électrique et les molécules (lt;1 KDa) passent entre les cellules voisines19,20,21. Bien que les cellules endothéliales expriment Cx37, Cx40, et Cx43 jonctions d'écart19,22, Cx43 est sans doute le plus important en termes de progression de la maladie23. L'évidence de l'importance de Cx43 peut être trouvée dans le fait que la suppression génétique de Cx43 chez les souris a des résultats dans l'hypotension24 et a des effets défavorables sur l'angiogenèse25. En outre, Cx43 a été documenté pour être important pour la migration cellulaire et la prolifération et dans la progression de l'athérosclérose18,22,23,24,25 .
Dans ce protocole, nous avons utilisé TFM et MSM pour étudier si la traction et la génération de stress intercellulaire dans le confluent, monolayer endothélial serait affectée par la perturbation de la jonction endothéliale de jonction d'écart Cx43. Nous avons perturbé Cx43 avec 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), une molécule documentée pour inhiber l'expression Cx4326. Chalcone a été utilisé pour perturber Cx43 au lieu de siRNA que le chalcone a été signalé précédemment par Lee et al. pour perturber l'expression Cx4326. En outre, nous avons été particulièrement intéressés par l'influence du chalcone sur l'endothélium car il a également été signalé comme étant un composé anti-inflammatoire et antiplaquettaire qui peut potentiellement être utilisé pour la prévention et le traitement de divers vasculaires pathologies26. Les traitements de Chalcone ont été exécutés une heure après le début de l'expérience, les monocouches chalcone-traités ont été imaged pendant un total de six heures, et le traitement d'image a été exécuté avec un code personnalisé de MATLAB pour déterminer des tractions et plus tard intercellulaire Souligne. Nos résultats ont montré une diminution globale des tractions et des contraintes intercellulaires, suggérant que Cx43 joue un rôle clé dans la biomécanique endothéliale.

<table><tbody><tr><td>Lamelle de recouvrement de 18 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Indispensable pour aplatir les gels de polyacrylamide</td></tr><tr><td>2 % bis-acrylamide</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Composant du gel de polyacrylamide</td></tr><tr><td>2&prime ;,5&prime ;-Dihydroxychalcone</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Pour perturber la structure Cx43</td></tr><tr><td>Méthacrylate de 3-(Triméthoxysilyl)propyle</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Solution mère pour faire lier le mélange de silane avec de l’acide acétique et de l’eau ultra-pure</td></tr><tr><td>40 % Acrylamide</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Composant du gel de polyacrylamide</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Essentiel pour faire lier la solution saline</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 chèvre anti-souris IgG ;</td><td></td><td>ThermoFisher Catalogue # A-11001</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Agent polymérisant sur gel de polyacrylamide</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Pour faire une solution bloquante</td></tr> Solution d’atélo-collagène <tr><td>bovin de type I, 3 mg/mL, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Utilisation comme matrice</td></tr> <tr><td>extracellulaireCorning Cell Culture Phosphate Buffer Saline (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Buffer Saline nécessaire pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Pour dissoudre le chalcone et faire une solution mère</td></tr><tr><td>Fluoromount-G avec DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>Milieu de montage pour immunostaing utilisé pour la coloration pour DAPI</td></tr><tr><td>Microsphère fluroscente Perles modifiées aux carboxylates</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>0,5 micron billes modifiées aux carboxylates (rouge), 2 % de solides</td></tr><tr><td>Solution tampon HEPES 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Essential pour</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Essential HUEVC media 200 supplement</td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>Essential media for HUVEC cell culture</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal Cx43 de souris (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog #13-8300</td> Anticorps primaire pour boîte de Pétri <td>Cx43</td></tr><tr><td>(35 mm de diamètre)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>Boîte de Pétri de 35 mm avec un puits central de 20 mm</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Réticulant 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Indispensable pour fonctionnaliser la surface du gel de polyacrylamide</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td><td>Élastomère de silicium avec agent de durcissement pour la fabrication de PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1610801 <td>Agent de polymérisation de gel de polyacrylamide</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Pour perméabiliser les cellules</td></tr><tr><td>Trypsine -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Utilisé pour détacher les cellules</td></tr></tbody></table>

perturbing biomécanique endothéliale via connexin 43 structural disruption

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Des cellules endothéliales ont été établies pour produire des contraintes et des tractions intercellulaires, mais les jonctions de fossé de rôle jouent dans le stress intercellulaire endothélial et la génération de traction sont actuellement inconnues. Par conséquent, nous présentons ici un protocole mécanique-basé pour sonder l'influence de connexin 43 de jonction d'écart (Cx43) a sur la biomécanique endothéliale en exposant des monocouches endotenoles à un inhibiteur connu de Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) et mesure de l'impact de cet inhibiteur sur les tractions et les contraintes intercellulaires. Nous présentons des résultats représentatifs, qui montrent une diminution des tractions et des contraintes intercellulaires sous une dose élevée de chalcone (2 g/mL) par rapport au contrôle. Ce protocole peut être appliqué non seulement à Cx43, mais aussi à d'autres jonctions d'écart, en supposant que l'inhibiteur approprié est utilisé. Nous croyons que ce protocole sera utile dans les domaines de la recherche cardiovasculaire et mécanobiologie.

Des images de contraste de phase du contrôle, 0,2 g/mL, et 2 monocouches traitées au chalcone de g/mL ont été prises 30 minutes avant le traitement à la chalcone (figure 1A-C) et 2 heures après le traitement à la chalcone (figure 1D-F). Des déplacements de perles induits par les cellules (m) ont été observés pour diminuer dans les conditions de chalcone à faible dose et de chalcone à forte dose<s...

Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d'écart 43 et mesurer l'impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l'observation des tractions et des contraintes intercellulaires.

Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Ce protocole est significatif car il permet d’élucider le rôle que jouent les forces cellulaires dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que la cicatrisation des plaies et les métastases cancéreuses, par exemple. Le principal avantage de cette technique mécanique est sa capacité à perturber simultanément les jonctions cellule-cellule et à mesurer son impact sur les forces mécaniques générées par les cellules, principalement les tractions et les facteurs de stress intercellulaires. Notre protocole s’applique à un large éventail de processus pathophysiologiques, tels que les métastases cancéreuses, les athéroscléroses et l’hypertension, par exemple.Nos méthodes peuvent être intégrées pour effectuer à la fois des analyses biochimiques et biomécaniques avec des modèles d’organes sur puce, des constructions de tissus bio-machinés, des systèmes d’administration de médicaments in vitro et des systèmes de co-culture tissulaire. Notre protocole est assez simple à exécuter. Toutefois, nous conseillons à ceux qui font ce protocole pour la première fois d’avoir de la patience et de ne pas se précipiter à travers les étapes de ce protocole.Notre protocole a des étapes uniques qui peuvent ne pas être claires pour les utilisateurs pour la première fois. Par conséquent, nous encourageons les utilisateurs à suivre nos procédures écrites étape par étape et à utiliser les démonstrations visuelles comme conseils. Pour commencer, préparez la solution Blind-silane en mélangeant 200 millilitres d’eau ultra pure avec 80 microlitres d’acide acétique et 50 microlitres de silane méthacrylate.Remuer la solution Bind-silane sur une plaque à remuer pendant au moins une heure. Traitez bien le centre d’une boîte de Pétri avec la solution Bind-silane pendant 45 minutes. Retirer la solution Bind-silane et rincer la boîte de Pétri avec de l’eau ultra pure deux à trois fois.Sécher la surface de la boîte de Pétri et la conserver à température ambiante pour une utilisation future. Pour préparer la solution hydrogel, mélanger 12,49 millilitres d’eau ultra pure à 2,062 millilitres d’acrylamide à 40 % et 375 microlitres de bisacrylamide de 2 % dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ajouter 80 microlitres de perles fluorescentes à la solution hydrogel.Agiter doucement le tube pour mélanger les perles avec la solution de gel. Gardez le bouchon en vrac sur le tube de centrifugeuse et placez-le dans une chambre à vide. Dé-gazer la solution de gel pendant au moins 45 minutes dans la chambre à vide.Pour polymériser l’hydrogel, ajoutez d’abord 75 microlitres de 10% de persulphate d’ammonium, puis ajoutez huit microlitres de TEMED à la solution d’hydrogel. Placer 24 microlitres de la solution hydrogel au centre de la boîte de Pétri. Appuyez sur l’hydrogel avec un glissement de couvercle de 18 millimètres pour aplatir l’hydrogel et faire une hauteur d’environ 100 micromètres.Attendez au moins 30 à 40 minutes pour la polymérisation du gel. Submergez l’hydrogel polymérisé dans de l’eau ultra pure pour prévenir la déshydratation du gel. Couvrir la boîte de Pétri de papier d’aluminium pour éviter la photobleaching des perles fluorescentes et les conserver à quatre degrés Celsius.Tout d’abord, mélanger la base de silicone PDMS avec l’agent de séchage en silicone à un rapport de 20 pour un dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Inverser le tube à l’envers et secouer vigoureusement plusieurs fois pour assurer un bon mélange de la solution PDMS. Enlevez les bulles de la solution PDMS en centrifugant pendant une minute à 190 fois G.Versez cinq à six millilitres de la solution PDMS au centre d’une boîte de Pétri de 100 millimètres et agitez le plat jusqu’à ce que la solution PDMS couvre toute la surface de la boîte de Pétri.Guérir la solution PDMS pendant la nuit à 50 à 60 degrés Celsius. Ensuite, retirez un pochoir PDMS circulaire de 16 millimètres de diamètre à l’intérieur d’un poinçonneur de trou. Utilisez un poinçon de biopsie de 1,25 millimètre de diamètre pour créer de petits trous dans le pochoir PDMS.Stériliser les pochoirs PDMS en les submergeant à 70 % d’éthanol pendant deux à trois minutes, en aspirant à l’excès d’éthanol, puis en les plaçant sous une lumière UV pendant cinq minutes. Aspirer tout excès de liquide et retirer le bordereau de couverture de l’hydrogel. Placez le pochoir PDMS sur la surface de l’hydrogel et utilisez des pinces à épiler pour appliquer une pression lumineuse sur le pochoir PDMS afin d’assurer un joint étanche entre le pochoir PDMS et la surface hydrogel.Couvrir la surface de l’hydrogel avec Sulfo-SAMPA dissous dans 0,1 molar HEPES solution tampon à une concentration de un à 1000 et placer l’hydrogel sous une lampe UV avec une puissance de 36 watts pendant huit minutes. Aspirez l’excès de solution Sulfo-SAMPA et HEPES et rincez l’hydrogel deux fois avec 0,1 molaire HEPES suivie de deux rinçages supplémentaires à l’eau ultra pure. Aspirez l’excès d’eau ultra pure et utilisez une pipette de 200 microlitres pour enrober l’hydrogel de 0,1 milligramme par millilitre de collagène-1.Couvrez le plat pour protéger les perles fluorescentes contre le photobleaching et stockez l’hydrogel à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, ajoutez trois millilitres de trypsine 1X dans le flacon et placez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes pour détacher les cellules du flacon de culture tissulaire. Après la trypsinisation, ajouter trois millilitres de médias de culture cellulaire dans le flacon, tourbillonner pour mélanger, et transférer le mélange dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres.Centrifuger la solution cellulaire pendant trois minutes à 1710 fois G.Aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules dans les médias à une concentration de 50 fois 10 à quatre cellules par millilitre. Sortez le plat d’hydrogel du réfrigérateur. Retirer le collagène-1 de l’hydrogel et rincer une fois avec PBS.Ajouter 75 fois 10 aux troisièmes cellules au sommet du pochoir PDMS et permettre aux cellules de se fixer à la surface de l’hydrogel pendant au moins une heure dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Retirer le pochoir PDMS et submerger le pochoir PDMS en trypsine 10X pendant 10 à 15 secondes pour enlever les cellules attachées. Ajouter au moins deux millilitres de médias à la boîte de Pétri et stériliser le pochoir en pulvérisant avec 70% d’éthanol, puis en plaçant sous la lumière UV pendant cinq minutes.Placer la boîte de Pétri dans l’incubateur pendant au moins 36 heures, ou jusqu’à ce qu’un monocouche confluent soit observé. Des images de contraste de phase de 30 minutes avant traitement de chalcone et de deux heures après traitement de chalcone ont été comparées. On a observé des déplacements de perles induits par les cellules diminuer dans les conditions de chalcone à faible dose et de chalcone à haute dose par rapport aux monocouches HUVEC témoins.Avant le traitement au chalcone, les tractions RMS étaient d’environ 51 Pascal pour toutes les conditions. Après traitement de chalcone, il y avait une petite augmentation des tractions de RMS à 59 Pascals dans les monolayers traités de chalcone à faible dose et une diminution presque deux fois des tractions rms à 18 Pascals dans les monocouches traitées au chalcone à haute dose par rapport au contrôle. Le traitement de Chalcone a augmenté la magnitude normale moyenne de stress intercellulaire avec la basse dose, mais a sensiblement diminué l’ampleur normale moyenne de stress intercellulaire avec la dose élevée par rapport au contrôle.Le traitement de chalcone a également diminué les contraintes intercellulaires maximales à la concentration basse et élevée de chalcone par rapport au contrôle. L’impact du traitement au chalcone est statistiquement significatif basé à la fois sur les tests T et le test ANOVA à facteur unique. Tout en plaçant le pochoir PDMS sur le dessus du gel, assurez-vous que le gel est suffisamment sec pour assurer un joint étanche à l’eau entre le pochoir PDMS et le gel.Ce protocole peut également être appliqué pour sonder la contribution biomécanique d’une variété de jonctions cellule-cellule, protéines cytosquelettiques, molécules d’adhérence de matrice cellulaire, ou molécules extracellulaires avec l’imagerie vivante. Avec ce protocole in vitro, les chercheurs peuvent maintenant étudier avec succès une foule de propriétés biomécaniques, ainsi que biochimiques pendant la réparation des tissus, la cicatrisation des plaies ou les métastases cancéreuses sans modèle animal. Nous conseillons à nos téléspectateurs d’être très prudents lors de la manipulation de chalcone et DMSO que l’inhalation de ces médicaments est signalé comme étant nocif.

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Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

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