Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie
20 octobre 2019
Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.
Notre laboratoire se concentre sur le développement oculaire et les maladies. Ce protocole décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement de la tête de souris disséquée. Laissant les paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tous ensemble en un seul morceau. Le protocole bénéficiera aux ophtalmologistes qui s’intéressent à la didactique oculaire de surface. Je suis Dianlel Guo, pour dire la technique avec une lutte probable en essayant d’éviter l’endommagement du globe oculaire, tout en disséquant les os du visage. Le principal avantage de cette matière de dissection est que l’intégrité de la feuille épithéliale de surface oculaire est bien préservée et les différentes parties de la surface oculaire peuvent être examinées par histologie ou immunostaining dans une seule section. Assurez-vous de couper tous les petits os et débris des tissus mous. Raison, il causera des marques de cicatrices sur la section des tissus autrement. Après avoir euthanasié la souris, utilisez une paire de ciseaux droits pour couper la tête et la couper en deux le long de la ligne médiane sagittale à partir de l’os intrapariétal rostrally au nasal. Placer chaque moitié de la tête coupée en deux dans une boîte de Pétri propre et utiliser des ciseaux pointus pour couper la mâchoire et la langue. Libérez le nerf optique en le coupant du cerveau avant l’emplacement optique du chiasm. Et enlever tous les tissus cérébraux, y compris l’ampoule olfactive, qui est attaché à la paroi du crâne. Maintenant, tous les tissus restants auront tout le crâne et les os orbitaux associés au globe oculaire. Laver les parties restantes avec PBS pour nettoyer le sang et les débris de cheveux. Pré-fixer les tissus en les plaçant dans un tube de 50 millilitres contenant 4% de paraformaldéhyde et en les tournant à température ambiante. Une fois la préfixation terminée, lavez rapidement la tête disséquée en PBS trois fois pour éliminer davantage les poils cassés et les fixatifs. Placez le tissu dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et coupez le crâne en trois parties le long des plans indiqués dans la figure un du protocole de texte. Le globe oculaire et la douille sont cachés dans la partie centrale du crâne sous les os éthmoid, frontaux et maxillaires. Utilisez deux paires de forceps droits numéro quatre pour décoller l’os éthhoïde et exposer complètement les os frontaux et maxillaires. Ensuite, divisez géographiquement la surface du crâne en quatre zones. Insérez la pointe des forceps incurvés horizontalement dans chaque zone pour enlever les os maxillaires et frontaux séquentiellement. Après cela, les os lacrimaux et juridiques sous-jacents seront exposés. Enlevez les deux os et les muscles et graisses sous-cutanés associés entourant le globe oculaire. Couper le globe oculaire avec les paupières attachées et la peau dans un petit bloc carré pour réduire le volume des tissus et faciliter l’orientation du tissu lors de l’intégration. Placez le globe oculaire et les tissus associés dans 4% de paraformaldéhyde et continuer à fixer pendant la nuit à 4
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Aperçu
Ce protocole s'attache à une méthode d'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière et la surface oculaire intactes, préservant ainsi son anatomie pour des études anatomiques. La technique est particulièrement utile pour les ophtalmologistes souhaitant examiner les surfaces oculaires sans endommager les tissus délicats.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Développement oculaire
- Maladies oculaires
- Histologie et immunomarquage
Contexte
- Importance de la préservation de l'intégrité de la surface oculaire
- Difficultés liées à la dissection des yeux de souris sans dommage
- Applications pour l'enseignement ophtalmologique
Méthodes utilisées
- Retrait séquentiel des os crâniens et orbitaires
- Modèle murin
- Utilisation du paraformaldéhyde pour la fixation des tissus
Résultats principaux
- Le protocole préserve la feuille épithéliale de la surface oculaire pour un examen ultérieur
- Permet une analyse histologique ou par immunomarquage
- Démontre des techniques efficaces pour la dissection oculaire
Conclusions
- L'étude présente une méthode fiable pour isoler le globe oculaire de la souris avec les structures associées
- Importante pour les études liées à la santé oculaire et aux maladies de l'œil
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le maintien de l'intégrité de l'épithélium superficiel oculaire permet une évaluation parallèle de la conjonctive palpébrale, de la conjonctive bulbaire et de l'épithélium cornéen dans les modèles de maladie. Cette approche facilite la réduction des risques mécanistiques en permettant l'évaluation simultanée des modifications pathogénétiques dans les tissus interconnectés. Elle améliore la fiabilité prédictive des études précliniques nécessitant une architecture tissulaire intacte pour l'analyse histologique et l'immunomarquage.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en préservant les relations spatiales au sein de la feuille épithéliale de la surface oculaire.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques grâce à une préparation du tissu intacte, permettant un examen histologique parallèle des modifications liées à la maladie.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés avec une architecture de la surface oculaire préservée pour des analyses histologiques et des immunomarquages ultérieurs.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation des tests en minimisant la distorsion des tissus lors de la dissection, améliorant ainsi la reproductibilité entre les sections.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve l'intégrité du système pertinent pour la maladie, permettant une corrélation translationnelle des biomarqueurs entre les régions connectées de la surface oculaire.
- Valeur opérationnelle : Garantit la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en maintenant la morphologie tissulaire pour des coupes et analyses reproductibles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de biologie de la découverte en permettant la préparation de tissus intacts pour des analyses histologiques et des marquages immunohistochimiques qui soutiennent la validation d'hypothèses et la clarification des voies biologiques.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en préservant l'intégrité de la feuille épithéliale pour l'examen parallèle des régions conjonctivales et cornéennes.
- Dépistage : Améliore la préparation des tests grâce à une isolation reproductible des tissus, réduisant ainsi la variabilité lors de la section histologique.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives de variables dépendantes par immunomarquage et histologie sur des sections tissulaires intactes.
- Recherche translationnelle : Assure un lien entre la découverte et la continuité préclinique en maintenant l'architecture de la surface oculaire pour une évaluation pathologique cohérente.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité réutilisable de préparation de la surface oculaire dans divers modèles de maladies et campagnes de dépistage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à la préservation de l'architecture tissulaire, permettant l'analyse simultanée de plusieurs compartiments de la surface oculaire.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité grâce à un protocole de dissection constant, minimisant les dommages tissulaires et les artefacts de sectionnement.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'orientation (go/no-go) en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les modèles de maladies oculaires par l'évaluation de tissus intacts.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque rendue possible par des données histologiques et d'immunomarquage fiables provenant de préparations intactes de la surface oculaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de dissection microchirurgicale afin d'éviter les dommages tissulaires lors du retrait osseux.
- Dépend de ciseaux pointus et de pinces fines pour une séparation précise des os du crâne et de l'orbite par rapport aux tissus mous.
- Exige des protocoles de fixation standardisés utilisant du paraformaldéhyde afin de préserver l'intégrité tissulaire pour la coupe histologique.
- Requiert des ajustements spécifiques lors de l'application à différents systèmes modèles ou stades de développement.
- Limite pratique : l'efficacité de la procédure dépend du retrait complet des débris osseux afin d'éviter des artefacts lors de la coupe.
