Name: Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez le protocole csBN-MS pour le profilage du complexome à haute résolution dans divers échantillons biologiques. Cette méthode permet l'analyse détaillée des complexes protéiques membranaires et de leurs sous-unités.

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Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projet ID 40322702 - SFB 1381 et dans le cadre de la stratégie d'excellence de l'Allemagne CIBSS - EXC-2189 - Project ID 390939984. Nous remercions Katja Zappe pour son assistance technique.

1. Bn-PAGE préparatif
<ol><li>Préparation de gel<ol>
<li>Utilisez un système d'électrophoresis de gel vertical de format moyen à grand (distance de séparation du gel de 10 cm; 14 cm x 11 cm, espaceur de 1,5 mm) avec un refroidissement efficace réglé à 10 oC.</li>
		<li>Cast gel linéaire ou hyperbolique de gradient de pores (1.5-3.0 mm d'espaceurs) à l'aide d'un mélangeur à gradient à deux chambres en mouvement entraîné par une pompe (voir Tableau des matériaux et des réactifs). Dans l'exemple présenté (gel de gradient linéaire 1%-13%):<ol>
<li>Préparer une solution de 13 ml pour la chambre avant (mélange) composée de : 13 % d'acrylamide (à partir de 30 % de la solution de stock, 37,5:1,0 acrylamide:bisacrylamide), 0,75 M d'acide aminocaproïque, 50 mM bis-tris (pH à 7,0) et 10 % de glycérol.</li>
			<li>Préparer une solution de 10 ml pour la chambre du réservoir composée de: 1% d'acrylamide (à partir de 30% de solution de stock, 37,5:1.0 acrylamide:bisacrylamide), 0,75 M d'acide aminocaproïque, 50 mM Bis-Tris (pH - 7,0), et 0,2% de détergent CL-47.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Démarrer l'agitateur et ajouter 30 microlitres d'APS (ammonium peroxodisulfate, solution de stock de 10%) et 2,5 L de TEMED (N,N',N',N',N'-téramethyl éthyle) et 2,5 microlitres de TEMED à la solution dans la chambre avant. Démarrer la pompe et ouvrir la soupape avant (le débit doit être ajusté pour terminer la coulée en 10 min). Après 1 min, ajouter 90 L d'APS et 5 L de TEMED à la solution dans la chambre du réservoir et ouvrir la connexion de la chambre.</li>
		<li>Laisser le gel polymériser lentement mais soigneusement pendant au moins 24 h à température ambiante (RT) pour générer un gradient homogène de taille de pores. Lorsqu'il est conservé humide, le gel polymérisé peut être maintenu à la verticale à 4 oC pendant une semaine. REMARQUE : Intentionnellement, le dessus du gel aura une consistance douce/mince. Cela sera plus tard enlevé, mais permet l'entrée en douceur des protéines dans le gel, avec un risque minimal de précipitations protéiques qui pourraient autrement conduire à des artefacts de migration (c.-à-d., stries ou précipitations protéiques).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation et chargement d'échantillons<ol>
<li>Préparer les emplacements de chargement en insérant des espaceurs appropriés (p. ex. tubes de silicium) entre les plaques de verre pour séparer 0,5 à 2,0 mg de protéines. Les fentes doivent être faites au moins 3 cm de large (ou mieux, 5-6 cm de large).</li>
		<li>Solubilize 2,5 mg de membrane (préparation endosome-endosome-endosome-endosome de souris) dans 2 ml de tampon de solubilisation contenant 1% (w/v) détergent non dénaturant (ComplexioLyte CL-47) pendant 30 min sur la glace. Ultracentrifugate (coupure de sédimentation 200 S ou moins; 130 000 x g/11 min est utilisée ici).</li>
		<li>Concentrez le solubilisate sur un court 50%/20% (w/v, 0.3 ml chacun) gradient d'étape de saccharose par ultracentrifugation pendant 1 h à 400.000 x g. Le rendement protéique final devrait être d'au moins 1 mg.</li>
		<li>Ajouter 0,05 % (w/v) Coomassie G-250 au solubilisate et charger l'échantillon sur le gel. Limitez la charge protéique à une section transversale de 10 à 15 g/mmde voie de gel pour obtenir une haute résolution et éviter les artefacts résultant des précipitations protéiques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conditions de fonctionnement BN-PAGE<ol>
<li>Pour les tampons de fonctionnement, préparez un tampon cathodique standard composé de 50 mM de tricine, 15 mM Bis-Tris et 0,01 % Coomassie G-250. Préparer un tampon d'anode standard composé de 50 mM bis-tris (pH 7,0).</li>
		<li>Exécuter un BN-PAGE préparatif à 10 oC pendant la nuit à l'aide d'un protocole de tension en trois étapes13 composé de : une phase d'équilibre de 30 min à 100 V, puis une rampe lente (3 h) à la tension maximale (40-50 V/cm longueur de gel) qui est finalement maintenue pendant au moins 6 h pour mise au point de terminaison des protéines. REMARQUE : Il est recommandé de mettre en pause l'électrophorèse lorsque le front de migration a atteint le milieu du gel et d'échanger le tampon cathodique contre du tampon frais sans Coomassie G250. Cela permet d'éviter les artefacts de précipitation dans le gel résultant de l'effondrement local de la structure des pores de matrice.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Échantillonnage et digestion de gel
<ol><li>Excision des voies de gel<ol>
<li>Après la course, scanner les gels à des fins de documentation tout en les gardant entre les plaques de verre.</li>
		<li>Démonter les plaques et exciser la section de voie (s) d'intérêt.</li>
		<li>Prenez une bande d'échantillon de la voie pour analyse par 2D BN/SDS-PAGE et coloration des protéines ou des ballonnements occidentaux (comme le montre la figure 1B) afin de déterminer les régions d'intérêt, la résolution efficace de la taille complexe et l'abondance des protéines.</li>
		<li>Fixer deux fois des voies de gel sélectionnées pendant au moins 30 min avec 30 % (v/v) d'éthanol et 15 % (v/v) d'acide acétique.</li>
		<li>Transférer l'échantillon dans le milieu d'intégration et lui permettre de tremper et d'équilibrer pendant au moins 2 h à 4 oC, tout en gardant la dalle de gel au ralenti sur un shaker orbital. REMARQUE : La séparation du gel doit être soigneusement inspectée pour la qualité globale de la séparation et les artefacts de migration. Les bandes de gel représentant les protéines dominantes doivent être sans distorsion et homogènes en intensité. Les artefacts locaux sur le gel doivent être excisés ou exclus de l'analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Enchâssement et tranchage de cryomicrotome REMARQUE : Il s'agit d'une version améliorée de la procédure d'intégration décrite et photo-documentée précédemment qui permet l'incorporation et le découpage des voies plus larges de gel de jusqu'à 8 cm11.<ol>
<li>Tout d'abord, couper les voies fixes de gel en sections (ici, 3 cm) exactement parallèles au modèle avant/bande de migration de protéine. Pour une manipulation plus facile, placez chaque section sur un support de film plastique avec des dimensions égales.</li>
		<li>Transférer les voies dans un tube ouvert avec des bouchons (fermés sur le fond, perforés centralement sur le dessus, à la fois précisément alignés avec les extrémités supérieure et inférieure de la section de gel).</li>
		<li>Trempez brièvement le cylindre dans l'azote liquide pour initier rapidement la solidification. Le milieu transparent d'intégration se solidifie en quelques secondes et devient blanc en couleur.</li>
		<li>Remplissez la cavité d'un milieu d'intégration, trempez-la brièvement dans de l'azote liquide et congelez le cylindre à -20 oC pendant plusieurs heures. REMARQUE : Refroidir le cylindre rapidement en le trempant dans de l'azote liquide permet d'éviter le déplacement de la dalle de gel dans le tube. La distorsion doit être évitée pour assurer une résolution élevée dans l'analyse suivante de la SP.</li>
		<li>Après le démontage, retirez le film plastique et transférez le bloc avec la section de gel incorporée à un cylindre en métal refroidi, plus grand, placé sur un support plat (c.-à-d., plat Petri) et scellé avec le milieu d'intégration à l'extérieur du cylindre. Remplir le cylindre d'un milieu d'intégration et congeler soigneusement.</li>
		<li>Répétez cette procédure avec l'autre côté du cylindre pour obtenir un bloc solide avec des surfaces coplanaires.</li>
		<li>Retirez le bloc du cylindre, collez-le avec un milieu d'intégration sur un support métallique prérefroidi et insérez le support dans la machine cryoslicing (cryotome). La surface du bloc doit être soigneusement alignée en ce qui concerne le plan de tranchage. Laissez-le acquiescer à la température optimale pour le processus de tranchage (ici, -15 oC). REMARQUE : Utilisez un cycle de découpe manuel le plus lent de la taille de l'étape de 0,1 mm jusqu'à ce qu'il touche la surface de la section de gel intégrée pour assurer un positionnement correct.</li>
		<li>Récoltez les tranches de gel les unes après les autres, avec une épaisseur finale désirée de 0,25 mm de taille d'étape, et transférez-les individuellement aux tubes de réaction avec des propriétés de liaison à faible teneur en protéines. REMARQUE : Dans cette configuration, les tranches de gel uniformes peuvent être facilement obtenues aussi minces que 0,1 mm et aussi épaisses que 0,5 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestion tryptique<ol>
<li>Effectuer la digestion tryptique in-gel après un lavage intensif des tranches de gel (au moins trois tours supplémentaires de lavage sont recommandés pour enlever les composants polymères du milieu d'intégration) suivant une procédure standard11.</li>
		<li>Peptides élingées à l'assèchement et redissolution en acide trifluoracétique de 0,5 % (v/v) en secouant à 37 oC (10 min) suivi de la sonication du bain (5 min) et d'une brève centrifugation.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Spectrométrie de masse
<ol><li>nanoHPLC et MS set-up<ol>
<li>Chargez des échantillons digérés sur une précolonne C18 (taille des particules de 5 m; diamètre de 300 m) avec 0,05 % (v/v) acide trifluroacétique à l'aide d'un nano-HPLC (sans fractionnement) couplé à un spectromètre de masse à haute résolution.</li>
		<li>Élute a capturé des peptides avec un gradient aqueuse-organique (éluence A): 5 min 3% B, 120 min de 3% B à 30% B, 20 min de 30% B à 99% B, 5 min 99% B, 5 min de 99% B à 3% B, 15 min 3% B (taux de débit 300 nL/min). REMARQUE : Les tranches de gel csBN-MS donnent généralement lieu à des échantillons dont l'abondance de peptides est faible à intermédiaire et un degré limité de complexité. l'analyse nanoLC-MS/MS devrait donc être effectuée avec une configuration offrant une sensibilité raisonnable et une vitesse de séquençage, une résolution de masse élevée (100 000 euros) et une plage dynamique maximale (en fait 3-4 ordres de grandeur). Cependant, il ne nécessite pas de longues dimensions de colonne ou des gradients d'élution étendus au-delà de 3 h.</li>
		<li>Des peptides élichés séparés dans un émetteur (c.-à-d. 75 m; pointe de 8 m) emballés manuellement d'environ 20 cm avec du matériau C18 (taille des particules à 3 m). Électrospray les échantillons à 2,3 kV (mode ion positif) dans le capillaire de transfert chauffé (250 oC) du spectromètre de masse.</li>
		<li>Effectuer des analyses avec les réglages d'instruments suivants11: temps d'injection maximum De SP/MS de 400 m; durée d'exclusion de 60 s; seuil de signal minimum : 5 000 dénombrements, 10 principaux précurseurs fragmentés; largeur d'isolement à 1,0 m/z). REMARQUE : Pour faciliter l'étalonnage de la masse, le temps de rétention et l'attribution des signaux peptidiques dans un grand nombre d'ensembles de données ou de mesures, il est recommandé d'effectuer des séries de mesures respectives de la SP sans interruptions ni changements dans les paramètres et le matériel ( c'est-à-dire sur la même colonne C18/émetteur).</li>
	</ol></li>
	<li>Identification des protéines (données de La SP évaluées comme décrite précédemment11)<ol>
<li>Extraire des listes de pics à partir de spectres d'ions fragmentàens à l'aide de l'outil "msconvert.exe" (une partie de ProteoWizard).</li>
		<li>Déplacez toutes les valeurs précurseurs m/z pour chaque jeu de données par le décalage médian m/z de tous les peptides attribués aux protéines dans une recherche préliminaire de base de données avec une tolérance de masse peptidique de 50 ppm.</li>
		<li>Recherchez les listes de pics corrigées avec un moteur de recherche approprié (ici, Mascot 2.6.2) contre toutes les entrées de souris de la base de données UniProtKB/Swiss-Prot (sortie 2018-11).</li>
		<li>Sélectionnez "Acetyl (Protein N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "Gln pyro-Glu (N-term Q), Glu pyro-Glu (N-term E)", "Oxidation (M)", et "Propionamide (C)" comme modifications variables.</li>
		<li>Définir la tolérance de masse du peptide et du fragment à 5 ppm et 0,8 Da, respectivement, et permettre un clivage tryptique manqué. Définir le seuil de valeur prévu pour l'identification des peptides à 0,5 ou moins. Utilisez une recherche de base de données de leurres pour déterminer le taux de découverte faussement positif (FDR). Fixer le FDR à 1% ou appliquer des critères de qualité supplémentaires pour assurer une identification fiable. REMARQUE : L'expérience présentée a permis d'identifier plus de 3 500 protéines, avec un FDR peptide moyen de 4,4 à 0,77 % (n - 101 échantillons de tranches), ou 3 000 protéines lorsque le Peptide FDR a été fixé à 1 %. Fait important, des critères plus stricts ont été utilisés pour la sélection des protéines profilées (2 568). Il comprenait toutes les protéines qui ont été identifiées avec au moins deux peptides, au moins l'un d'eux étant spécifique aux protéines, dans au moins un des 101 échantillons de tranches.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantification des protéines<ol>
<li>Utilisez des intensités de signal peptide (volumes de pointe [PV]) pour la quantité de protéines qui sont obtenues à partir de scans complets FT et correctes pour le temps de rétention et les décalages de masse à l'aide d'un logiciel approprié (ici, MaxQuant v1.6.3).</li>
		<li>Harmonisez les ensembles de données Sur la SP un par un aux temps d'élution peptidique de référence (moyenne totale) à l'aide de la régression LOESS. Attribuez les PV aux peptides soit directement (identification basée sur la SP/MS) ou indirectement (c.-à-d. en fonction de leur temps d'élution et de m/z correspondant dans des tolérances très étroites). REMARQUE : Ce protocole utilise un logiciel interne pour l'attribution des peptides « insérés ». Les paramètres de l'ensemble donnent lieu à des tolérances efficaces de m/z et de temps d'élution correspondant à des tolérances de 2 ppm et de 1 min, respectivement (voir la figure 2A,B).</li>
		<li>Corriger les variations systématiques de la charge peptidique et de l'efficacité de l'ionisation par redimensionnement de l'intensité des peptides calculées à partir des différences médianes d'intensité sépariane relative entre les échantillons de tranches voisines (Figure 2C).</li>
		<li>Filtrer les données PV pour les valeurs aberrantes et les affectations restantes faussement positives identifiées par l'analyse interne de cohérence PV.</li>
		<li>Normaliser les PV de chaque peptide à leurs valeurs maximales sur tous les ensembles de données de tranches donnant des profils relatifs d'abondance de peptides.</li>
		<li>Enfin, calculez les profils relatifs d'abondance des protéines en moyenne d'au moins deux (et jusqu'à six ou 50 %, quelle que soit la valeur supérieure) des profils de peptides les plus corrélés sur une fenêtre de trois tranches consécutives. Cela permet de combler les valeurs PV manquantes et de réduire le bruit. REMARQUE : Cela a finalement donné lieu à 2 545 profils protéiques (sur 2 568 présélectionnés)(figure 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Caractérisation des complexes protéiques<ol>
<li>Analyser les profils protéiques en effectuant la première détection de pointe à l'aide de la méthode des maxima locaux, et s'adapter consécutivement à des distributions normales à ces pics, donnant la position (c.-à-d., indice de tranche ou taille complexe apparente) de leurs maxima et FWHM (pleine largeur à demi-intensité maximale) (enset de la figure 4). REMARQUE : Dans le jeu de données, les profils sont analysés automatiquement à l'aide de scripts personnalisés. Les plus petites valeurs FWHM sont indicatives de la résolution de taille efficace de l'approche (ici, 6 x 0,25 x 1,5 mm).</li>
		<li>Utiliser des pics complexes protéiques de référence avec une masse moléculaire définie (tel que rapporté dans la base de données UniProtKB/Swiss-Prot) pour l'analyse linéaire de la régression des valeurs du journal10 (masse moléculaire prévue) pour convertir les indices de nombre de tranches en tailles moléculaires apparentes (c.-à-d., taille complexe apparente en kDa). REMARQUE : 23 complexes de marqueurs de l'échantillon ont été sélectionnés dans cette étude (figure 4) en fonction (i) des formes monodispersées des pics de profil, (ii) du soutien expérimental des poids moléculaires et (iii) des distributions le long des sections de gel BN-PAGE étudiées.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li>
</ol>

L'auteur Uwe Schulte est un employé et actionnaire de Logopharm GmbH qui produit ComplexioLyte 47 utilisé dans cette étude. La société fournit des réactifs ComplexioLyte aux établissements d'enseignement à but non lucratif.

L'étude présentée s'est construite sur la technique csBN-MS précédemment comparée à une préparation mitochondriale11 et a incorporé des améliorations dans la préparation d'échantillon, le traitement de gel, et l'évaluation de données de SP. L'analyse ciblée d'une section du gel BN-PAGE de séparation à grande échelle a fourni un ensemble complet de données montrant des mesures de qualité comparables à l'étude avec des membranes mitochondriales. Les erreurs de temps de masse et de rétention ainsi que les variations de courant à fonctionnement ont été maintenues très faibles et ont fourni la base pour déterminer les profils fiables d'abondance de protéine. La résolution de la taille semblait bonne, avec des largeurs de pointe demi-maximales aussi basses que six tranches (correspondant à 1,5 mm, figure 4) et des différences de taille relatives inférieures à 10 % résolues (Figure 3, Figure 5A). Ces valeurs ne répondaient pas entièrement à la qualité de résolution de la taille de l'analyse csBN-MS précédente des mitochondries (malgré la taille plus petite de l'étape d'échantillonnage de gel choisie), mais elles sont nettement meilleures que les performances du BN-MS conventionnel ou de la SP d'exclusion de taille approche20 qui sont récemment devenus populaires.
L'importance d'une résolution de taille complexe efficace est soulignée par l'expérience de simulation de la figure 3 (à l'aide des complexes associés au TPC1) qui peut difficilement être résolue par l'analyse de la tache occidentale 2D BN/SDS-PAGE ( Figure1B). Ces résultats suggèrent que le tranchage de 0,25 mm dans ce cas a entraîné un certain suréchantillonnage, mais il s'est avéré tout de même utile pour l'élimination du « bruit de quantification » sans compromettre la résolution efficace de la taille. Ainsi, conformément aux résultats précédents11, une taille d'étape d'échantillonnage de 0,3 mm est généralement recommandable.
Notamment, la discrimination des complexes associés à TPC1 est complètement perdue avec l'échantillonnage de gel de 1 mm, qui est la plus petite taille d'étape fournie par le découpage manuel dans le BN-MS5conventionnel,6. Cela peut expliquer le fait que, malgré les puissantes technologies de sP disponibles, très peu de complexes protéiques et de sous-unités ont été identifiés par le profilage complexome. Outre sa bonne puissance de résolution, csBN-MS offre une grande polyvalence. Les complexes membranaires et les complexes protéiques solubles allant de 50 kDa à plusieurs MDa peuvent être résolus efficacement dans une seule expérience avec un biais minimum11. Cela contraste avec les techniques de séparation alternatives utilisées pour le profilage complexome comme l'exclusion de taille ou la chromatographie d'échange d'ions, qui fonctionnent avec des sous-ensembles de protéines solubles avec certaines gammes de taille ou des propriétés de charge. En revanche, le csBN-MS est moins évolutif (charge maximale de 3 mg de protéines par gel), peut être techniquement difficile et ne peut pas être automatisé.
Dans l'ensemble, les résultats démontrent que le profilage du complexome basé sur le csBN-MS peut être appliqué avec succès à des cibles non mitochondriales, mais indique également certains défis associés. Ainsi, l'extraction efficace et la stabilité biochimique des complexes protéiques nécessitent plus d'optimisation, et les étapes de nettoyage et peuvent encore être limitées. Dans la fenêtre de taille étudiée, le nombre de complexes protéiques bien ciblés et monodispersés était en effet considérablement plus faible (données non montrées) par rapport à un échantillon mitochondrial. Il est également recommandé d'abaisser les charges d'échantillon BN-PAGE pour obtenir une séparation acceptable du gel. Des charges plus élevées peuvent nécessiter des voies de gel plus larges qui sont plus difficiles à traiter correctement pour le découpage (voir la vidéo d'accompagnement). En outre, la complexité des protéines des échantillons était plus élevée (environ deux fois) que les digestes de tranches dérivées des mitochondries, ce qui a conduit à plus de valeurs PV manquantes et une plage dynamique réduite. En fait, certaines petites protéines qui devraient faire partie des complexes présentés à la figure 5 manquaient dans les analyses. Ces problèmes peuvent être résolus à l'avenir en utilisant des instruments de SP plus rapides et plus sensibles ou des modes d'acquisition indépendants des données.
La préparation de l'échantillon est très critique pour la récupération complexe de protéines, la stabilité et la qualité de séparation du gel. Les paramètres et les procédures doivent être optimisés pour chaque tissu source, lysate cellulaire, membrane (fraction) et complexe protéique d'intérêt. Les recommandations générales suivantes sont fournies qui peuvent aider à étendre les applications de csBN-MS :
(i) Préparation d'échantillons frais et éviter le réchauffement/congélation, fortes dilutions, changements dans les conditions tampons et retards inutiles;
(ii) Utilisation de tampons essentiellement dépourvus de sels (remplacer par une bêtaine ou un acide aminocaproïque de 500 à 750 mM), environ un pH neutre et contenir jusqu'à 1 % (w/v) de détergent non dénaturant (rapport protéine/détergent entre 1:4-1:10 pour la solubilité de la membrane complexes protéiques, aucun détergent requis pour les complexes protéiques solubles);
(iii) Des essais et un ajustement minutieux des conditions détergentes par l'analyse BN-PAGE, car ceux-ci peuvent avoir un impact important sur l'efficacité de la solubilité complexe, de la représentation des complexes protéiques membranaires dans l'échantillon, de la stabilité et de l'homogénéité des micelles détergentes. Ces dernières sont des conditions préalables pour que les protéines se concentrent en bandes distinctes/populations complexes sur les gels BN-PAGE. La littérature précédente offre un large éventail de détergents neutres. Cependant, DDM (n-dodecyl -d-maltoside)1,2,4,5,6 et la numérisation3,5,7,8, 9,10,13,18 ont été les choix les plus populaires pour les analyses BN-MS à ce jour. Il faut souligner que toute condition détergente représente nécessairement un compromis entre l'efficacité de la solubilité et la préservation des interactions protéiques et peut ne pas être également adaptée à tous les types de protéines cibles et de matériel source;
(iv) Enlever les polymères chargés comme les fibrilles, les filaments, la polylysine, l'ADN et les composants abondants de poids moléculaire inférieur (c.-à-d. les métabolites, les lipides ou les peptides). Ceci peut être accompli par ultracentrifugation, filtration de gel, ou dialyse. Ceci est particulièrement important pour les lysates totaux de cellules ou de tissu ;
(v) Ajout de Coomassie G-250 (concentration finale 0,05%-0,1%) et le saccharose (pour augmenter la densité pour le chargement, la concentration finale de 10 %-20 % [w/v]) à l'échantillon juste avant le chargement, pour effacer par ultracentrifugation courte, charger l'échantillon sans perturbation, et commencer la course immédiatement après.
À l'avenir, le profilage complexome basé sur le csBN-MS offre des options pour le multiplexage afin d'étudier la dynamique complexe protéique ou les changements liés à des conditions biologiques spécifiques. La séparation combinée des échantillons étiquetés métaboliquement tel que proposé pour le profilage basé sur l'exclusion de taille21 semble simple, mais elle peut être entravée par l'échange spontané de sous-unité dans des complexes se produisant indépendamment de la séparation utilisée méthode. Alternativement, les échantillons étiquetés peuvent être résolus dans les voies de gel voisines, qui peuvent ensuite être co-tranchées ou combinées post-digestion pour l'analyse différentielle avec une sensibilité et une robustesse élevées.

La séparation BN-PAGE a d'abord été directement couplée à l'analyse LC-MS (BN-MS) par les groupes de recherche Majeran1 et Wessels2 à l'aide de découpemanuels des voies de gel BN-PAGE. Leurs analyses ont identifié un certain nombre de complexes protéiques membranaires abondants avec la composition connue de sous-unité des plastides végétaux et des mitochondries cellulaires HEK, respectivement. Toutefois, ces analyses étaient loin d'être exhaustives et ne permettaient pas d'identifier de nouvelles assemblées de façon impartiale. Les performances des spectromètres de masse et des méthodes de quantification sans étiquette se sont considérablement améliorées depuis, ce qui a permis des analyses complètes du BN-MS. Cela a inventé le terme «profilage complexe». Par exemple, Heide et ses collègues ont analysé les mitochondries cardiaques du rat, identifiant et regroupant 464 protéines mitochondriales, confirmant ainsi de nombreux assemblages connus. En outre, ils ont trouvé TMEM126B comme une sous-unité nouvelle et cruciale d'un complexe d'assemblage spécifique3. Des résultats comparables (avec 437 profils de protéines mitochondriales) ont été obtenus dans une étude parallèle des mitochondries des cellules HEK4.
Malgré ces améliorations, plusieurs questions sont demeurées qui limitent le plein potentiel de BN-MS pour le profilage complexome. Une limitation majeure est la résolution de taille effective des complexes qui est déterminée par deux facteurs : la (i) qualité de la séparation BN-PAGE, qui dépend de l'uniformité du gradient de pores de matrice de gel ainsi que de la stabilité/solubilité des complexes d'échantillon, et (ii) la taille d'étape de l'échantillonnage de gel, qui est au mieux 1 mm en utilisant le criage manuel conventionnel5,6. La mauvaise résolution de taille manque non seulement les isoformes et les hétérogénéités complexes subtiles, mais elle affecte également négativement la gamme dynamique et la confiance de l'affectation et de la quantité impartiaux de subunit de novo.
D'autres défis incluent la précision de la quantification des protéines et la couverture de la gamme dynamique réelle des abondances de protéines dans l'échantillon par analyse spectrométrique de masse. Par conséquent, l'application du profilage du complexe BN-MS est demeurée en grande partie limitée aux échantillons biologiques présentant une complexité plus faible, une expression élevée des complexes cibles et des propriétés favorables de solubilisation (c.-à-d. plastides, mitochondries et micro-organismes)6,7,8,9,10.
Nous avons récemment introduit le BN-MS (csBN-MS) assisté par cryomicrotome, qui combine un échantillonnage précis de voies de gel BN-PAGE sous-millimétriques avec une analyse complète de la SP et un traitement élaboré des données sur la SP pour déterminer les profils protéiques à haute confiance11. L'application à une préparation mitochondriale de membrane des cerveaux de rat a démontré la résolution efficace précédemment non satisfaite de taille complexe et la couverture maximale des sous-unités oxydantes de chaîne respiratoire (OXPHOS) (c.-à-d., 90 de 90 MS-accessible). Cet exemple a également permis d'identifier un certain nombre de nouveaux assemblages de protéines.
Décrits ici sont des procédures optimisées pour la séparation à l'échelle préparative BN-PAGE des complexes protéiques (non limité à une source biologique particulière), la coulée de grands gels préparatifs BN-PAGE, le découpage cryomicrotome de larges voies de gel, et les données de SP traitement. La performance du profilage à haute résolution est démontrée pour une préparation complexe de protéine des membranes endosome-enrichies de rein de souris. Enfin, les avantages d'une résolution et d'une précision accrues de la quantification spectrométrique de masse sont discutés.

<table><tbody><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>Recommandé pour les solutions de gel à gradient d’acrylamide jusqu’à 13</td></tr>%<tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>Recommandé pour les solutions de gel à gradient d’acrylamide >13 %</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>Coloration totale des protéines sur les membranes de transfert ; sensible et compatible avec l’immunodétection</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>no. 35050</td><td>Solutions mères centrifugées avant utilisation</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>Tampon détergent prêt à l’emploi (1 %) pour la solubilisation douce des protéines membranaires</td></tr><tr><td>Milieu d’enrobage / Milieu de congélation tissulaire</td><td>Leica Biosystems</td><td>14020108926</td><td>Milieu d’enrobage pour sections de gel à trancher par un cryo-microtome</td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF, 0,45 & micro ; m</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Seringue en plastique avec bouchon en caoutchouc, 20-30 ml</td> n.a.n.a.n.n.fournisseur<td></td><td></td><td>, important pour la fabrication d’un outil d’enrobage de section</td></tr><tr><td>de gel large lame de rasoir</td><td>n.a.n.a.n.n.n.n.fournisseur</td><td></td><td>, pour BN-PAGE gel coupe / excision de voies</td></tr><tr><td>tube / cylindre métallique, env. 4 cm long</td><td>n.a.n.a.mold</td><td></td> <td>pour l’enrobage et la congélation d’échantillons de gel</td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>fortement recommandé pour minimiser la perte de protéines/peptides due à la</td></tr><tr><td>trypsine modifiée de qualité séquençage d’absorption</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100 précolonne, taille des particules 5 & micro ; m</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur PicoTip (i.d. 75 &micro ; m; Astuce 8 & micro ; m)</td><td>Nouvel objectif</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &micro ; m)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>colonnes compressées manuellement</td></tr><tr>production <td>à façon d’anticorps</td> <td>anti-TPC1 de lapin</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>décrite dans Castonguay et coll., 2017 (Référence 12)</td></tr><tr><td>Laboratoire de vecteurs</td> <td>IgG de chèvre biotinylés Cy3</td><td>CY-1300</td><td>décrits dans Castonguay et coll., 2017 (Référence 12)</td></tr><tr><td>Lectine de Lotus tetragonolobus biotinylée, Laboratoires de vecteurs conjugués à la FITC</td><td></td><td>#B1325</td><td>décrite dans Castonguay et coll., 2017 ( Référence 12)</td></tr><tr><td>cryo-microtome Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell avec unité de transfert humide</td><td>Bio Rad</td><td>n.a.for</td> <td>SDS-PAGE et Westernblot (n’est plus vendu)</td></tr><tr><td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td><td>PeqLab</td><td>n.a.for</td> <td>BN-PAGE (n’est plus vendu)</td></tr><tr><td>Microscope Zeiss Axiovert 200 M + Photometrics Coolsnap 2 appareil photo numérique</td><td>Zeiss / Pompe</td> péristaltique <td>photométrique n.a.</td><td></td></tr> <tr><td>(IP haute précision multicanaux)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>pour la coulée de gels de polyacrylamide à gradient</td></tr><tr><td>mélangeur à gradient avec agitation (deux chambres)</td><td>fait maison, alternativement Bio Rad</td><td>1652000 ou 1652001</td><td>pour la coulée de gels de polyacrylamide à gradient, le manuel fournit des instructions pour couler des gels à gradient linéaire ou hyperbolique (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>ultracentrifugeuse Sorvall M120 avec rotor S80 AT3</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.pour</td> <td>la préparation d’échantillons (n’est plus vendu)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Orbitrap Elite</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage du complexome haute résolution par cryoslicing bn-ms analysis

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Les protéines exercent généralement des fonctions biologiques par des interactions avec d'autres protéines, soit dans des assemblages de protéines dynamiques, soit dans le cadre de complexes formés de façon stable. Ce dernier peut être élégamment résolu selon la taille moléculaire en utilisant l'électrophoresis indigène de gel de polyacrylamide (BN-PAGE). L'accouplement de ces séparations à la spectrométrie de masse sensible (BN-MS) a été bien établi et permet théoriquement une évaluation exhaustive du complexe extractible dans des échantillons biologiques. Cependant, cette approche est plutôt laborieuse et fournit une résolution et une sensibilité de taille complexes limitées. En outre, son application est restée limitée aux protéines mitochondriales et plastides abondantes. Ainsi, pour la majorité des protéines, l'information concernant l'intégration dans des complexes protéiques stables fait encore défaut. Présenté ici est une approche optimisée pour le profilage complexome comprenant la séparation BN-PAGE à l'échelle préparative, l'échantillonnage sous-millimètre de larges voies de gel par le criblage cryomicrotome, et l'analyse spectrométrique de masse avec la quantification sans étiquette de protéine. Les procédures et les outils pour les étapes critiques sont décrits en détail. En tant qu'application, le rapport décrit l'analyse complexome d'une fraction de membrane endosome-endosome-endosome-enrichie de reins de souris, avec 2.545 protéines profilées au total. Les résultats démontrent l'identification des protéines membranaires uniformes et à faible abondance telles que les canaux ioniques intracellulaires ainsi que des modèles complexes d'assemblage de protéines à haute résolution, y compris les isoformes de glycosylation. Les résultats sont en accord avec des analyses biochimiques indépendantes. En résumé, cette méthodologie permet une identification complète et impartiale des protéines (super)complexes et de leur composition sous-unité, fournissant une base pour étudier la stoichiométrie, l'assemblage et la dynamique d'interaction des complexes protéiques dans système biologique.

Un protocole de cryoslicing polyvalent BN-MS utilisant un microtome est présenté pour le profilage complexome à haute résolution.

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

L’objectif central pour le développement de la technique csBN-MS était d’obtenir un accès complet à l’organisation et à l’assemblage de complexes protéiques qui sous-tendent la transduction du signal à la membrane plasmatique de divers types de tissus et d’organes. csBN-MS offre actuellement la plus grande polyvalence de résolution pour l’analyse du complexe protéique indigène et de leur composition sous-unit, en particulier en ce qui concerne les protéines membranaires. Bien que la technique csBN-MS ait été développée pour analyser des mélanges complexes d’assemblages de protéines membranaires dans le cerveau des rongeurs, elle peut facilement être adaptée à l’analyse de tout type d’échantillon biologique.Une des étapes clés de notre méthode est l’intégration de la pièce de gel et son alignement correct sur le plan de coupe avant de trancher. Veillez à ne pas déchirer ou compresser le gel et assurez-vous qu’il n’est pas incliné vers le plan de coupe car cela réduirait la résolution de l’analyse. Notre technique csBN-MS a plusieurs étapes pratiques qui sont cruciales pour de bons résultats.Il est plus facile de montrer comment effectuer ces étapes en détail qu’en les décrivant simplement. Pour commencer cette procédure, utilisez un mélangeur de gradient de deux chambres en remuant entraîné par une pompe pour lancer un gel de gradient de pore linéaire ou hyperbolique. Préparer des solutions pour la chambre de mélange avant et la chambre de réservoir telles qu’décrites dans le protocole de texte.Démarrez l’agitateur et ajoutez 30 microlitres d’APS et 2,5 microlitres de TEMED à la solution dans la chambre avant. Ensuite, démarrez la pompe et ouvrez la vanne avant. Après environ une minute, ajouter 90 microlitres d’APS et cinq microlitres de TEMED à la chambre du réservoir et ouvrir la connexion de la chambre.Laissez le gel polymériser lentement et soigneusement pendant au moins 24 heures à température ambiante pour générer un gradient homogène de taille des pores. S’il est conservé humide, le gel polymérisé peut être conservé à la verticale à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Ensuite, préparez les fentes de chargement en insérant les espaces appropriés entre les plaques de verre pour séparer entre 0,5 et 2,0 milligrammes de protéines.Les fentes doivent avoir au moins trois centimètres de large. Pour les tampons en cours d’exécution, préparez un tampon cathodique permanent composé de tricine de 50 millimolaires, de 50 millimolaires Bis-Tris et de 0,01 % de Coomassie G-250. Préparez un tampon anode standard composé de 50 millimolaires Bis-Tris.Solubiliser environ 2,5 milligrammes de membrane et deux millilitres de tampon de solubilisation contenant 1 % de détergent non dénaturant sur la glace pendant 30 minutes. Puis ultracentrifugeuse à 130 000 fois G pendant 11 minutes. Concentrez le solubilisate sur un court gradient d’étape de saccharose de 50%20% par ultracentrifugation à 400 000 fois G pendant une heure.Après cela, récolter le gradient de saccharose à partir du fond du tube, ajouter 0,05%Coomassie G-250 au solubilisate, et charger l’échantillon sur le gel. Exécutez une BN-PAGE préparative à 10 degrés Celsius pendant la nuit à l’aide d’un protocole de tension en trois étapes, tel que décrit dans le protocole de texte. Après que le gel a exécuté numériser les gels à des fins de documentation tout en le gardant entre les plaques de verre.Inspecter la qualité de la séparation du gel. Ensuite, diffusez les plaques et excisez les sections de voie d’intérêt. Fixer les voies deux fois avec 30 % d’éthanol et 15 % d’acide acétique pendant au moins 30 minutes.Transférer l’échantillon de milieu d’intégration et lui permettre de tremper et d’équilibrer pendant au moins deux heures tout en gardant la dalle de gel au ralenti sur un shaker orbital. Ensuite, coupez les voies de gel fixe en sections exactement parallèles au front de migration des protéines, ou modèle de bande. Placez chaque section sur un support de film plastique avec des dimensions égales pour une manipulation plus facile.Transférer les voies dans un tube ouvert avec des bouchons qui sont fermés sur le fond et centralement perforés sur le dessus, à la fois précisément alignés avec les extrémités supérieure et inférieure de la section gel. Trempez brièvement le cylindre dans l’azote liquide pour initier rapidement la solidification. Le milieu d’intégration transparent se solidifie en quelques secondes et devient blanc en couleur.Remplissez la cavité d’un milieu d’intégration, trempez brièvement le cylindre dans de l’azote liquide, puis laissez-le geler complètement à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs heures. Après le démontage, retirer le film plastique et transférer le bloc avec la section de gel intégré à un cylindre en métal refroidi. Le cylindre est de plus grand diamètre et scellé à l’extérieur avec un milieu d’intégration.Il est placé sur un support plat. Remplissez le cylindre d’un milieu d’intégration et congelez soigneusement comme mentionné précédemment. Répétez cette procédure de l’autre côté du cylindre pour obtenir un bloc solide avec une surface inférieure coplanaire.Ensuite, retirez le bloc du cylindre et utilisez le milieu d’intégration pour le coller à un support métallique pré-refroidi. Insérez le support métallique dans la machine à cryoslicing. Le support doit être soigneusement aligné par rapport au plan de tranchage.Laissez le bloc s’équilibrer à la température optimale pour le processus de tranchage. Après cette récolte, le gel tranche les uns après les autres avec une épaisseur finale désirée de 0,25 millimètre de taille d’étape et les transférer individuellement dans des tubes de réaction avec de faibles propriétés de liaison protéique. Ensuite, les tranches sont soumises à la digestion tryptique et à l’analyse spectrométrique de masse.Ce protocole étend l’application du profilage complexome à haute résolution aux membranes non mitochondriques exprimant des protéines faiblement abondantes. La séparation complexe montre des bandes protéiques fortement tachées avec très peu d’artefacts de migration. Les écarts de signaux peptidiques dans la masse et le temps de rétention indiquent un taux très faible pour l’affectation de volume de pointe faussement positive.Les variations run-to-run sont facilement éliminées en recalcalant les ensembles de données de volume de pointe. L’information sur l’intensité peptidique qui en résulte est ensuite utilisée pour reconstruire 2545 profils protéiques d’abondance relative. La pertinence de l’échantillonnage du gel pour la résolution des complexes protéiques a été évaluée en joignant des ensembles de données de tranches adjacentes.À 0,25 millimètre, la séparation de la taille des populations complexes associées à PTC1 est bien en accord avec les résultats de l’analyse des taches occidentales. L’assemblage de plus de deux tranches abolit la discrimination à l’égard des sous-populations complexes de PTC1. Enfin, l’analyse fournit des informations sur des complexes bien caractérisés et démontre l’existence de nouvelles sous-unités et d’assemblages complexes.Pour la ferritine, les profils de sous-unité ajustés en fonction de leur abondance relative suggèrent l’existence d’au moins trois isoformes complexes avec des stoichiomètres distincts à chaîne lourde/légère. En revanche, les complexes de nicalin-nomo1, le complexe de noyau gamma-sécréase, et les machines de GPI-transamidase montrent des rapports fixes d’abondance de leurs sous-unités de noyau sur la gamme entière de taille et indépendamment de l’association avec des protéines additionnelles. Le paramètre clé de l’analyse csBN-MS est la résolution efficace des complexes, qui est déterminée par la biochimie de l’échantillon, la qualité du gel BN, un alignement approprié lors de l’intégration et du tranchage, et la qualité des données de SP acquises.Le peignage du csBN-MS avec l’étiquetage isotopique des protéines et des échantillons permettra de comparer directement les complexomes à différents états pathophysiologiques, biologiques ou développementaux. CsBN-MS effectué sur les membranes du cerveau des rongeurs a révélé l’énorme diversité des récepteurs, des canaux iion, et les transporteurs en ce qui concerne leur composition sous-unité et leur fonction, et il sera instrumental pour analyser la structure 3D dans les préparations indigènes.

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Étude de la coopération microbienne par imagerie par spectrométrie de masse Analyse de colonies bactériennes cultivées sur gélose et dans les tissus pendant l’infection

Ce protocole vise à préserver les métabolites cellulaires pour la spectrométrie de masse sur cellule unique (SCMS) en combinant le lavage en solution de sel volatil, l’extinction rapide de l’azote liquide, la lyophilisation et le stockage à -8 °C. Il démontre que l’extinction de l’azote liquide est essentielle pour maintenir les profils de métabolites, tandis que le stockage prolongé au froid doit être minimisé pour prévenir les altérations métaboliques.

Préparation d’échantillons pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique : lavage, trempe, séchage et stockage combinés des cellules

Découvrez le protocole csBN-MS pour le profilage du complexome à haute résolution dans divers échantillons biologiques. Cette méthode permet l'analyse détaillée des complexes protéiques membranaires et de leurs sous-unités.

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

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