Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

Les méthodes basées sur la microscopie de la force atomique permet de caractériser les processus biomoléculaires à l’échelle nanométrique par une résolution chimique ou structurelle morphologique, ouvrant enfin une nouvelle fenêtre d’observation avant sur la biologie. Les méthodes à molécule unique permettent de sonder des systèmes très hétérogènes, une caractéristique particulièrement pertinente pour comprendre l’agrégation protéique. En combinant des molécules simples avec des approches de dos, nous pouvons obtenir des informations fondamentales sur le comportement des protéines, leurs liens avec les maladies humaines et concevoir des interventions pharmacologiques qui peuvent être couronnées de succès.

En outre, cette méthode peut être appliquée avec succès pour étudier les propriétés chimiques et structurelles des biomatériaux pour l’administration de médicaments, les applications et d’autres fins biotechnologiques. Il peut être difficile au départ de définir les paramètres AFM corrects pour la haute résolution et il est facile de configurer votre AFM tout en mesurant vos agrégats fibrillaires. 30 minutes avant l’imagerie AFM, allumez le système AFM et cliquez sur configurer et sonder.

Dans la fenêtre de changement de sonde, cliquez à côté pour préparer l’étape de mise au point Z. Éteignez l’interrupteur du faisceau AFM s’il est allumé et déverrouillez les serrures de queue d’aronde. Déconnectez la tête du système et dans la fenêtre de changement de sonde, cliquez ensuite.

Montez le porte-à-faux AFM sur le porte-sonde. Connectez la tête au système et verrouillez les serrures de queue d’aronde. Allumez le commutateur de faisceau laser AFM et dans la fenêtre de changement de sonde, cliquez ensuite.

Dans la fenêtre pop up, cliquez non si le type porte-à-faux n’a pas changé et ajuster les boutons d’alignement optique pour trouver le porte-à-faux. Réglez l’accent sur le porte-à-faux et cliquez ensuite. Dans la fenêtre pop up, cliquez oui si l’accent est mis sur le porte-à-faux.

Utilisez les boutons de faisceau laser de détection pour positionner le faisceau laser à l’extrémité du porte-à-faux. Utilisez les boutons de faisceau laser déviés pour maximiser le signal total mesuré par la diode photo à quatre quadrants à au moins plus d’un volt. Dans la fenêtre de changement de sonde, cliquez ensuite et fermez.

Après avoir attendu 15 minutes que le porte-à-faux atteigne la stabilité thermique, réajuster la position du faisceau laser dévié sur la diode photo sensible à la position si nécessaire. Cliquez sur balayage NCM, sélectionnez l’amplitude désirée de l’oscillation, cliquez sur la phase d’utilisation et cliquez sur automatique. Réglez le porte-à-faux près du maximum de sa première résonance libre d’oscillation à environ 300 kilohertz pour un porte-à-faux avec une constante printanière de 40 newtons par mètre.

Placez l’échantillon sur le porte-échantillon. Cliquez sur la zone d’analyse et réglez la résolution entre 256 par 256 et 1024 par 1024 pixels, puis définissez la taille de l’analyse et le nombre de pixels. Réglez le taux de balayage à 0,3 à un hertz pour une zone de balayage d’un par un à cinq par cinq micromètres au carré.

Concentrez la vue optique sur l’approche de l’échantillon et cliquez pour approcher la surface de l’échantillon. Ensuite, cliquez sur soulever 100 micromètres pour soulever la pointe AFM 100 micromètres au-dessus de la surface de l’échantillon et cliquez sur élargir l’image optique de l’échantillon. Cliquez sur la barre d’étape de mise au point pour concentrer la vue sur la surface de l’échantillon et utilisez les flèches pour vous déplacer dans la région de l’échantillon d’intérêt.

Cliquez sur l’approche pour engager la surface et cliquez sur l’analyse de la ligne pour vérifier si la pointe suit bien la surface. Ajustez le point défini au besoin. Cliquez ensuite sur l’analyse pour commencer à imaginer la surface de l’échantillon, en maintenant un régime constant de changement de phase ne dépassant pas le delta 20 pendant l’imagerie afin d’éviter une grande force d’imagerie et de maintenir la cohérence entre les échantillons indépendants.

Pour l’imagerie par nanospectroscopie IR, 30 à 60 minutes avant l’analyse, allumez le système IR de l’AFM et le laser IR. Ouvrez le logiciel intégré pour contrôler l’instrument et cliquez sur le fichier et nouveau pour ouvrir un nouveau fichier nano IR. Cliquez sur initialiser pour démarrer le système IR AFM et ouvrir le couvercle de l’instrument.

Montez une sonde recouverte d’or de silicone avec un rayon nominal de 30 nanomètres et une constante printanière de 0,2 newtons par mètre sur le système IR de l’AFM pour mesurer l’échantillon en mode de contact. Cliquez sur la charge dans la section sonde AFM et ensuite. Utilisez l’accent mis sur les flèches de sonde pour concentrer la caméra sur le porte-à-faux et utilisez la pointe pour le réticule pour placer le réticule à l’extrémité du porte-à-faux.

Faites pivoter les boutons contrôlant la position du laser de détection pour positionner le laser à l’extrémité du porte-à-faux. Faites pivoter les boutons laser pour détecter et maximiser la somme mesurée par la diode photo à quatre quadrants à une valeur supérieure à trois volts. Faites pivoter le bouton de déflexion pour ajuster la déflexion en porte-à-faux à moins un volt et cliquez ensuite.

Ensuite, fermez le couvercle de l’instrument. Utilisez l’accent mis sur les flèches de sonde pour concentrer la caméra sur l’échantillon et la pointe aux flèches de réticule pour se déplacer dans la région d’intérêt de l’échantillon. Cliquez ensuite et engagez-vous.

Dans la fenêtre du microscope, sélectionnez la hauteur pour la morphologie, l’amplitude deux pour l’absorption IR et la fréquence PLL pour cartographier la pointe pour échantillonner la résonance de contact. Dans la section de balayage de l’AFM, définissez les paramètres tels que démontrés pour l’imagerie AFM et cliquez sur l’analyse pour acquérir une carte de morphologie. Lorsque la cartographie morphologique est terminée, dans la fenêtre du microscope, cliquez sur la carte de hauteur pour positionner la sonde sur le dessus d’un agrégat.

Dans la section nano IR, cliquez sur démarrer IR pour éclairer l’échantillon avec le laser IR. Pour concentrer le laser infrarouge sur le porte-à-faux, cliquez sur optimiser et entrez 1655 centimètres pour le nombre d’ondes. Cliquez sur ajouter et numériser pour déterminer la position laser IR et cliquez sur mise à jour et d’accord pour aligner sa position avec le porte-à-faux.

Dans la section générale, entrez un nombre d’ondes pour lequel une absorption élevée dans le champ relatif est attendue et désactivez l’option filtre de passage de bande. Cliquez sur démarrer IR puis vérifier la lecture du compteur et la FFT de la réponse en porte-à-faux. Dans la fenêtre FFT, déplacez le curseur vert pour lire la fréquence de résonance du porte-à-faux.

Une valeur typique de la FFT de la résonance des cantilevers est d’environ 200 kilohertz. Entrez la valeur de fréquence de résonance générée dans la section générale dans le champ centre de fréquence et utilisez une fenêtre de fréquence de 50 kilohertz. Cliquez sur la fenêtre d’écoute d’impulsion laser pour sélectionner le mode amélioré de résonance et définir un taux d’impulsion de 222 kilohertz, une plage d’air de 50 kilohertz et un cycle de service laser de 5%Cliquez pour balayer le taux d’impulsion du laser.

Utilisez le curseur pour régler l’impulsion laser à la fréquence de la réponse mécanique de l’expansion thermique de l’échantillon absorbant la lumière IR. Sélectionnez ensuite la boucle verrouillée de phase pour surveiller la résonance de contact entre l’échantillon et la pointe et cliquez sur zéro. Pour d’autres propriétés chimiques à l’échelle nanométrique, suivez la résonance de contact pendant l’acquisition des spectres pour vous assurer que le spectre de l’échantillon n’est pas affecté par la surchauffe et l’adoucissement.

Sélectionnez activer pour suivre l’échantillon à la résonance de contact pointe et sélectionnez un gain intégral de 0,5 et un gain proportionnel de 10, puis cliquez sur OK. Dans la fenêtre optimisez, cliquez sur la longueur d’onde et numérisez pour localiser le laser IR pour au moins trois nombres d’ondes correspondant aux principales bandes d’absorption de l’échantillon et pour au moins un nombre d’onde pour chaque puce du laser. Cliquez sur les outils, l’étalonnage de fond IR et nouveau, et réglez le nombre d’ondes entre 1200 et 1800 centimètres. Réglez les arrière-plans en moyenne à un, le cycle de service de 5% et la vitesse de balayage à 100 centimètres carrés.

Cliquez sur acquérir pour mesurer le fond laser IR pour la normalisation des spectres localisés à l’échelle nanométrique mesurée, enregistrer le fichier et fermer la fenêtre. Dans les paramètres des spectres IR, sélectionnez une résolution du spectre IR entre un et quatre centimètres et un certain nombre de co-moyennes d’au moins 64 fois. Cliquez ensuite sur acquérir pour mesurer un spectre IR localisé à l’échelle nanométrique dans la gamme de protéines.

Pour acquérir une carte chimique résolue à l’échelle nanométrique, sélectionnez 1655 centimètres et l’imagerie IR et cliquez sur l’analyse dans la fenêtre d’analyse AFM. Lorsque la cartographie est terminée, enregistrez les mesures. Utilisez ensuite le logiciel de traitement d’image AFM intégré pour analyser les cartes acquises de la morphologie, de la résonance de contact et de la chimie et des spectres localisés à l’échelle nanométrique.

Il s’agit d’une étape cruciale pour obtenir une solution monomère très pure, car la présence d’espèces agrégées peut entraîner une mauvaise reproductibilité de la cinétique et introduire des artefacts dans vos mesures. Un facteur fondamental pour étudier avec succès les échantillons biologiques qui ont une hétérogénéité élevée est la position correcte des substrats solides. Les dépôts microfluidiques de pulvérisation peuvent être exploités au lieu d’un dépôt manuel afin de préserver l’architecture de l’échantillon et l’hétérogénéité.

Ces méthodes ouvrent la voie à un démêler la structure chimique et les propriétés des biomolécules individuelles et leurs interactions dans l’environnement liquide physiologique et indigène.