Une méthode in situ à haut débit pour l’estimation de la ploidy nucléaire hépatocyte chez les souris

Cette méthode permet à l’utilisateur de générer un profil de la teneur en ADN nucléaire des hépatocytes à partir de sections de tissus 2D pour l’étude du développement du foie, la régénération et les maladies chroniques. Cette approche automatisée à haut débit peut être appliquée à toutes les sections de tissu hépatique 2D, fournissant une lecture calibrée interne du stratagème nucléaire pour tous les noyaux circulaires simples d’hépatocyte. Les changements dans le stratagème nucléaire d’hepatocyte sont associés au vieillissement, à la maladie hépatique chronique, et au cancer.

Cette technique fournit un moyen simple de profiler le stratagème nucléaire dans des spécimens de foie fixes ou cryopréservés. Les méthodes in situ de profilage des stratagèmes ont un potentiel considérable en tant que recherche et outils cliniques pour suivre la progression des maladies du foie, car elles n’exigent pas la déségrégation des tissus ou l’accès à des matériaux frais. Après la récolte de l’échantillon de tissu hépatique murin, intégrer le lobule hépatique dans un cryomold à température de coupe optimale rempli moyen et placer immédiatement le moule sur la glace sèche pour assurer une congélation rapide.

Pour obtenir des tranches de l’échantillon de lobule de foie congelé, sectionnez l’échantillon à une épaisseur de six micromètres, en plaçant une glissière en polyamide étiquetée sur chaque échantillon pendant cinq secondes pour laisser chaque échantillon coller à la diapositive. Lorsque toutes les tranches ont été prélevées, laissez les échantillons s’équilibrer pendant trois à cinq minutes à température ambiante avant l’immunolabeling. À la fin de l’équilibrage, fixer les sections tissulaires dans un capot de fumée avec un millilitre de 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes à température ambiante.

À la fin de la fixation, rincer les toboggans avec trois lavages de trois minutes dans PBS avec une agitation douce. Après le dernier lavage, séchez la zone autour de chaque section tissulaire et utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de chaque échantillon. Pour imprégner les échantillons, traitez les sections avec un surfactant non ionique de 0,5 % dans PBS pendant 15 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver les échantillons pendant trois minutes en PBS deux fois avec une agitation douce comme démontré avant de bloquer la liaison non spécifique avec une solution filtrée de 1% albumen sérum bovin, 5% sérum cheval, et 0,2% surfactant non ionique dans PBS pendant au moins une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les glissières avec l’anticorps HHF4-alpha dilué dans le tampon bloquant pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humide de coloration protégée de la lumière. Le lendemain matin, lavez les glissières quatre fois en PBS avec une légère agitation avant l’incubation avec un anticorps secondaire conjugué à fluorescence approprié et Hoechst dilué dans un albumen de sérum filtré à 1% bovin et un surfactant non ionique de 0,2% dans le PBS pendant deux heures à température ambiante dans une chambre humide à coloration protégée de la lumière.

À la fin de l’incubation, laver les toboggans quatre fois comme démontré, suivi de deux lavages de trois minutes dans de l’eau distillée double avec une agitation douce. Après le dernier lavage, monter les échantillons avec deux gouttes de fluorescence montage moyen sur un coverslip et appliquer une pression douce si nécessaire pour éliminer les bulles. Ensuite, vérifiez les diapositives à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel pour assurer une bonne fixation et immunolabeling.

Pour l’acquisition d’images de fluorescence, définissez les paramètres sur une plate-forme d’imagerie à haute teneur pour acquérir des images de fluorescence en utilisant l’excitation appropriée pour les fluorophores utilisés. Puis numérisez des échantillons pour obtenir suffisamment d’images pour obtenir une couverture complète de la section tissulaire. À la fin de l’analyse, ajuster les paramètres de segmentation nucléaire du logiciel pour s’assurer que les noyaux sont séparés de façon optimale et modifier l’intensité du seuil afin d’assurer un gating optimal des hépatocytes HNF4-alpha positifs et des cellules non parenchymales négatives HNF4-alpha.

Pour la quantification nucléaire, placez la zone nucléaire en micromètres carrés à partir de la coloration Hoechst, de l’intensité nucléaire principale de Hoechst, du facteur d’allongement nucléaire, de l’indice moyen de rondeur nucléaire, du statut HNF4-alpha et des coordonnées nucléaires X, Y basées sur le centre de gravité. Pour effectuer une analyse du stratagème nucléaire hépatocyte, téléchargez et installez d’abord le programme d’analyse de quantification des stratagèmes. Dans MATLAB, accédez à l’onglet App de la bande d’outils et cliquez sur Installer l’application.

Ouvrez le programme Ploidy Application ML App Install. Un message semble confirmer le succès de l’installation. Dans chaque fichier d’analyse de données, inclure une feuille appelé, Mesures cellulaires, contenant toutes les données requises pour l’analyse du stratagème énoncée dans les colonnes comme indiqué.

Pour chaque condition expérimentale, fournir un ensemble de données de contrôle qui sera utilisé pour calculer le contrôle interne pour deux à quatre N étalonnage du stratagème nucléaire. Pour les répliques biologiques, stockez chaque feuille de calcul dans son propre dossier, en nommant le dossier préfixe progressivement. Ensuite, lancez l’application Ploidy.

L’interface utilisateur graphique de l’application Ploidy apparaîtra. Cliquez sur le bouton Path to Control Data pour naviguer vers le dossier dans lequel résident les données de contrôle. Ce chemin de données apparaîtra alors dans l’interface.

Dans Le Préfixe du dossier, tapez le nom à donner aux fichiers de sortie. Cliquez sur le bouton Chemin vers d’autres données et accédez au dossier dans lequel résident les données comparatives. Ce chemin de données apparaîtra alors dans l’interface.

Cliquez ensuite sur Exécuter. Lorsque l’analyse est terminée, la barre d’état lira l’analyse complète. Après l’immunolabeling, il est important de vérifier toutes les diapositives par microscopie conventionnelle de fluorescence pour confirmer qu’une fixation et une coloration de bonne qualité ont été obtenues.

Le frottis ou le brouillage du colorant Hoechst peut indiquer une fixation inadéquate ou une dégradation de l’échantillon avant la fixation. La ségrégation nucléaire et les paramètres du seuil HNF4-alpha devraient être soigneusement optimisés avant l’analyse automatique de l’image afin de refléter largement le modèle visuel de l’immunostaining observé par microscopie par fluorescence. Après analyse d’image, les données devraient refléter le nombre croissant de cellules non parenchymales et la petite, mais significative, réduction des nombres positifs de noyaux HNF4-alpha dans le foie avec des dommages de DDC.

Dans les foies sains de contrôle, approximativement 63%de noyaux positifs HNF4-alpha montrent une morphométrie circulaire simple. La comparaison du stratagème nucléaire relatif entre le contrôle et les groupes traités par DDC devrait refléter une perte significative des noyaux d’hépatocyte de 2C et de 4C avec des dommages avec le nombre accru de plus de cellules de 8C. Les informations relatives sur la position de chaque sous-groupe de stratagème peuvent être interrogées en récupérant l’emplacement 2D de sous-ensembles d’hépatocytes particuliers dans le logiciel d’analyse d’images à contenu élevé.

L’immunolabeling avec des anticorps additionnels, tels que Ki-67, peut être exécuté pour évaluer la réplication cellulaire et les données nucléaires de morphométrie d’hépatocyte peuvent être davantage interrogées pour compléter l’analyse de stratagème. Le profil de stratagème à l’échelle des tissus généré par cette méthode décrit la teneur minimale en ADN de tous les noyaux circulaires d’hépatocytes, mais ne fait pas de distinction entre les cellules mononucléaires et les hépatocytes binucléaires. La méthode peut potentiellement être adaptée pour tenir compte de paramètres tels que le périmètre cellulaire, pour faciliter l’identification des cellules binucléaires et fournir une lecture supplémentaire du stratagème cellulaire.