Name: Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche samedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez le transfert adoptif de cellules iPSC dérivées en lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB pour supprimer la réplication virale chez la souris. Cette méthode offre une approche prometteuse en immunothérapie cellulaire.

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Les auteurs remercient le Dr Adam J Gehring, de l'Institut de recherche de l'Hôpital général de Toronto, d'avoir fourni de l'ADNC pour les HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - gènes hybrides hybrides à la murine humaine à restriction A2, et le Dr Pei-Jer Chen de la National Taiwan University pour avoir fourni des gènes tCR hybrides à murine humain restreints par A2, et le Dr Pei-Jer Chen de la National Taiwan University pour avoir fourni des gènes tCR hybrides à murine humain restreints a2, et le Dr Pei-Jer Chen de la National Taiwan University pour avoir fourni pAAV/HBV 1.2 construction. Ce travail est soutenu par le National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 et R21AI109239 à J. S.

Toutes les expériences sur les animaux sont approuvées par le Texas A -amp;M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) et sont menées conformément aux lignes directrices de l'Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Les souris sont utilisées pendant l'âge de 6 à 9 semaines.
1. Génération de cellules virales Spécifiques à l'Ag CD8et T à partir d'iPSC (iPSC-CD8et lymphocytes T)
<ol><li>Création des constructions rétrovirales REMARQUE : Les gènes TCR et MD sont liés à la séquence d'auto-cleaving 2A. Le vecteur rétroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) est DsRed23 .<ol>
<li>Sous-clone HBs183-191 (FLLTRILTI)-spécifique A2-restricted human-murine hybride TCR (s183 TCR) gènes (V 34 et V -28) dans le MiDR pour créer la construction S183 MiDR (Figure 1A)25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transduction rétrovirale REMARQUE : Les cellules Platinum-E (Plat-E) sont utilisées pour l'emballage des rétrovirus (porteurs de gènes TCR s183), qui seront utilisés pour la transduction rétrovirale. Les cellules De Plat-E sont des cellules d'emballage rétrovirus efficaces sous-jacentes aux cellules 293T, qui ont été développées au moyen de constructions d'emballage uniques par l'intermédiaire du promoteur EF1MD pour exprimer la protéine rétrovirale de structure, y compris le bâillon, le pol, et l'env écotropique.<ol>
<li>Sur un plat de culture de 100 mm, graines 3 x 106 cellules De plat-E dans 8 ml de milieu de culture DMEM contenant 10 % de sérum fœtal de veau (FCS) dans un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2, 1 jour avant la transfection.</li>
		<li>Le jour 0, transfect le S183 MiDR construire dans les cellules Plat-E à l'aide d'un réactif de transfection de l'ADN25.</li>
		<li>Le jour 1, graines 1 x 106 iPSC (GFP) dans une plaque de culture pré-enrobée de gélatine.</li>
		<li>Les jours 2 à 3, collectez des supernatants contenant des rétrovirus de la culture cellulaire De Plat-E pour transduire les iPSC avec le TCR s183 en présence de la solution 1,6-dibromohexane25.</li>
		<li>Le jour 4, trypsiniser les iPSC transducés par les gènes TCR s183, centrifugeuse à 400 x g pour 5 min et graines 3 à 105 iPSC dans un plat de culture de 100 mm pré-enduit de 3 x 106 SNL76/7 irradiés (irSNL76/7) cellules d'alimentation25.</li>
		<li>Le jour 5 ou 6 de la confluence, trypsiniser les cellules, centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min et traiter pour le tri cellulaire. Gating sur les cellules vivantes, trier les cellules GFP et DsRED à double positif (les iPSC transduscés par les gènes S183 TCR) à l'aide d'un trieur de cellules à grande vitesse. Semblable à l'étape 1.2.5, co-culture des cellules triées sur irSNL76/7 cellules d'alimentation pour une utilisation future25.</li>
	</ol></li>
	<li>Différenciation des cellules iPSC-CD8 spécifiques au VHB REMARQUE : Les cellules stromales OP9-DL1/DL4 surexpriment à la fois les ligands Notch DL1 et DL4, et les iPSC co-culturisants avec les iPSC peuvent promouvoir la différenciation des lymphocytes T à médiation Notch26.<ol>
<li>Cultivez s183 iPSC s183 transduced gène TCR (s183/iPSCs) dans la monocouche de cellules OP9-DL1-DL4 dans le milieu essentiel -minimum (MEM) média contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS)27. Inclure le ligand flt3 murine (mFlt-3L; concentration finale de 5 ng/mL) dans la culture.</li>
		<li>Le jour 0, graines 0,5 à 1,0 x 105 S183/iPSC dans un plat de culture de 10 cm précédemment cultivé avec des cellules OP9-DL1-DL4. Validez que les cellules OP9-DL1-DL4 sont dans un état de confluence de 80% à 90%.</li>
		<li>Le jour 5, rincez les iPSC avec 10 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS), aspirez au PBS, ajoutez ceci à 4 ml de trypsine de 0,25%, et incubez dans un incubateur de 37 oC pendant 10 min. Par la suite, ajoutez un supplément de 8 ml de support iPSC pour mettre fin à la digestion de la trypsine. Accumuler toutes les solutions digestives contenant les cellules et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 15-30 oC.</li>
		<li>Aspirez les cellules supernatant et resuspend dans 10 mL de médias iPSC. Transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque Petri de 10 cm et couver dans un incubateur pendant 30 min à 37 oC.</li>
		<li>Après 30 min, collectez le support iPSC contenant les cellules flottantes. Passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 m et calculez le numéro de la cellule.</li>
		<li>Seed 5 x 105 cellules dans le plat de culture précédemment cultivé OP9-DL1-DL4 cellules avec une condition de 80%-90% confluent tel que décrit à l'étape 1.3.1. REMARQUE : Pour la différenciation des lymphocytes T, tous les deux jours et 3 jours, les cellules dérivées de l'iPSC doivent semer à nouveau avec une nouvelle couche des cellules OP9-DL1-DL4.</li>
	</ol></li>
	<li>évaluation<ol>
<li>Changements morphologiques de différenciage des iPSC<ol>
<li>Observez les cellules au microscope sur plusieurs jours. REMARQUE : Au jour 5, les colonies ont des caractéristiques de mesoderm-comme, présentant une morphologie classique de fuseau-forme ressemblant aux fibroblastes dermiques humains et à la croissance soutenue in vitro. Au jour 8, de petits groupes ronds de cellules commencent à apparaître.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyse de la différencié des iPSC par cytométrie de flux<ol>
<li>Lors de divers jours de co-culture, analyser les cellules dérivées de l'iPSC telles que décrites précédemment25 (Figure 1B,C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyse fonctionnelle des iPSC différenciants<ol>
<li>Le jour 28 de la co-culture, collecter les cellules iPSC-CD8et T des cultures en récoltant les cellules flottantes, trypsiniser les cellules restantes avec 0,25% de trypsine, re-suspendre dans 8 mL de support iPSC, centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g à 15-30 oC, enlever le support, puis resuspendre les cellules dans 10 ml de support.</li>
			<li>Conserver les cellules rechargées dans un plat frais de 10 cm dans un incubateur de 37 oC pendant 30 min et assembler les cellules flottantes. Puis rincer les cellules une fois avec un PBS froid.</li>
			<li>Incubate 3 x 106 splenocytes appauvris par les lymphocytes T (CD4-CD8-) à partir de rates de H-2 de classe I, HLA-A2.1-transgénique (HHD) souris avec 5 m 183 peptide (FLLTRILTI) dans 200 'L de médias à 4 'C pour 30 min.</li>
			<li>Produire un mélange de cellules iPSC-CD8et T avec des splenocytes pulsés avec du peptide s183 (cellules T : splenocytes 1:4; utiliser 0,75 x 106 lymphocytes T). Incuber le mélange de cellules à 37 oC dans un incubateur de CO2 pendant 40 h. Au cours des 7 dernières heures, ajouter 4 l de brefeldin A dilué dans la culture (concentration finale de 1000x, qui sera diluée dans 1x culture media) pour bloquer les processus de transport lors de l'activation cellulaire.</li>
			<li>Tainer les cellules et effectuer une analyse cytométrique du débit de l'IFN intracellulaire- Comme décrit précédemment (Figure 2).</li>
		</ol>

</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Induction de la réplication du VHB par la livraison hydrodynamique du plasmide du VHB
REMARQUE : la construction de pAAV/HBV1.2 a été produite comme décrit précédemment9. L'ADN complet du VHB 1.2 est incorporé dans le pAAV vectoriel.
<ol><li>Livraisons hydrodynamiques de plasmide hBV dans la veine de la queue<ol>
<li>Chauffer les souris HHD à l'aide d'une lampe thermique pendant 5 min dans la cage afin de dilater la veine de la queue.</li>
		<li>Détenir l'animal au moyen d'une formatrice et nettoyer la queue de souris avec un vaporisateur d'éthanol à 70 %.</li>
		<li>Livraison de plasmide dans le foie.</li>
		<li>Mesurer le poids corporel de la souris à l'aide d'une balance à mesurer.</li>
		<li>Diluer 10 g de plasmide de HBV dans l'équivalent de 8 % de la masse corporelle PBS (p. ex., 1,6 mL pour une souris de 20 g). Chargez le plasmide dilué dans une seringue de 3 ml avec une aiguille hypodermique de 26 G et 1à2po (0,45 x 12 mm).</li>
		<li>Localiser l'une des deux veines latérales de la queue au milieu du tiers de la queue et positionner l'aiguille dans l'une ou l'autre veine latérale. Administrer l'injection contenant le plasmide de HBV par la veine de queue dans 3 - 5 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification de la virémie à partir du sérum sanguin de souris infectées REMARQUE : La réplication du VHB se produit du jour 3 à 35 dans le sérum de souris. La réplication de l'ADN atteint son maximum le jour 7 et diminue progressivement. L'ADN du VHB n'est pas éliminé du sérum avant le 35e jour.<ol>
<li>Collecte de sérum sanguin sur des souris infectées<ol>
<li>Recueillir environ 0,1 ml de sang dans un tube microcentrifuge de chaque souris sur 3, 5, 7, et 10 jours après l'infection par saignement rétro-orbital dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, puis incuber à température ambiante (RT) pendant 20 min.</li>
			<li>Centrifuger l'échantillon à 6 000 x g pendant 15 min à 4 oC et recueillir le supernatant de sérum après centrifugation.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purifez l'ADN du sérum sanguin à l'aide d'une trousse d'extraction d'ADN disponible dans le commerce suivant les recommandations du fabricant. En bref, lyser les cellules dans une colonne à base de silice, effectuer les lavages, et extraire l'ADN en ajoutant 100% d'éthanol à la colonne d'élution et de centrifuging à 6000 x g pendant 1 min. Elute l'ADN dans 50 'L d'eau sans RNase.</li>
		<li>Utilisez 100 ng d'ADN HBV de l'élution pour l'analyse PCR en temps réel. Utilisez les amorces et sondes suivantes : avant 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAATTTGG 3'; inverse 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonde 5' TCACCTCGCCTAATC 3'.<ol>
<li>Utilisez le génome du VHB contenant le plasmide (pAAV/HBV1.2) pour la courbe standard et effectuez un PCR en temps réel dans un volume total de 10 L (figure 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Configurez la réaction PCR dans un volume total de 10 L, comme le montre le tableau 1.</li>
		<li>Configurez le programme PCR dans le thermocycler comme indiqué dans le tableau 2. Le taux de transition de température programmé est de 20 oC/s pour la dénaturation/annealing et de 5 oC/s pour l'extension. Mesurer la fluorescence à la fin de la phase d'annexion pour chaque cycle pour la surveillance en temps réel de PCR.</li>
	</ol>

</li>
</ol>3. Réduction de la réplication du VHB par ACT des cellules virales iPSC-CD8 et T spécifiques à l'Ag
<ol><li>Transfert de cellules adoptives (ACT)<ol>
<li>Différencier les s183/iPSC (1.3.7) sur les cellules stromales OP9-DL1-DL4 en présence de mFlt-3L et de mIL-7 pendant 8 jours comme décrit dans la section 1.3.</li>
		<li>Le jour 22, recueillir les cellules iPSC-CD8et T de la plaque de 10 cm avec la trypsine, puis laver et resuspendre chaque plaque de 10 cm dans 10 ml de puisagsix frais. Ajouter les cellules à une plaque fraîche de 10 cm et retourner à l'incubateur pendant 30 min comme cela a été fait dans la section 1.3. Après 30 min, recueillir les cellules flottantes.</li>
		<li>Utilisez une passoire en nylon de 70 m pour passer les cellules afin d'éliminer les amas cellulaires et de compter le nombre de cellules. Adaptez les cellules à une concentration de 1,5 x 107 cellules/mL dans une solution PBS froide et utilisez une passoire en nylon de 70 m pour passer les cellules afin d'éliminer à nouveau les amas cellulaires si nécessaire. Maintenir les cellules sur la glace jusqu'à l'ACT.</li>
		<li>Injecter une suspension cellulaire de 200 ll (3 x 106 cellules) dans des souris HHD de 4 à 6 semaines par la veine de la queue.</li>
	</ol></li>
	<li>Induction de la réplication du VHB<ol>
<li>Le jour 14 après le transfert de cellules, effectuer la livraison hydrodynamique du plasmide de HBV par la veine de queue comme décrit dans la section 2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection de protéines virales provenant du foie infecté<ol>
<li>Sacrifier les souris les jours 3, 5, 7, 14 et 21 après l'infection. Pour l'euthanasie, dans chaque cage, utiliser 1 à 2 L de dioxyde de carbone (CO2) dans la première phase. Lorsque l'animal développe la perte de conscience, gagnez le débit de CO2 autour de 4 à 5 L/min. Effectuer l'euthanasie de la souris en utilisant l'inhalation de CO2.</li>
		<li>Séparer le foie en coupant la peau de surface du péritoine en utilisant des ciseaux et des forceps et en faisant glisser légèrement le foie vers l'arrière pour découvrir la peau interne qui tapisse la cavité péritonéale. Recueillir et couper les échantillons de foie (longueur x largeur x hauteur de 0,5 cm x 0,5 cm x 0,3 cm) des souris infectées pour s'adapter facilement dans la cassette d'intégration et bloquer dans la formaline tampon neutre de 10 % pendant 4 à 24 h.</li>
		<li>Décalcifier l'échantillon du foie en utilisant 2,5 M d'acide formique; rincer au xylène pendant 3 min, rincer 2x à 100 % d'éthanol, rincer 2x à 95 % d'éthanol, rincer 2x dans de l'eau désionisée (DI) pendant 2 min, puis décalciser les échantillons de foie dans 1 mM d'acide éthylènediaminetacetic (EDTA) en conséquence. Poignée à une température inférieure à l'ébullition (90 oC) pendant 20 min.</li>
		<li>Refroidir les tissus du foie fixe pendant 30 min. Rincer les tissus avec 1x PBS pendant 4 min et incorporer les tissus dans la paraffine. Déshydrater les tissus dans une série de concentrations croissantes d'éthanol pour remplacer l'eau, puis plonger dans l'immersion en xylène. Intégrez les tissus infiltrés dans des blocs de cire. Faire une section verticale et horizontale uniformément pour la coloration. Préparer des sections de 4 m avec un microtome coulissant.</li>
		<li>Passer les sections à travers la déparaffinisation et la réhydratation à l'aide de xylène et d'éthanol, puis effectuer la coloration immunofluorescente des sections.</li>
		<li>Tainer les sections avec 200 oL d'anticorps spécifiques à la surface HBV Ag (1:100 dilution dans la solution de blocage). Incuber les sections avec l'anticorps pendant 2 h à RT dans une chambre humidifiée de 75 % à 100 %, et laver 5x en 1x PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Utilisez un réactif anti-fade contenant 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire pour contrer les diapositives. Ajouter le bordereau de couverture avec environ 300 l de la solution de coloration Diluée DAPI (300 nM en 1x PBS) et valider l'ensemble du coverslip couvert. Maintenez les glissières dans l'obscurité à 4 oC jusqu'à l'inspection sous un microscope fluorescent.</li>
	</ol></li>
	<li>Infiltration de cellules inflammatoires chez les souris infectées<ol>
<li>Sacrifier les souris telles que décrites à l'étape 3.3.1. Recueillir le foie et faire des sections comme décrit à l'étape 3.3.4.</li>
		<li>Tainer la section avec de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) pour évaluer l'infiltration de cellules inflammatoires dans le foie.</li>
		<li>Conserver les diapositives dans l'obscurité à 4 oC jusqu'à une analyse plus poussée au microscope fluorescent.</li>
		<li>Visualiser les diapositives sous un microscope à fluorescence pour détecter l'infiltration de cellules inflammatoires dans le foie (Figure 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Détection d'ADN du VHB du foie infecté<ol>
<li>Isolement de l'ADN viral.</li>
		<li>Euthanasier les souris et prélever les échantillons de foie selon la section 3.3.</li>
		<li>Lyse les tissus hépatiques dans Nonindet P-40 (NP-40) tampon de lyse (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) contenant un cocktail inhibiteur de la protéase.</li>
		<li>Brièvement centrifugeuse à 16 000 x g pour enlever les noyaux et les débris cellulaires.</li>
		<li>Incuber le lysate cytoplasmique à la nucléase micrococcique (nucléane S7; 150 unités/mL) et CaCl2 (5 mM) à 37 oC pendant 90 min pour dégrader l'acide nucléique à l'extérieur des nucléocapdiens (NC).</li>
		<li>Inactiver la nucléase S7 par l'ajout de 10 mM EDTA.</li>
		<li>Précipiter les nucléocapdes avec du polyéthylène glycol (PEG), perturber de 0,5 % le sulfate de dodécyl de sodium (SDS) et digérer avec 0,6 mg/mL de protéinase K (PK) à 37 oC pendant 1 h.</li>
		<li>Récupérez les acides nucléiques viraux par extraction de chloroforme de phénol et précipitation d'éthanol.</li>
		<li>Résoudre l'ADN viral extrait sur un gel agarose de 1,2% et détecter par l'analyse standard de tache du Sud à l'aide d'une sonde d'ADN HBV32 P-étiquetée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole présente une méthode pour générer les iPSC-CTL virales spécifiques à ag pour une utilisation comme ACT pour supprimer la réplication du VHB dans un modèle de murine. Dans l'infection chronique de HBV, le génome viral forme un mini chromosome stable, l'ADN circulaire covalently fermé (cccDNA) qui peut persister tout au long de la durée de vie de l'hépatocyte. Cibler le dégagement du mini chromosome viral peut entraîner un traitement de l'infection chronique par le VHB. Le traitement antiviral actuel cible la ...

À la suite d'une infection aigue, le système immunitaire adaptatif (c.-à-d. l'immunité humoristique et cellulaire) contrôle la majeure partie de l'hépatite aigue liée au VHB. Pourtant, un certain nombre de personnes dans les régions où le VHB est endémique ne peuvent pas éliminer les virus et se convertir par la suite en tant qu'individus chroniques. Plus de 25 % des patients chroniques (250 millions de personnes dans le monde) développent une maladie hépatique progressive, entraînant une cirrhose du foie et/ou un carcinome hépatocellulaire (HCC)1. En conséquence, l'éradication des cellules infectées avec insistance reste un problème de santé générale, même s'il existe un vaccin2 disponible et de nombreux médicaments antiviraux sont en cours de développement. Le traitement standard de l'infection par le VHB comprend les analogues ifN-MD, nucléoside et nucléotide. Ces agents ont une activité antivirale directe et des capacités modulatrices immunitaires. Néanmoins, la séroconversion de l'antigène HBe (Ag)- porteurs avec anticorps anti-HBe (Ab) et la perte de sérum HBV acide désoxyribonucléique (ADN) apparaissent individuellement dans environ 20% des patients traités, et le contrôle immunologique entier du virus par la privation de la HBsAg n'est pas plus de 5%3. En outre, la réponse au traitement n'est souvent pas durable. La vaccination prophylactique avec les HBs Recombinants Ag est très efficace dans la prévention de l'infection, mais la vaccination thérapeutique HBs Ag n'est pas efficace. De toute évidence, les réponses immunitaires à médiation cellulaire T jouent un rôle essentiel dans le contrôle de l'infection par le VHB et de l'altération du foie; cependant, dans les patients chroniques d'hépatite, les cellules T HBV-réactives sont souvent supprimées, dysfonctionnelles, ou convertissentépuisé4,5,6. Par conséquent, chez les personnes atteintes d'une infection persistante au VHB, aucune tentative de rétablir l'immunité spécifique au VHB (c.-à-d. l'immunité à base de lymphocytes T) au moyen d'un remède antiviral, de cytokines immunomodulateurs ou d'immunisation curative n'a été efficace.
Le transfert de cellules adoptives (ACT) des lymphocytes T HBV Ag-spécifiques est un traitement efficace visant à éradiquer éventuellement les hépatocytes restants wih HBV7,8. L'ACT des CTL HBV-spécifiques dans les souris HBV-infectées a été montrée pour causer l'hépatite transitoire et douce, et une baisse dramatique des transcriptions d'acide ribonucléique de HBV (ARN) dans des hépatocytes. Dans ces études, les CTL n'ont pas inhibé la transcription des gènes du VHB, mais ont amélioré la dégradation des transcriptions du VHB9. Les CTL spécifiques au VHB sont importants pour prévenir l'infection virale et pour établir une médiation dans le déminage du VHB10,11. Pour les remèdes à base d'ACT, l'expansion in vitro des lymphocytes T spécifiques au VHB avec une forte réactivité pour la réinstallation in vivo a été suggérée comme une méthode idéale12,13,14; néanmoins, les approches actuelles sont limitées en ce qui concerne leurs capacités à générer, séparer et cultiver des quantités et des qualités appropriées de lymphocytes T spécifiques au VHB des patients pour les thérapies potentielles.
Bien que les essais cliniques présentent l'innocuité, la praticabilité et l'activité thérapeutique prospective des traitements à base de cellules au moyen de lymphocytes T conçus qui sont spécifiques aux hépatocytes infectés par le virus Du VHB, on s'inquiète des effets défavorables. se produisant des réponses autoimmunes en raison de la réactivité croisée du récepteur de cellule T de mauvais désespoir (TCR)15,16, reconnaissance hors cible d'Ag par TCR17 non spécifique et sur-cible hors-toxicité par un récepteur chimérique d'Ag (CAR) 18 ans, états-unis qui , 19 avec des tissus sains. Actuellement, les lymphocytes T génétiquement modifiés, qui n'ont qu'une persistance in vivo à court terme, sont généralement des lymphocytes T intermédiaires ou plus tard effecteurs. À ce jour, les cellules souches pluripotentes (CSP) sont la seule source disponible pour générer un grand nombre de cellules T naïves de type uniqueAg-spécifique 20,21,22,23. Les CSP induits (iPSC) sont simplement convertis à partir des cellules somatiques d'un patient grâce à l'utilisation de la transduction génique de plusieurs facteurs de transcription. En conséquence, les iPSC ont des caractéristiques similaires à celles des cellules souches embryonnaires (ESC)24. En raison de la flexibilité et de la possibilité pour la capacité infinie de se renouveler, en plus du remplacement de tissu, les traitements iPSC-basés peuvent être largement appliqués dans la médecine régénérative. En outre, les régiments sous-jacents iPSCs peuvent considérablement améliorer les thérapies cellulaires actuelles.
L'objectif global de cette méthode est de générer une grande quantité de CTL spécifiques au VHB à partir d'iPSC (c.-à-d. iPSC-CTL) pour l'immunothérapie à base d'ACT. Les avantages par rapport aux techniques alternatives sont que les iPSC-CTL spécifiques au VHB ont un tCR de type unique et un phénotype naïf, ce qui entraîne un développement plus de cellules T de mémoire après l'ACT. Il est démontré que l'ACT des iPSC-CTL spécifiques au VHB augmente la migration des cellules Fonctionnelles CD8et T dans le foie et réduit la réplication du VHB dans le foie et le sang des souris administrées. Cette méthode révèle une utilisation potentielle de l'iPSC-CTL virale spécifique à l'Ag pour l'immunothérapie du VHB et peut être adaptée pour générer d'autres cellules virales spécifiques à l'iPSC-T pour l'immunothérapie virale.

<table><tbody><tr><td>Souris HHD</td><td>Institut Pasteur, Paris, France</td><td></td><td>H-2 classe I knockout, souris transgéniques HLA-A2.1 (HHD)</td></tr><tr><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td> Banque <td>de cellules RIKEN</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>ATCC</td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pAAV/HBV1.2</td><td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hôpital universitaire national de Taïwan, Taïwan)</td><td></td><td>L’ADN du VHB construit</td></tr> des <tr><td>gènes TCR spécifiques de HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)</td><td>Dr Adam J Gehring (Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, Toronto, Canada)</td><td></td><td>Gènes TCR hybrides humains-murins restreints à l’A2 spécifiques de FLLTRILTI (V&alpha ; 34 et V&beta ; 28)</td></tr><tr><td>OVA257&ndash ; Gènes TCR spécifiques à 264</td><td>Dr. Dario A. Vignali (Université de Pittsburgh, PA)</td><td></td><td>Gènes TCR restreints H-2Kb spécifiques à SIINFEKL Anticorps</td></tr><tr><td>anti-CD3 (17A2) Anticorps Biolegend</td><td></td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44 (IM7) Anticorps</td><td>BD Pharmingen</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD8 (53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100732</tr><tr><td>Anti-IFN-&gamma ; (XMG1.2) anticorps</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TNF-a (MP6-XT22)</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-HBs</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampon de lyse</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Trieur de cellules Fusion</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td><td>Proimmune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>HRP Anti-souris Anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>Attention : Allergène, Carcénogène, Tampon</td></tr> de <tr><td>perméabilisation</td> toxique<td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade ; Montage anti-effacement en or avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

les lymphocytes t t spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du vhb chez les souris

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème de santé mondial. Avec plus de 350 millions de personnes touchées dans le monde, l'infection par le VHB demeure la principale cause de cancer du foie. Il s'agit d'une préoccupation majeure, en particulier dans les pays en développement. L'échec du système immunitaire à monter une réponse efficace contre le VHB conduit à une infection chronique. Bien que le vaccin contre le VHB soit présent et que de nouveaux médicaments antiviraux soient créés, l'éradication des cellules de réservoir de virus demeure un sujet de santé majeur. Décrit ici est une méthode pour la génération de l'antigène viral (Ag) -spécifiques CD8- lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (c.-à-d., iPSC-CTLs), qui ont la capacité de supprimer la réplication du VHB. La réplication du VHB est efficacement induite chez la souris par injection hydrodynamique d'un plasmide d'expression HBV, pAAV/HBV1.2, dans le foie. Ensuite, hBV surface Ag-spécifique souris iPSC-CTLs sont transférés d'adoption, ce qui supprime considérablement la réplication du VHB dans le foie et le sang ainsi que empêche l'expression HBV surface Ag dans les hépatocytes. Cette méthode démontre la réplication du VHB chez les souris après injection hydrodynamique et que les CTL viraux dérivés de cellules souches peuvent supprimer la réplication du VHB. Ce protocole fournit une méthode utile pour l'immunothérapie de HBV.

Comme indiqué ici, les cellules virales du VHB Ag-spécifiques iPSC-CD8t sont générées par un système de culture in vitro. Après l'ACT de ces cellules virales Ag-spécifiques iPSC-CD8- T supprimer considérablement la réplication du VHB dans un modèle de murine (Fichier supplémentaire 1). Souris iPSC sont transducés avec la construction rétrovirale MIDR codant un gène hybride homme-souris HBV TCR (HBs183-191-spécifique, s183), puis les iPSC transducés par gène sont co-cultiv...

Présenté ici est un protocole pour la suppression efficace de la réplication du virus de l'hépatite B (HBV) chez les souris en utilisant le transfert de cellules adoptives (ACT) de cellules souches dérivées des lymphocytes T spécifiques à l'antigène viral (Ag). Cette procédure peut être adaptée pour l'immunothérapie act-basée potentielle de l'infection de HBV.

Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le transfert cellulaire adoptif de la cellule T virale dérivée de l’iPSC pour une suppression efficace de la réplication du VHB chez la souris. Le principal avantage de cette technique est que les cellules T virales iPSC-dérivées d’antigène ont un récepteur unique de cellule T de type et phénotype naïf. Pour la différenciation des lymphocytes T iPSC CD8-positifs spécifiques au VHB, plaque s183 récepteur des lymphocytes T iPSC induits par gène sur un monocouche OP9-DL1/DL4 en milieu alpha-minimum complété par 20% sérum bovin fœtal et murine Flt3 ligand pour leur co-culture dans un incubateur de culture cellulaire.Surveillez régulièrement la co-culture pour évaluer la morphologie cellulaire. Le jour 28, enlever les cellules supernatantes et flottantes, et détacher les cellules adhérentes avec 0,25% trypsine. Lorsque les cellules se sont soulevées du fond du récipient de culture, arrêter la réaction enzymatique avec huit millilitres de milieu iPSC, et de recueillir les cellules par centrifugation.Resuspendez la pastille en 10 millilitres de milieu frais. Diluer les cellules à une cellule T CD8-positive dérivée de l’iPSC à quatre s183 rapport peptidique-pulsé de splenocyte pour une incubation de 40 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Au cours des sept dernières heures, ajouter quatre microlitres de brefeldine diluée A à la culture, pour bloquer les processus de transport pendant l’activation cellulaire.Tacher les cellules pour l’analyse cytométrique de flux des cytokines intracellulaires d’intérêt selon les protocoles standard. Pour l’administration hydrodynamique de plasmide de VHB par la veine de queue, diluer 10 microgrammes de plasmide de VHB dans un équivalent de 8% de la masse corporelle de PBS. Chargez le plasmide dans une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de 26 jauges et de 1/2 pouce par souris.Chauffer les souris HHD sous une lampe thermique pendant cinq minutes pour dilater les veines de la queue, et tirer soigneusement une souris dans un restrainer en plastique. Localisez une veine latérale dilatée de la queue au milieu du tiers de la queue et insérez l’aiguille parallèlement à la veine pour livrer tout le volume de plasmide dans la veine de la queue sur une période de trois à cinq secondes. Pour le transfert viral de cellules adoptives cd8-positives dérivées de l’iPSC, recueillez les lymphocytes T CD8-positifs iPSC le jour 22 de la culture comme démontré, et ensemencez les cellules sur un nouveau plat de culture cellulaire de 10 centimètres.Après 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, filtrer les cellules flottantes à travers une passoire en nylon de 70 micromètres, et compter les cellules viables. Diluer les cellules à 1,5 fois 10 à sept cellules par millilitre de concentration de PBS. Injectez 200 microlitres de cellules dans des souris HHD individuelles de quatre à six semaines, dans la veine de la queue comme nous venons de le démontrer.Le jour 14 après transfert cellulaire, effectuer une livraison hydrodynamique de plasmide de VHB comme démontré. Aux critères d’évaluation expérimentaux appropriés après l’infection, récoltez le foie de chaque animal infecté et coupez les foies en échantillons de tissus de 0,5 par 0,5 par 0,3 centimètre. Placez les échantillons dans de la formaline tampon neutre à 10 % pendant quatre à 24 heures, suivie de la décalcification en acide formique 2,5 molaire pendant six à 24 heures.Ensuite, rincez les échantillons de xylène pendant trois minutes, suivis de deux rinçages de deux minutes à 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol et d’eau déionisée. Après le dernier lavage à l’eau, décalcifier les tissus en EDTA d’un millimolaire à 90 degrés Celsius, suivi d’une incubation de 30 minutes à température ambiante. Lorsque le tissu a refroidi, rincer les échantillons dans PBS pendant quatre minutes, et utiliser du xylène et de l’éthanol pour déparaffiner et réhydrater les échantillons.Pour l’étiquetage immunofluorescent, tacher les sections avec 200 microlitres d’anticorps spécifiques aux antigènes de surface VHB pendant deux heures à température ambiante dans une chambre humidifiée à 75 à 100 %. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec cinq lavages de cinq minutes dans du PBS frais pour chaque lavage. Étiquetez les cellules avec DAPI selon les protocoles standard avant de monter les diapositives avec des coverslips pour l’imagerie par microscopie de fluorescence.Pour l’analyse immunohistochimique, tacher les sections avec l’hématoxyline et l’éosine selon les protocoles standard, et évaluer l’infiltration des cellules inflammatoires dans le foie par microscopie légère. L’analyse cytométrique de flux de la population CD8-positive CD8-positive iPSC-dérivée révèle que la transduction de récepteur de cellule T de HBV augmente considérablement la génération des cellules T CD8-positives s183-spécifiques virales. Après stimulation avec des splenocytes T-épuisés pulsés avec le peptide de s183, les lymphocytes T cd8 cd8 mono-positifs d’iPSC-dérivés produisent de grandes quantités d’interféron gamma, comme détecté par l’analyse cytométrique intracellulaire de flux et ELISA.Après l’infection par le VHB par injection hydrodynamique, la réplication de l’ADN atteint des sommets le sixième jour et diminue graduellement, comme l’observe l’analyse pcr en temps réel. De plus, la réplication virale est considérablement réduite à tout moment chez les souris qui reçoivent des cellules T antigéniques virales antigéniques du VHB par rapport aux souris qui reçoivent des cellules témoins. La protéine de surface du VHB est également considérablement diminuée chez les souris qui reçoivent des lymphocytes cytotoxiques pré-iPSC spécifiques aux antigènes du VHB par rapport aux souris traitées avec des cellules témoins, ce qui démontre clairement que les lymphocytes T cd8-positifs iPSC spécifiques aux antigènes viraux ont la capacité de réduire la réplication du VHB dans un modèle murin.Vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cellules T virales spécifiques aux antigènes de l’iPSC pour l’immunothérapie adoptive.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un rapide, protocole simple et rentable pour la génération de donateurs issus multivirus des CTL spécifiques (rctl) pour perfusion à allogéniques greffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) à risque de développer des infections à CMV, Adv ou EBV. Ce processus de fabrication est conforme aux BPF et devrait assurer la plus large mise en œuvre des cellules T immunothérapie delà des centres spécialisés.

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Suppression de la réplication du virus de l’hépatite B à l’aide de lymphocytes T spécifiques de l’antigène viral

Ce protocole décrit les méthodes de construction d’un modèle murin humanisé de moelle osseuse, de foie et de thymus avec une immunité artificielle à base de cellules souches contre l’infection par le VIH.

De cellules souches Basé Immunité Engineered contre l&#39;infection à VIH dans le modèle humanisé Souris

Ici, nous décrivons un protocole pour analyser le phénotype des cellules T régulatrices (Treg) isolées de souris naïves et chroniques infectées par le virus de la chorioméningite lymphoïde. De plus, nous proposons un processus pour évaluer l’activité suppressive des cellules Treg.

Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

Nous décrivons ici un virus nouvellement mis au point contre l'hépatite B (VHB) système rapporteur pour surveiller les premiers stades du cycle de vie du VHB. Cette simplifiée système in vitro aidera dans le criblage d'agents anti-VHB en utilisant une stratégie à haut débit.

Développement d&#39;un système de virus de l&#39;hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

Ce protocole décrit l’utilisation de la seule chaîne CMH de classe I complexes pour étudier les interactions moléculaires dans l’activation des lymphocytes T CD8 + humaine : des constructions de génération d’ingénierie antigène présentant des cellules exprimant la seule chaîne, culture de clone humain de cellules T CD8 + et les expériences d’activation des cellules T.

Utilisation de la technologie MHC seule chaîne d’enquêter sur les Co-agonisme dans l’Activation des cellules T humaines CD8 +

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) dans de nouvelles cellules 293T (293T-NE-3NR, exprimant des NTCP humains, HNF4α, RXRα et PPARα) et des cellules hépatiques traditionnelles (PleG2-NE, exprimant le NTCP humain).

Modélisation de l’infection par le virus de l’hépatite B dans les cellules non hépatiques 293T-NE-3NRs

Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du virus de l’hépatite B (VHB), les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont pu être évaluées parallèlement à l’identification des épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB.

Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique

Nous présentons un protocole pour dépister les composés anti-virus de l’hépatite B (VHB) ciblant les étapes du cycle de vie d’entrée pré et post-virale, en utilisant la calorimétrie de titrage isotherme pour mesurer l’affinité de liaison (KD) avec le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium de l’hôte. L’efficacité antivirale a été déterminée par la suppression des marqueurs du cycle de vie viral (formation d’ADNcc, transcription et assemblage viral).

Un modèle hépatocytaire compétent examinant l’entrée du virus de l’hépatite B par le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium comme cible thérapeutique

L’étude actuelle présente des protocoles permettant d’évaluer l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et de manipuler l’expression génique dans ces cellules.

Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

Découvrez le transfert adoptif de cellules iPSC dérivées en lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB pour supprimer la réplication virale chez la souris. Cette méthode offre une approche prometteuse en immunothérapie cellulaire.

Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris

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