Immunothérapie adoptive des cellules iNKT dans les souris de RA induites par l'isomérase de glucose-6-Phosphate (G6PI)

Ce protocole utilise des peptides mixtes G6PI pour construire des modèles de polyarthrite rhumatoïde qui sont plus proches de celui de la polyarthrite rhumatoïde humaine dans les cellules^T CD4 et cytokines. Des lymphocytes T tueurs naturels invariants de haute pureté (principalement iNKT2) avec des phénotypes et des fonctions spécifiques ont été obtenus par induction in vivo et purification in vitro pour l'immunothérapie adoptive.

Notre protocole décrit une méthode pour construire un modèle RA. Son taux de réussite est de plus de 93 pour cent et sa pathogénie dépend des cellules T, des cellules B et de l’immunité innée, ce qui permet aux chercheurs de mieux étudier la pathogénie de la PR d’un point de vue immunitaire mondial. Ensuite, nous utilisons des cellules INKT avec des effets immunomodulateurs pour leur traitement.

Les cellules INKT ont un bon effet sur le traitement par introduction in vivo qui fournissent un soutien de base des données pour l’application clinique des cellules INKT et explose vraiment la valeur d’application clinique des cellules INKT. Le plus grand avantage de cette technologie est qu’elle est simple à utiliser et facile à copier. Chen Shengde, Gao Xiang et Zhang Jingnan, étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, pesez 1,75 milligramme de HGPI325 à 339 et HGPI469 à 483 fragments et dissolvez-les en 5,25 millilitres de 4 degrés Celsius triple eau distillée. Dissoudre l’Adjuvant de Freund complet dans un bain d’eau de 50 degrés Celsius. Dessinez 5,25 millilitres dans un autre tube de centrifugeuse de 10 millilitres et refroidissez-le pour utilisation.

Mettez le mélange de solution HG6PI et de solution Adjuvant de Complete Freund dans une unité d’émulsification artificielle avec deux seringues en verre, connectées. Dans un bain de glace, poussez la seringue à une vitesse et une fréquence constantes de dix à vingt fois par minute pour émulsionner complètement la solution peptidique du mélange et compléter la solution Adjuvant de Freund. Ensuite, gardez les gouttelettes d’émulsion dans l’eau pendant dix minutes.

Ensuite, injectez 150 microlitres des HG6PI émulsifiés dans la racine de la queue de la souris sous-cutanée. Immédiatement et après 48 heures, injecter 200 milligrammes de toxine de coqueluche dans la souris intraperineally. Maintenant, injectez la souris normale DBA1 intraperineally sans le gausser à la posologie de 0.1 milligrammes par kilogramme de poids corporel.

Trois jours après la modélisation, après anesthésie, isoler la rate de la souris. Préparer une suspension à cellule unique en coupant et en broyant la rate dans un tamis de 200 mailles. Laver la suspension cellulaire avec PBS.

Centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Suspendre à nouveau les cellules avec un millilitre de solution de tissu sanguin entier. Ajouter trois millilitres de milieu de séparation des lymphocytes de souris.

Et puis centrifuger les cellules pendant 20 minutes à 300 fois g à température ambiante. Pour purifier les cellules INKT, résuspendez 10 à la septième cellule avec 100 microlitres de quatre degrés Celsius PBS, ajoutez 10 microlitres d’alpha gausser chargé cd1 tetramer PE et les incuber à 4 degrés Celsius pendant quinze minutes dans l’obscurité. Lavez les cellules deux fois avec PBS et résuspendez-les dans 80 microlitres de PBS.

Ajouter 20 microlitres de microbilles anti-PE et les incuber à quatre degrés Celsius pendant vingt minutes dans l’obscurité. Lavez-les deux fois avec PBS et résuspendez les cellules avec 500 microlitres de PBS. Placez la colonne de tri dans le champ magnétique du trieur MACS et rincez avec 500 microlitres de PBS.

Ajouter la suspension cellulaire préparée à la colonne de tri, recueillir le flux à travers, et rincer trois fois avec tampon PBS. Retirez le champ magnétique et ajoutez un millilitre de tampon PBS à la colonne de tri. Poussez rapidement le piston à une pression constante pour conduire les cellules étiquetées dans le tube de collecte.

Et obtenir les cellules INKT purifiées. Comptez avec un compteur de cellules automatisé. Pour identifier le phénotype cellulaire INKT, d’abord, prendre une fois dix à la sixième cellule des cellules INKT purifiées et les résuspendre dans 50 microlitres de PBS.

Ajoutez 0,5 microlitres de tétramer CD1 ALPHA gausser PE, ou 10 microlitres de bêta TCR FITC dans le tube de contrôle positif unique. Ajouter 0,5 microlitres de tétramer ALPHA gausser PE CD1, Ajouter 10 microlitres de bêta FITC TCR dans le tube de l’échantillon. Incubez-les à quatre degrés Celsius pendant trente minutes dans le noir.

Après cela, laver les cellules dans PBS, puis centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et ajoutez un millilitre de solution de travail de permeabilisation de fixation FoxP3. Et incuber les cellules pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de travail de 1x permeabilization et centrifugez les cellules à 500 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Jeter le surnatant. Ajouter un microlitre d’AlexaFluor 647 souris anti-PLZF et un microlitre de PerCP Cy5.5 souris anti-Tbet et incuber pendant trente minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution de travail tampon de perméabilisation et centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes pour le nettoyage. Jeter le surnatant. Resuspendez les cellules en 500 microlitres de PBS et mesurez par cytométrie d’écoulement.

Dans cette étude, comparée au groupe témoin, les bouts du groupe modèle de RA ont commencé à montrer le gonflement rouge après modélisation avec l’aggravation graduelle. À 14 jours, l’enflure rouge dans l’articulation de la cheville a culminé suivie d’un soulagement graduel. Les résultats pathologiques montrent que le degré d’infiltration des cellules inflammatoires dans le tissu synovial de cheville des souris modèles de RA était différent à différents stades.

L’inflammation maximale s’est produite le jour 14 après modélisation. Dans le groupe modèle de RA, les niveaux de sérum des cytokines pro-inflammatoires ont sensiblement augmenté 11 jours et 14 jours après modélisation. Tandis que les cytokines anti-inflammatoires ont sensiblement diminué.

Ce chiffre montre que le taux d’INKT2 chez les souris normales était d’environ cinq pour cent. Le taux d’INK2 était d’environ 82 pour cent après induction in vivo. Le taux d’INK2 était de plus de 92 pour cent après la purification du MACS.

Ici, nous montrons une méthode pour émulsionner le polypeptide majeur que nous voyons dans ra. Les gouttelettes émulsionnifiées sont conservées dans l’eau pendant 10 minutes. Les résultats se dispersent. Ce protocole est un nouvel add-on pour le traitement des cellules NKT spéciales soulevées par la PR.

Qui peut être appliqué vers l’immunothérapie cellulaire ou d’autres maladies auto-immunes et les tumeurs. Ce modèle peut stimuler la prolifération globale des lymphocytes T CD4 et des déficits des cellules NKT chez les patients atteints de PR, ce qui pose les bases d’une étude approfondie des voies immunitaires de la PR. Dans ce protocole, la toxine de coqueluche est injectée l’interperitoneally pendant la modélisation.

S’il vous plaît porter des vêtements expérimentaux et des gants jetables. Et porter toutes les normes de fonctionnement afin de prévenir les blessures au couteau une infection.