Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

L’auto-assemblage de nanoparticules protéiques, ou SAPNs, peut être utilisé pour développer des vaccins contre diverses maladies infectieuses. Cette méthode que nous décrivons ici peut être utilisée pour purifier, refold, et caractériser SAPNs contenant un paquet de six hélices. Cette nanoparticule peut présenter des antigènes trimériques dans une conformation indigène.

Avec de légères modifications, cette méthode peut être appliquée à d’autres constructions innovantes de vaccins SAPN. En outre, il peut être facilement transférable à la production à grande échelle pour les essais cliniques. Pour la lyse d’E.coli récolté exprimant le faisceau de six hélices SAPN, utilisez une sonde avec la sortie de sonication de 150 watts avec quatre secondes de sonication et six secondes de repos, pour sonifier les granulés bactériens résuspendus en 40 millilitres de tampon sans imidazole sur la glace pendant cinq minutes.

Centrifugeuse le lysate cellulaire pour générer un supernatant clarifié et transférer le supernatant à un flacon stérile de 150 millilitres. Ensuite, amener l’échantillon jusqu’à un volume final de 100 millilitres avec tampon frais sans imidazole. Pour isoler la protéine d’intérêt, ouvrez le logiciel FPLC et cliquez sur l’option Nouvelle Méthode.

Dans le menu Paramètres de méthode, ouvrez le menu de dropdown de position de colonne et sélectionnez C1 Port 3. Dans le menu de dropdown Montré par technique, sélectionnez Affinity. Dans le menu de dropdown de type colonne, sélectionnez Autres, HisTrap HP et cinq millilitres.

Le volume de colonne et les boîtes de pression seront automatiquement réglés sur les valeurs appropriées. Cliquez sur Le contour de la méthode et faites glisser les boutons d’application Equilibration et Sample, trois boutons de lavage de colonne et le bouton Elution du menu popup de la bibliothèque de phase à côté de la flèche avant de fermer le menu bibliothèque de phases. Cliquez sur Equilibration et définissez les valeurs indiquées dans le tableau sur le tampon initial B, le tampon final B de 4 %, 4 % et le volume de la colonne, cinq.

Cliquez sur Exemple d’application. Dans la boîte de chargement de l’échantillon, cliquez sur le bouton radio pour injecter l’échantillon sur la colonne avec la pompe d’échantillon, et confirmez que la boîte à côté du taux de débit d’utilisation des paramètres de méthode est cochée dans l’injection d’échantillon avec la boîte de pompe de système. Modifiez la valeur de la boîte volume à 100 millilitres et le système de collecte fractionnée pour activer.

Délectez la taille de fraction d’utilisation de la boîte paramètres de méthode et modifiez la taille de la fraction en quatre millilitres. Cliquez sur le premier bouton De lavage de colonne, définissez les valeurs énumérées dans le tableau au tampon initial B, au tampon final B de 4 %, au volume de la colonne 4 % et au volume de la colonne, 10. Cliquez sur le système de collecte fraction activer la boîte et délecter la taille fraction d’utilisation à partir des paramètres de méthode.

Changez la taille de la fraction en quatre millilitres et cliquez sur le deuxième bouton De lavage de colonne. Définissez les valeurs dans le tableau au tampon initial B, au tampon final B de 0 %, à 0 % et au volume de la colonne, cinq. Cliquez sur le système de collecte fraction activer la boîte et délecter la taille fraction d’utilisation à partir des paramètres de méthode.

Changez la taille fraction en quatre millilitres et cliquez sur le troisième bouton De lavage de colonne. Définissez les valeurs dans le tableau au tampon initial B, au tampon final B à 0 %, au volume de la colonne 10. Cliquez sur le système de collecte fraction activer le bouton et déchlickr la taille de fraction d’utilisation de la boîte paramètres de méthode.

Ensuite, changez la taille de la fraction en quatre millilitres. Cliquez sur le bouton Elution et cliquez à droite sur les informations dans le tableau. Dans le menu pop-up, cliquez sur Supprimer l’étape et faites glisser le bouton de gradient isocratique sur la table deux fois, de sorte qu’il y ait deux entrées.

Définissez la valeur de la première entrée au tampon initial B, au tampon final B de 30 %, à 30 % et au volume de la colonne, 10. Définissez la valeur de la deuxième entrée au tampon initial B, au tampon B 100 % final, au volume de 100 % et au volume de la colonne, 10. Cliquez sur le bouton Fraction Collection Scheme Enable et cliquez sur la taille fraction d’utilisation de la boîte Paramètres de méthode.

Ensuite, cliquez sur Enregistrer As et nommer la purification du fichier. Placez la pompe A tube du FPLC dans le tampon de lavage sans imidazole, et la pompe B tube dans le tampon imidazole de 500 millimlaires. Placez le tube de pompe d’échantillon dans l’échantillon de 100 millilitres et exécutez le programme de purification.

Lorsque le lavage isopropanol à 60 % est nécessaire, mettez le programme en pause, déplacez la pompe A du lavage sans imidazole dans le lavage à 60 % de l’isopropanol et redémarrez le programme. À la fin du lavage, interrompez à nouveau le programme, retournez le tube de la pompe A au tampon de lavage sans imidazole et redémarrez le programme de purification. Pour évaluer la pureté de la protéine purifiée, combinez d’abord les fractions du flux à travers, lavez-en une, lavez-en deux et lavez trois étapes, dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres.

Ensuite, mélangez 15 microlitres de chaque tube d’échantillon avec 15 microlitres de tampon 2X Laemmli dans des tubes de microcentrifugeuse individuels de 0,5 millilitre et déliaturez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, mettre en place un appareil de fonctionnement de gel avec trois gels polyacrylamides préfabriqués sans taches de quatre à 20 % dans le tampon de fonctionnement Tris-Glycine SDS-PAGE. Chargez huit microlitres de marqueur de poids moléculaire au premier puits de chaque gel et 30 microlitres d’échantillon dénaturé vers les autres puits.

Faire fonctionner les gels à 200 volts jusqu’à ce que l’avant de colorant touche le fond du gel et rincer brièvement les gels avec de l’eau déionisée avant d’imagerie immédiate avec un système d’imagerie sans taches. Ensuite, identifiez les fractions qui contiennent des bandes protéiques avec la bonne taille et mutualiser ces fractions. Pour le refolding sapn de faisceau de six hélices, ajoutez 10 à 20 millilitres de protéine mise en commun à une cassette de dialyse de coupure de poids moléculaire de 10 kilodalton.

Dialyz la cassette en huit urée molaire, Tris de 20 millimolaires, 5% glycérol, et TCEP de cinq millimolaires à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, diminuez la concentration d’urée dans le tampon de dialyse par étapes de deux molaire toutes les deux heures pour diagnostiquer lentement l’urée de l’échantillon. Lorsque la concentration d’urée atteint deux molaire, déplacer l’appareil de dialyse à quatre degrés Celsius et dialyser l’échantillon en urée de 120 millimlaires, tris de 20 millimolaires, et 5% glycérol pendant la nuit pour terminer le refolding.

Le lendemain matin, retirez la protéine refolded de la cassette et filtrez le faisceau de six hélices SAPN par un filtre de seringue de fluorure de polyvinylidene de 0,22 micromètre. Pour mesurer la taille moyenne des particules du faisceau de six hélices SAPN, ajoutez 45 microlitres de sapn à six hélices à une cuvette jetable et placez la cuvette dans la machine DLS. Ensuite, créez un nouveau fichier de mesure et exécutez une procédure d’exploitation standard préécrite pour les protéines dans l’urée de 120 millimlaires, les tris de 20 millimolaires et le tampon glycérol de 5 % à 25 degrés Celsius.

Ensuite, commencez la mesure. La taille moyenne Z, le PDI et les résultats de distribution seront calculés pour chaque course. La machine lira l’échantillon cinq fois.

Ce faisceau entièrement assemblé de six hélices SAPN est construit sur des séquences protéiques qui devraient se plier en une particule qui contient 60 copies du monomère. Le lysate de cellules total a été employé pour purifier les monomères de SAPN de faisceau de six hélices par FPLC utilisant une colonne de nickel, démontrant que la protéine s’est échappée à l’imidazole de 150 et de 500 millimolar. Le chromatogramme montre également deux autres pics à 185 et 210 millilitres volume total correspondant au lavage isopropanol et le lavage imidazole-libre respectivement.

Les fractions et la pureté de la protéine recombinante pourraient être identifiées par des gels SDS-PAGE dégradés avec la protéine d’intérêt principalement située dans la fraction 68 à 79. L’analyse occidentale de tache avec des anticorps anti-His et anti-167D4 a indiqué que les fractions poolées étaient en effet la protéine d’intérêt. Les taches ont également démontré la présence du paquet de six hélices SAPN multimères.

Les échantillons qui contenaient les monomères protéiques d’intérêt ont été pliés dans le faisceau entièrement assemblé de six hélices SAPN par dialyse et la distribution de la taille des particules a été déterminée par LSD et l’analyse de suivi des nanoparticules. La visualisation par microscopie électronique de transmission a indiqué les particules individuelles bien formées de SAPN de faisceau de six hélices avec la distribution de taille obtenue des deux techniques de dimensionnement de particule. L’étape la plus importante de ce protocole est le refolding du paquet de six hélices SAPN.

Le pH correct et la force ionique du tampon de refolding sont essentiels. À l’aide d’un lavage à l’isopropanol pendant la purification, nous avons pu réduire la contamination du LPS à un niveau très bas. Toutefois, LPS peut être réduit davantage à l’aide d’une colonne d’échange d’anion si nécessaire.

Cette technologie peut être facilement adaptée à l’application humaine. Un SAPN à exprimé bactérien a déjà été mis à l’échelle pour un essai clinique sur le paludisme de phase 1/2a à venir.