Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

Les petits ARN régulent de nombreux processus biologiques. Il est donc important de développer des méthodes sensibles et impartiales pour les détecter. Notre protocole prévoit des avancées vers cet objectif.

Notre protocole souffre de moins de problèmes de biais, que les méthodes classiques d’appropriation des petites bibliothèques d’ARN, et surtout il permet une détection plus sensible de deux dents ou méso-ARN. Comme les micro-ARN végétaux. Après avoir extrait l’ARN total selon les protocoles standard.

Pré-exécuter un gel d’urée 15%TBE pendant quinze minutes à 200 volts. Et mélanger cinq à vingt microgrammes d’ARN total, dans un volume de cinq à quinze microlitres, avec un volume égal de colorant de chargement de formamide dans un tube de 200 microlitres. Après cinq minutes à 65 degrés Celsius, dans un thermocycler avec couvercle chauffant, placez immédiatement les tubes sur la glace et chargez ce dernier et échantillonner sur le gel avec au moins une voie entre eux.

Ensuite, faire fonctionner le gel à 200 volts jusqu’à ce que le bromophénol a migré environ les deux tiers de la longueur du gel. Pour charger l’ARN, perforez d’abord le fond d’un tube de micro centrifugeuse sans nucléase de 0,5 millilitre, avec une aiguille de calibre 21, et placez le tube perforé dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres sans nucléase. Ensuite, incuber le gel à température ambiante avec des taches de gel d’acide nucléique dans l’eau pendant dix à quinze minutes, avant de regarder le gel sur un transilluminateur.

Découpez l’ARN échantillon entre 17 et 29 bandes d’échelle de nucléotide, et transférez le morceau de gel dans le tube perforé. Faites tourner le gel dans une micro centrifugeuse à vitesse maximale pendant deux minutes et retirez le tube de 0,5 millilitre qui doit maintenant être vide. Ajouter 300 microlitres de chlorure de sodium sans nucléase 0,3 molaire au gel concassé et placer le tube sur un rotateur pendant au moins deux heures à température ambiante.

À la fin de l’incubation, transférer la suspension des morceaux de gel concassé dans une colonne de spin et la centrifugeuse pendant deux minutes à vitesse maximale dans la micro centrifugeuse. Pour l’élimination non admissible de trois adaptateurs principaux, mélangez soigneusement dix microlitres d’eau sans nucléase avec l’échantillon extrait d’ARN, et ajoutez six microlitres de trois molaires d’acétate de sodium avec mélange. Ajouter 40 microlitres de perles de purification magnétique, et 60 microlitres d’isopropanol à l’échantillon avec un mélange complet.

Et incuber la suspension pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, placez l’échantillon sur un support magnétique, jusqu’à ce que la solution devienne claire. Retirer le supernatant clair et ajouter 180 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 80 % aux perles.

Après 30 secondes, retirer l’éthanol et faire tourner brièvement le tube. Retirer tout liquide résiduel qui aurait pu être recueilli au fond du tube et laisser sécher les perles pendant deux minutes avant de suspendre à nouveau l’échantillon dans 22 microlitres de Tris de 10 millimolaires. Après deux minutes magnétiser l’échantillon jusqu’à ce que la solution semble claire.

Ensuite, mélangez 20 microlitres de supernatant clair avec six microlitres de trois acétate de sodium molaire dans un nouveau tube, et ajoutez 40 microlitres de perles magnétiques et 60 microlitres de 100% isopropanol. Après cinq minutes à température ambiante, magnétiser l’échantillon jusqu’à ce que la solution semble claire, avant d’enlever le surnatant. Traitez l’échantillon avec 180 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 80 % pendant 30 secondes avant d’enlever l’éthanol qui tourne sur l’échantillon et d’éliminer tout liquide résiduel qui s’est accumulé au fond du tube.

Après avoir laissé sécher les perles pendant deux minutes, suspendez-les en 10 microlitres d’eau libre de nucléase, pendant deux minutes, avant de magnétiser l’échantillon jusqu’à ce que la solution devienne claire. Ensuite, transférez neuf microlitres de supernatant dans un nouveau tube et ajoutez un microlitre de tampon ligase d’ARN T4, et un micrcoliter d’eau à l’échantillon. Pour la purification du gel, exécutez cinq, dix et vingt microlitres de produit PCR sur un gel natif 6%TBE pendant environ une heure.

Incuber le gel complété avec de la tache de gel acide nucléique dans l’eau pendant dix à quinze minutes, et voir le gel sur un transilluminateur pour permettre l’extraction de la bande de bibliothèque de 150 paires de base. Comme il est difficile d’isoler la bande de 150 paires de base qui les représente, il s’agit de notre bibliothèque, en raison de la présence de produits secondaires à migration étroite, vous devrez couper le gel très soigneusement. Puis isoler l’ARN comme vient de le démontrer.

Pour la modification brute du fichier séquence, téléchargez les fichiers de séquence fastq générés pendant l’exécution de séquençage, et préformez le démultiplexing avec bcl2fastq2 au besoin. Supprimez les séquences d’adaptateur à l’aide de cutodapt et utilisez la commande comme démontré. Utilisez seqtk comme indiqué pour supprimer les nucléotides aléatoires terminaux dans les séquences lues.

Ensuite, utilisez la commande awk comme indiqué, pour jeter les séquences de moins de 10 nucléotides. Pour cartographier les séquences parées, ouvrez miRBase et téléchargez le fichier fa mature. Utilisez la commande comme indiqué pour remplacer les résidus de U par des résidus de T, pour donner une liste complète de tous les micro ARN dans la base de données, provenant d’une variété d’organismes.

Sélectionnez les séquences de micro ARN de l’organisme d’intérêt, avec la commande indiquée, et cartographiez les lectures du fichier à l’aide du nœud papillon2, ne permettant aucun décalage. Utilisez l’outil pour aligner les séquences lues à la base de données, exigeant qu’une lecture des cartes entièrement à un micro ARN de la base de données, avec toutes les inadéquations comme indiqué. Ensuite, utilisez la commande pour jeter les lectures qui ne s’alignent pas.

Après avoir chargé des quantités croissantes d’une bibliothèque amplifiée pcr sur un gel comme démontré, les produits correspondant à la taille prévue peuvent être extraits. Après l’éution, la bibliothèque purifiée peut être vérifiée sur une puce d’électrophoresis de gel capillaire. En plus des 150 paires de base prévues, et la proportion croissante d’une paire de 130 espèces correspondant à des dimers adaptateurs, sont généralement observés à mesure que la quantité croissante de produits PCR est chargée.

Des résultats similaires sont obtenus lorsque les bibliothèques d’un mélange de petits ARN synthétiques sont préparées à l’aide de réapprovisionnements provenant de kits ou d’autres fournitures. À titre de comparaison, les résultats précédemment publiés pour le même petit mélange d’ARN sont affichés. Ici, une comparaison pour l’exécution du protocole TS5 avec le protocole TS standard pour la détection de l’homme non modifié et deux principaux O-methal modifiés plantes micro ARN est montré.

La détection de deux piARN modifiés O-methal dans des échantillons humains a également été testée. Comme on l’a observé TS5 préformé significativement mieux que TS pour la détection de deux ARN O-methal premier, mais pas pour les ARN non modifiés. Préparez des bibliothèques de reproduction pour chaque échantillon à des dates différentes.

Habituellement, il y a peu de variation entre les répliques faites simultanément, ou il peut y avoir des variations substantielles entre les bibliothèques préparées à des dates différentes.