Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux
30 juillet 2019
Les pompes à efflux xénobiotiques sont très actives dans les cellules hématopoïétiques des tiges et des progéniteurs (HSPC) et provoquent l'extrusion de TMRM, un colorant fluorescent potentiel de membrane mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour mesurer avec précision le potentiel de membrane mitochondriale dans HSPCs par TMRM en présence de Verapamil, un inhibiteur de pompe d'efflux.
La fonction mitochondrique est critique pour l’auto-renouvellement hématopoïétique de cellules souches. L’activité mitochondriale est un réflecteur du potentiel de membrane mitochondrique interne, qui peut être mesuré par TMRM, un colorant cationique fluorescent et perméant de cellules. Les pompes d’efflux xénobiotiques sont très actives dans HSC, et causent l’extrusion de TMRM.
Le principal avantage de ce protocole, est la correction de cet effet, en utilisant Verapamil, un inhibiteur des pompes efflux. Commencez par isoler la moelle osseuse des fémurs de souris. Utilisez une paire de forceps et de ciseaux pointus pour couper les deux pattes postérieures.
Ensuite, faire un petit snip dans la peau ventrale de la souris, et l’étirer. Extraire le fémur et le tibia, tout en prenant soin de ne pas déloger les têtes du fémur, et placer les os dans une plaque de six puits, rempli de 1,5 millilitres de tampon de coloration. Retirez les muscles des os et coupez les extrémités des os, ce qui permet à la moelle osseuse de sortir.
Placez les os nettoyés dans de nouveaux puits, avec 1,5 millilitres de tampon de coloration. Ensuite, rincer la moelle osseuse avec une seringue de trois millilitres et une aiguille de calibre 25, jusqu’à ce que l’os devienne blanc. Recueillir toutes les cellules dans un tube de 1,5 millilitre, et les centrifuger pendant cinq minutes à 180 fois G, puis jeter le supernatant.
Resuspendez soigneusement la pastille dans 300 microlitres de tampon de lysing ACK froid de glace, et mettez les cellules sur la glace pendant une minute. Ensuite, désactivez immédiatement la lyse en ajoutant un millilitre de tampon de coloration. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 180 fois G.Resuspendre la pastille cellulaire, qui devrait apparaître blanc, dans un millilitre de tampon de coloration.
Filtrer les cellules à l’aide d’un bouchon de passoire cellulaire, avec un maillage en nylon de 35 micromètres, pour obtenir des cellules mononucléaires. Commencez par préparer le cocktail de lignée, et fluorophore anticorps conjugués, selon les instructions manuscrites. Gardez les anticorps sur la glace et protégez-les de la lumière.
Ensuite, centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 180 fois G, et jeter le supernatant. Ajouter 400 microlitres du cocktail de lignée, et quatre microlitres d’anticorps biotinylés CD135 à la pastille cellulaire, et vortex le mélange. Ensuite, incubez-le sur la glace pendant 30 minutes.
Après l’incubation, laver l’échantillon en ajoutant trois millilitres de tampon de coloration, en le faisant tourner pendant cinq minutes à 180 fois G et en jetant le supernatant. Ajouter ensuite 400 microlitres de solution d’anticorps et vortexer le mélange. Incubez-le sur la glace pendant encore 30 minutes, et répétez le lavage avec le tampon de coloration.
Pour préparer la solution de coloration TMRM, ajouter 2,2 microlitres de solution de stock TMRM, et 1,1 microlitres de Verapamil, à 1,1 millilitres de milieu de culture hématopoïétique sans sérum, avec thrombopoïétine et facteur de cellules souches. Resuspendez la moelle osseuse en un millilitre de la solution de coloration TMRM, vortex rapidement, et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Filtrer l’échantillon à l’aide d’un bouchon de passoire cellulaire, avec un maillage en nylon de 35 micromètres, pour éviter d’obstruer le cytomètre d’écoulement.
Ajoutez ensuite un microlitre de DAPI et procédez à la cytométrie d’écoulement. Exécutez l’échantillon de moelle osseuse et acquérez au moins un million d’événements. Ensuite, affichez les cellules mononucléaires de moelle osseuse vivantes dans une parcelle de bleu pacifique, pour identifier les fractions cd135 Lin-négatives et lin-positives.
Tracez la fraction lin-négative pour APC/Cy7 contre PE/Cy7 pour identifier l’ancêtre multipotent ou la fraction de MPP. Ensuite, tracez la fraction MPP pour APC contre PerCP/Cy5.5, pour identifier la cellule souche hématopoïétique ou la fraction HSC. Affichez la fraction HSC pour fitc, ou CD34, pour la diviser en fractions HSC négatives CD34 et CD34 positives HSC.
Enfin acquérir l’intensité TMRM dans chaque population. Pour s’assurer que la coloration tmrm a fonctionné correctement, ajouter un microlitre de FCCP à l’échantillon, pour une concentration finale d’un millimolaire, et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis acquérir un million d’événements.
Après l’ajout de FCCP, l’intensité de TMRM devrait être considérablement augmentée. Ce protocole a été utilisé avec succès pour quantifier le potentiel memitochondrial de membrane dans diverses populations cellulaires, avec le colorant de TMRM. Il a été démontré que la présence de PBS et de FBS dans le milieu de culture affecte l’intensité du signal TMRM.
Il est donc important d’effectuer la coloration TMRM dans le milieu d’expansion sans sérum. Les cellules souches hématopoïétiques expriment des niveaux d’activité élevés de pompes à efflux xénobiotiques qui extruder le colorant TMRM. Ainsi, les profils TMRM varient également en présence de Verapamil ou Cyclosporin H, qui bloquent les pompes.
Pour vérifier l’exactitude de la coloration TMRM, FCCP peut être de dépolariser les mitochondries, et de réduire l’intensité TMRM. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier HSC avec un colorant potentiel de membrane mitochondrique différent, y compris TMRE ou JC-1. Ainsi que d’autres dyes mitochondriques tels que MitoTracker ou MitoSOX.
Les questions critiques héritées par l’activité différente des pompes d’efflux parmi la population de moelle ont été soulignées seulement récemment. Ce protocole vise donc à réduire l’écart entre les résultats antérieurs.
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Aperçu
Cette étude examine le potentiel membranaire mitochondrial dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSHP) à l'aide du TMRM, un colorant fluorescent, ainsi que l'impact des pompes d'efflux de xénobiotiques. Un protocole est présenté, incorporant la vérapamil afin de mesurer précisément les niveaux de TMRM en inhibant ces pompes, permettant ainsi une évaluation fiable de la fonction mitochondriale.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Dynamique mitochondriale dans les cellules souches
- Mécanismes d'efflux cellulaires
- Mesure du potentiel membranaire
Contexte
- Importance de la fonction mitochondriale dans le renouvellement des cellules souches
- Problèmes posés par les pompes d'efflux dans les mesures au colorant
- Utilisation du TMRM comme indicateur du potentiel mitochondrial
Méthodes utilisées
- Isolation de la moelle osseuse chez les souris
- Cytométrie en flux pour l'analyse des populations cellulaires
- Inhibition des pompes d'efflux à l'aide de vérapamil
Résultats principaux
- Quantification réussie du potentiel membranaire mitochondrial dans les CSH
- Mise en évidence des effets du vérapamil sur la rétention de TMRM
- Adaptabilité du protocole à d'autres colorants mitochondriaux
Conclusions
- L'étude fournit une méthode fiable pour évaluer l'activité mitochondriale dans les cellules souches.
- Les résultats améliorent la compréhension de la biologie des cellules souches et des effets des agents pharmacologiques sur la fonction mitochondriale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation précise du potentiel de membrane mitochondrial dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques est essentielle pour comprendre l'auto-renouvellement des cellules souches et la régulation métabolique. L'activité des pompes d'efflux dans ces cellules peut fausser les mesures par colorants fluorescents, conduisant à des données biaisées qui affectent la validation des cibles et la fiabilité des modèles précliniques. Ce protocole remédie à une limitation technique majeure des tests basés sur la cytométrie en flux, améliorant la cohérence des données pour les applications de découverte et translationnelles ultérieures.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la fonction mitochondriale comme cible thérapeutique dans les cellules souches hématopoïétiques en réduisant les artefacts de mesure dus à l'efflux des colorants.
- Valeur opérationnelle : Facilite la comparaison cohérente des populations de cellules souches et progénitrices entre différents modèles expérimentaux en corrigeant la variabilité des transporteurs xénobiotiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes hématopoïétiques validés pour le criblage de composés en garantissant que les mesures du potentiel mitochondrial reflètent l'état biologique réel plutôt que l'activité d'efflux.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation des tests grâce à l'utilisation d'inhibiteurs des pompes à efflux comme le vérapamil dans les protocoles de marquage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la détection des risques mécanistiques en fournissant des données fiables sur l'activité mitochondriale liées aux voies de renouvellement des cellules souches.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en standardisant un paramètre fonctionnel clé à travers différents systèmes modèles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte en soutenant la vérification d'hypothèses en biologie des cellules souches et en permettant un profilage fonctionnel fiable avant les efforts d'identification de composés candidats.
- Biologie de la découverte : Facilite la validation des cibles mitochondriales et l'élucidation des voies dans les systèmes hématopoïétiques en réduisant les signaux faussement bas dus à l'extrusion des colorants.
- Triage : Fournit des mesures quantitatives et reproductibles du potentiel mitochondrial lorsque l'efflux est inhibé, améliorant ainsi la détection des effets des composés.
- Analytique : Génère des signaux lus par cytométrie en flux (intensité du TMRM) permettant de comparer les états métaboliques entre différentes fractions cellulaires et conditions de traitement.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques en fournissant une métrique transposable de la vitalité des cellules souches, corrélée à des résultats fonctionnels.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole de cytométrie en flux réutilisable pour évaluer la santé mitochondriale dans des modèles de cellules souches à travers plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les études sur les mécanismes des cellules souches en éliminant une source majeure de variabilité des tests.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des tests mitochondriaux dans les contextes de recherche hématopoïétique.
- Valeur stratégique : Permet de meilleures décisions « aller/ne pas aller » lors de la validation des cibles en réduisant les faux négatifs liés à l'efflux de colorant.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles cellulaires souches fondée sur des données fonctionnelles plus précises.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux, en isolement de cellules souches et en manipulation de colorants fluorescents.
- Dépend de l'accès au vérapamil ou à d'autres inhibiteurs des pompes d'efflux, ainsi qu'à des tampons de marquage compatibles.
- Exige une standardisation entre les équipes afin de garantir une durée d'exposition et une concentration d'inhibiteur cohérentes.
- Doit tenir compte des effets secondaires potentiels du vérapamil sur la viabilité cellulaire ou le métabolisme dans les cultures à long terme.
- Limité aux applications où le potentiel membranaire mitochondrial constitue un indicateur fonctionnel pertinent et où l'activité d'efflux est connue pour interférer.
