Name: Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour lexamen histologique et limmunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Apprenez à isoler le globe oculaire intact de souris avec paupières et surface oculaire préservés pour analyses histologiques et immunohistochimie. Cette technique permet d'étudier l'épithélium oculaire sans dommage tissulaire.

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Les auteurs remercient le professeur Rong Ju pour la lecture critique du manuscrit, et tous les membres du laboratoire pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, Chine), le Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), « Plan 100 personnes » de l'Université Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), et le financement de la recherche du State Key Laboratory of Ophthalmology du Zhongshan Ophthalmic Center (30306020202400339; Guangzhou, province du Guangdong, Chine).

Toutes les procédures impliquant l'utilisation de souris ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux, zhongshan Ophthalmic Center, et ont adhéré à l'énoncé ARVO pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Dissection du globe oculaire avec la surface oculaire intacte et les paupières
<ol><li>Disséquer la tête.<ol>
<li>Euthanasier les souris postnatales 10 (P10) et P28 (voir le Tableau des matériaux pour les souches de souris) par luxation cervicale, couper la tête du cou par une paire de ciseaux pointus.</li>
		<li>Tête de bisect avec une paire de ciseaux droits le long de la ligne médiane sagittale commençant à l'os interpariétal rostalement au nasillard (Figure 1A,B). REMARQUE: L'os du crâne durcit avec le vieillissement de la souris, attention à garder les ciseaux de coupe le long de la ligne médiane autant que possible.</li>
		<li>Placer chaque moitié de la tête coupée dans un plat Petri propre, couper la mâchoire et la langue d'abord à l'aide de ciseaux pointus. Libérez le nerf optique en le coupant du cerveau avant l'emplacement du chiasme optique, et enlevez tous les tissus cérébraux, y compris l'ampoule olfactive attachée à la paroi du crâne.</li>
		<li>Maintenant, les tissus restants doivent avoir tous les os du crâne / orbitale associée à la globe oculaire (Figure 1C,D). Laver la partie restante avec PBS pour nettoyer le sang et les débris de cheveux.</li>
		<li>Préfixe des tissus avec 4% de paraformaldéhyde (PFA, en saline tamponnée de phosphate [PBS], pH 7.4) dans un tube conique de 50 ml à température ambiante (RT) avec rotation. Le temps de fixation approximatif est le suivant : 10 min pour P0 à P7 ; 20 min pour P8 à P28; et 30 min pour P29 et plus. REMARQUE : La préfixation offre la rigidité de tissu rendant la dissection suivante plus facile. En outre, la préfixation évite de laisser les tissus frais non fixés trop longtemps avant que la dissection soit terminée. CAUTION: PFA est dangereux et doit être manipulé avec soin.</li>
	</ol></li>
	<li>Enlever le crâne/les os orbitaux.<ol>
<li>Après la préfixation, lavez rapidement la tête disséquée dans PBS trois fois pour éliminer davantage les poils cassés et les fixatifs afin de procéder à une dissection ultérieure. CAUTION: L'exposition aux fixatifs pendant la dissection peut être préjudiciable à la santé.</li>
		<li>Placez le tissu dans un plat Petri de 10 cm, coupez le crâne en trois parties le long des plans indiqués dans la figure 1D, E. Le globe oculaire dans la douille est caché dans la partie centrale du crâne sous les os éthmoïdes, frontaux et maxillaires (Figure 1D,E).</li>
		<li>Utilisez deux paires de forceps droits no 4 pour décoller l'os éthmoïde afin d'exposer pleinement les os frontaux et maxillaires (Figure 1F).</li>
		<li>Diviser géographiquement la surface du crâne (y compris les os maxillaires et les os frontaux) en 4 zones (figure 1F). Insérer l'extrémité des forceps incurvés horizontalement dans chaque zone pour enlever les os maxillaires et frontaux de façon séquentielle (Figure 1F). REMARQUE : Les os maxillaires ne peuvent pas tous être enlevés en même temps. Disséquez patiemment les pièce par pièce. L'os frontal est directement relié au globe oculaire par des tissus conjonctifs mous. Soyez prudent lorsque vous le retirez du globe oculaire pour éviter d'étirer le globe oculaire et d'endommager la conjonctive.</li>
		<li>Après l'ablation de l'os maxillaire partiel et de tous les os frontaux, les os lacrymaux et jugal sous-jacents seraient exposés (Figure 1G). Enlever les deux os et les muscles sous-cutanés et les graisses qui entourent le globe oculaire, couper le globe oculaire avec les paupières et la peau attachées dans un petit bloc de forme carrée pour réduire le volume des tissus et faciliter l'orientation du tissu lors de l'intégration(figure 1 H).</li>
		<li>Placez le globe oculaire et les tissus associés dans 4 % de PFA et continuez à fixer toute la nuit à 4 oC. Le tissu fixe peut être conservé pendant au moins un mois à 4 oC en PBS avec l'ajout de 0,02% NaN3. Alternativement, procéder à l'analyse histologique immédiatement. REMARQUE : Si le tissu doit être stocké pendant de plus longues périodes, il peut facilement être stocké dans 70% d'éthanol.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse histologique
<ol><li>Section de paraffine et hématoxylin et éosine (H et E) coloration<ol>
<li>Suivez le protocole standard décrit ailleurs9 pour effectuer l'encastrage et la sectionnement de paraffine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunohistochimie (IHC)<ol>
<li>Décire les sections de paraffine avec xylène et réhydrater les sections par série d'alcool (100%, 95%, 80%) dans l'eau distillée (dH2O).</li>
		<li>Effectuer la récupération d'antigène par le traitement par micro-ondes des diapositives de tissu dans un tampon d'acide citrique de 0,01 M (3 g de citrate trisodique, 0,4 g d'acide citrique par 1 L double distillé H2O) dans un pot de glissière en verre à faible puissance (120 W). L'énergie doit être livrée par intermittence pendant un total de 5-10 min avec chaque intervalle d'une durée d'environ 2 min. REMARQUE : Le micro-ondes de haute puissance ou le chauffage constant conduirait au détachement des sections de tissu de la glissière.</li>
		<li>Choisissez les diapositives dans un bocal en verre, essuyez soigneusement le liquide résiduel entourant chaque section à l'aide de tissus faciaux et placez-les sur le porte-diapositives dans une boîte d'histologie. Dessinez un carré autour de chaque section avec un stylo histologique imperméable à l'eau. Placer 100 l de tampon de blocage (0,1 % de triton X-100 et 10 % de sérum d'âne dans 1 x PBS) sur chaque carré, et couver pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution de blocage avec le vide, ajoutez l'anticorps primaire (voir le tableau des matériaux)avec la dilution désirée dans le tampon de blocage, et continuez à couver les diapositives à 4 oC pendant 24 h ou plus. REMARQUE : La concentration de chaque anticorps primaire utilisé pour le CSI varie et doit être testée dans le le but d'effectuer des expériences pilotes.</li>
		<li>Laver les lames de tissu avec pBST (0,1% Triton en PBS) trois fois, pendant 10 min chacun. Répétez l'étape 2.2.4 à l'aide de l'anticorps secondaire (voir Tableau des matériaux) avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) remplaçant le tampon de blocage. Continuer à couver pendant au moins 4 h ou plus à température ambiante (RT).</li>
		<li>Retirer l'anticorps secondaire, laver les sections de tissu avec la solution PBST trois fois, pendant 10 min chacun, puis laver avec du PBS propre pendant encore 5 min.</li>
		<li>Essuyez les sections résiduelles de PBS entourant les tissus, montez les couvertures sur les sections avec le milieu de montage. Effectuer une microscopie fluorescente pour obtenir des images (voir le Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li>
<li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Immunology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li>
<li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li>
<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+of+the+conjunctiva%3A+A+review+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li>
<li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li>
<li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta%2Factivin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li>
<li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li>
<li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+%28PLTP%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Un rappel critique pour la préparation du globe oculaire intact est que tous les os orbitaux doivent être enlevés complètement, en particulier les os juga et lacrimal, qui sont petits et situés près du fond de la douille oculaire. Les os restants peuvent compliquer l'histologie qui s'ensuit. Dans le cas où un petit morceau d'os n'a pas été complètement enlevé de la dissection par accident, il peut être choisi à partir du bloc de paraffine d'emcasterie utilisant une paire de sharptweezers. Le trou laissé derrière doit êtr...

La surface oculaire se compose d'une feuille continue d'épithélium régionalisé comprenant la conjonctive palpébrale, la conjonctive bulbar et la cornée1. Beaucoup de structures glandulaires sont associées à l'épithélium de surface oculaire et génèrent ensemble une couche de film lacrymal protégeant la surface de cornée du séchage et des invasions environnementales2. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Les facteurs génétiques et les irritants environnementaux ou leurs interactions contribuent à des altérations pathologiques de l'OS3,4. En conséquence, une variété de modèles animaux génétiquement modifiés et d'origine physique ou chimique ont été utilisés pour étudier les processus de la maladie de l'OS humain.
La structure et la fonction de l'OS de souris est similaire à celle des humains à bien des égards. Les composants du film lacrymal sécrétépar par les glandes oculaires sont également similaires entre les souris et les humains. Une multitude d'études a été menée à l'aide de modèles murins pour élucider les mécanismes des maladies humaines OS5,6,7. Dans de nombreuses occasions, il est essentiel d'analyser les changements moléculaires globaux au lieu des changements moléculaires locaux de l'OS pour obtenir des informations complètes sous le même traitement expérimental. Par conséquent, la préparation de l'échantillon avec une bonne intégrité est nécessaire pour s'assurer que chaque partie du système d'exploitation doit être analysée simultanément.
Le système d'exploitation de souris s'associe étroitement avec le globe oculaire qui a été incorporé dans la prise/orbite d'oeil (une tasse osseuse faite de plusieurs os différents de crâne) et se connecte à lui par des tissus conjonctifs minces. Il existe d'énormes défis pour disséquer toute la surface oculaire sans endommager la conjonctive palpébrale ou bulbe. Ces défis descendent de: (i) l'OS est doux et mince et apposé sur les paupières et les globes oculaires physiquement séparés mais mobiles, donc vulnérables pour la distorsion et les dommages; et (ii) l'espace limité entre les os orbitaux et le globe oculaire limitent les opérations de dissection. Les défis sont beaucoup plus grands pour la souris adulte. Chez la souris embryonnaire, l'ossification orbitale osseuse n'est pas complète et les tissus environnants sont relativement lâches8. La tête peut être enlevée et coupée en deux, puis directement soumise à la fixation du paraformaldéhyde (PFA) et à l'intégration9. En revanche, les os orbitaux postnatals et adultes de souris sont entièrement ossifiés avec les tissus environnants épais, rendant la pénétration des fixatifs moins efficace. En outre, les os orbitaux/crâne sont durs et cassants, facilement cassés en les sectionnant dans les composés mous d'embedding tels que la paraffine. Les morceaux cassés d'os déchireront unanimement les tissus voisins ayant pour résultat la morphologie inférieure de tissu.
Beaucoup d'études éditées ont souvent montré la surface oculaire partielle, qui peut être suffisante pour leurs buts particuliers de recherche10,11. Un examen brut des littératures a trouvé seulement peu d'études montrant la surface oculaire intacte entière étant démontrée sans description détaillée des protocoles de dissection12,13. Dans ce protocole, nous avons détaillé une méthode de dissection pour obtenir la surface oculaire postnatale intégrale, dans laquelle les os orbitaux et de crâne ont été ordonnés enlevés, laissant la surface oculaire intacte avec le globe oculaire et les paupières, minimisant les dommages physiques. Nous avons examiné en outre l'histologie d'OS et avons exécuté l'immunohistochimie utilisant les sections de tissu préparées avec ce protocole.

<table><tbody><tr><td>1& fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>FG701-01</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 50ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope adhésives</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Concentration suggérée 1:500 - 1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Concentration suggérée 1:500 - 1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-K12</td><td>Abcam</td><td>ab124975</td><td>Concentration suggérée 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-K14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Concentration suggérée 1:800</td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinces courbes</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à dissection.</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Supports de montage</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection ciseaux-lame droite</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>Fours à micro-ondes</td><td>Galanz</td><td>P70D20TL-D4</td><td></td></tr><tr><td>Souches de souris</td><td>C57/BL6 et Sv129 mixtes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N° 4 pince droite</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978-6</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Divers</td><td></td><td>Préparez une solution à 4 % en 1& fois ; PBS et filtre avec 0,45&mu ; m membrane filtrante</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBW6818</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de intact globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

La surface oculaire (OS) se compose d'une feuille épithéliale avec trois parties reliées : conjonctive palpébrale, conjonctive bulbar et épithélium cornéen. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Dans les modèles animaux expérimentaux avec certaines modifications génétiques ou opérations artificielles, il est utile d'examiner toutes les parties de la feuille épithéliale OS pour évaluer les changements pathogénétiques relatifs de chaque partie en parallèle. Cependant, la dissection du tissu d'OS dans son ensemble sans distorsion ou dommages a été difficile, principalement en raison de la douceur et la minceur de l'OS apposé sur les paupières physiquement séparées mais mobiles et globe oculaire. En outre, la douille oculaire profonde formée par le crâne dur / os orbitaux est entièrement occupé par le globe oculaire laissant un espace limité pour l'exploitation des dissections. En conséquence, la dissection directe du globe oculaire avec les tissus associés os du côté facial conduirait souvent à des dommages de tissu, particulièrement la conjonctive palpébrale et bulpale. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement d'une tête de souris coupée en deux, laissant des paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tout à fait en une seule pièce. L'intégrité de la feuille d'OS était bien préservée et pouvait être examinée par histologie ou immunostaining dans une seule section.

Les principaux os du crâne vus sous différents angles ont été illustrés dans la figure 1A-E, avec des couleurs dénotant différents os. Nous avons utilisé un animal de quatre semaines pour la démonstration des processus de dissection. Après les étapes de dissection 1.1.1-1.1.3 et une préfixation courte (étape 1.1.4), le globe oculaire avec les os faciaux associés sont démontrés dans la figure 1E. ...

Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.

Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Notre laboratoire se concentre sur le développement oculaire et les maladies. Ce protocole décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement de la tête de souris disséquée. Laissant les paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tous ensemble en un seul morceau. Le protocole bénéficiera aux ophtalmologistes qui s’intéressent à la didactique oculaire de surface. Je suis Dianlel Guo, pour dire la technique avec une lutte probable en essayant d’éviter l’endommagement du globe oculaire, tout en disséquant les os du visage. Le principal avantage de cette matière de dissection est que l’intégrité de la feuille épithéliale de surface oculaire est bien préservée et les différentes parties de la surface oculaire peuvent être examinées par histologie ou immunostaining dans une seule section. Assurez-vous de couper tous les petits os et débris des tissus mous. Raison, il causera des marques de cicatrices sur la section des tissus autrement. Après avoir euthanasié la souris, utilisez une paire de ciseaux droits pour couper la tête et la couper en deux le long de la ligne médiane sagittale à partir de l’os intrapariétal rostrally au nasal. Placer chaque moitié de la tête coupée en deux dans une boîte de Pétri propre et utiliser des ciseaux pointus pour couper la mâchoire et la langue. Libérez le nerf optique en le coupant du cerveau avant l’emplacement optique du chiasm. Et enlever tous les tissus cérébraux, y compris l’ampoule olfactive, qui est attaché à la paroi du crâne. Maintenant, tous les tissus restants auront tout le crâne et les os orbitaux associés au globe oculaire. Laver les parties restantes avec PBS pour nettoyer le sang et les débris de cheveux. Pré-fixer les tissus en les plaçant dans un tube de 50 millilitres contenant 4% de paraformaldéhyde et en les tournant à température ambiante. Une fois la préfixation terminée, lavez rapidement la tête disséquée en PBS trois fois pour éliminer davantage les poils cassés et les fixatifs. Placez le tissu dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et coupez le crâne en trois parties le long des plans indiqués dans la figure un du protocole de texte. Le globe oculaire et la douille sont cachés dans la partie centrale du crâne sous les os éthmoid, frontaux et maxillaires. Utilisez deux paires de forceps droits numéro quatre pour décoller l’os éthhoïde et exposer complètement les os frontaux et maxillaires. Ensuite, divisez géographiquement la surface du crâne en quatre zones. Insérez la pointe des forceps incurvés horizontalement dans chaque zone pour enlever les os maxillaires et frontaux séquentiellement. Après cela, les os lacrimaux et juridiques sous-jacents seront exposés. Enlevez les deux os et les muscles et graisses sous-cutanés associés entourant le globe oculaire. Couper le globe oculaire avec les paupières attachées et la peau dans un petit bloc carré pour réduire le volume des tissus et faciliter l’orientation du tissu lors de l’intégration. Placez le globe oculaire et les tissus associés dans 4% de paraformaldéhyde et continuer à fixer pendant la nuit à 4

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L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.

Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Cet article présente un protocole pour la microdissection oculaire chez les rongeurs. Le processus implique l’énucléation du globe oculaire avec la membrane nictitante (c’est-à-dire la troisième paupière). Ceci est ensuite suivi par la séparation des cupules postérieures et antérieures.

Microdissection de l’œil de rongeur

Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Une macroscopie approfondie et une section standardisée des globes non néoplasiques sont importantes pour obtenir des coupes histopathologiques reproductibles de haute qualité. Des lignes directrices pour une macroscopie normalisée des globes non néoplasiques adultes et fœtaux sont fournies ici. Différentes options de coupe de globe sont présentées et discutées, y compris les critères de prise de décision au cas par cas.

Grossissement de globes non néoplasiques, y compris les yeux fœtaux

Cette étude présente une méthodologie pour l’administration de produits thérapeutiques dans la rétine et les nerfs optiques du rat adulte. De plus, une méthode unique de prélèvement tissulaire est introduite pour une collecte descendante en bloc du nerf optique et de la rétine chez un rat adulte.

Administration thérapeutique oculaire et prélèvement tissulaire avancé chez le rat adulte

Apprenez à isoler le globe oculaire intact de souris avec paupières et surface oculaire préservés pour analyses histologiques et immunohistochimie. Cette technique permet d'étudier l'épithélium oculaire sans dommage tissulaire.

Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour lexamen histologique et limmunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie

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