Name: Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez une méthode pour mesurer les rythmes diurnes du flux autophagique et protéasomal dans le foie de souris. Cette technique in vivo permet d'évaluer le catabolisme protéique avec des matériels accessibles.

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Ces travaux ont été financés par RO1HL135846 et une subvention de l'Institut de développement de l'enfance (PD-II-2016-529).

Le protocole décrit ici a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Logement de souris et conception expérimentale
<ol><li>Pour détecter les rythmes quotidiens dans le renouvellement des protéines, les souris domestiques (mâles ou femelles C57BL/6J, 4 à 8 semaines, 20 à 25 g) dans le cadre de cycles standard de lumière/obscurité de 12 h avec de la nourriture fournie ad libitum. Pour éviter de stresser les animaux, acclimater les souris pendant au moins une semaine dans l'établissement avant d'utiliser et éviter le logement unique. Pour prouver que les rythmes dans le catabolisme protéique sont vraiment circadiens (c.-à-d., entraînés par l'horloge biologique interne de l'animal), les souris de maison dans des conditions sombres constantes, en prenant soin d'éviter d'exposer les souris à la lumière exogène. REMARQUE: Pour plus de détails sur le logement de la souris pour les expériences de rythme circadien voir la référence suivante11.</li>
	<li>Pour chaque point de temps, allouer trois souris comme contrôles fictifs et au moins trois souris pour chaque type d'inhibiteur de la protéase utilisé (leupeptin pour le flux autophagique et bortezomib pour les mesures de flux protéasomal). Planifiez six points de temps uniformément espacés à intervalles de 4 h tout au long du cycle jour/nuit pour obtenir des échantillons de tissus. REMARQUE: Une expérience de 24 h, 6 points de temps avec la saline tamponnée de phosphate (PBS), la leupeptin, et le bortezomib exigera un total de 54 souris (3 par traitement x 3 traitements x 6 points de temps).</li>
</ol>2. Préparation de la solution d'homogénéisation, des solutions de stock d'inhibiteur, et des vials pour la collection de foie de souris
<ol><li>Préparer un tampon d'homogénéisation frais (HB) et garder sur la glace : 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM de saccharose, 5 mM EDTA pH 8,0 et 1 comprimé inhibiteur de la protéase par 100 ml. REMARQUE: Environ 10 ml de HB sont nécessaires par souris.</li>
	<li>Pour le traitement en aval d'échantillons biologiques, chaque échantillon nécessite un tube conique de 15 ml pour contenir l'homogénéisation brute, un tube de 15 ml pour contenir le supernatant post-nucléaire, deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml pour contenir les 3 000 x g et 20 000 x g granulés matériau, respectivement, et un tube de microcentrifuge de 1,5 ml pour tenir la fraction cytoplasmique. Ajouter 7 ml de HB froid à chaque tube destiné à l'homogénéisation brute et conserver sur la glace.</li>
	<li>Préparer une solution de stock de 2 mg/mL de leupeptin hemi-sulfate dans le PBS stérile. Préparez également une solution de 50 mg/mL de bortezomib dans du sulfoxide de diméthyle (DMSO). Aliquot et stocker les solutions à -80 oC.</li>
</ol>3. Administration d'inhibiteur de protéase
<ol><li>Décongeler les solutions de leupeptin (2 mg/ml) et de bortezomib (50 mg/ml) à température ambiante 15 min avant chaque point de temps. Le stock de leupeptin est prêt pour l'injection. Diluer le bortezomib dans un PBS stérile pour obtenir une solution de travail de 50 g/mL. REMARQUE: Bortezomib est sensible à la lumière, afin de protéger le stock de travail de la lumière jusqu'à l'utilisation.</li>
	<li>Peser les souris et effectuer des injections intrapéritones de PBS « fictif » (0,5 ml), de leupeptin (40 mg/kg) ou de bortezomib (1,6 g/kg). Retournez les souris dans des cages bien marquées regroupées par le type d'injection qu'elles ont reçue. Enregistrez l'heure à laquelle les souris sont traitées ou manipulées dans un tableau standardisé (voir Fichier supplémentaire « Donnéesd'échantillons»). REMARQUE: Un calculateur de dose est inclus comme une aide dans le fichier supplémentaire "Données d'échantillon". Il est important d'effectuer des injections rapidement et dans le même ordre de temps en temps pour minimiser la variabilité.</li>
</ol>4. Acquisition et stockage de tissus
<ol><li>Deux heures après l'injection, euthanasiez les souris une à la fois conformément au protocole approuvé par l'AIIACUC. Par exemple, anesthésier les souris puis euthanasier par luxation cervicale. Passez à l'étape de dissection immédiatement après l'euthanasie. REMARQUE: Assurer une anesthésie complète avant la luxation cervicale en pinçant les pattes avant sans réflexe observable.</li>
	<li>Enlever le lobe gauche du foie en faisant une incision de 1,5 à 2,0 cm avec des ciseaux Metzenbaum sur l'abdomen ventral de la souris. Extérisez le lobe gauche du foie et expirez-le avec des ciseaux chirurgicaux. Immerger l'échantillon de foie dans 7 ml de HB glacé dans un tube conique de 15 ml correctement étiqueté. Garder l'échantillon sur la glace tout au long du traitement. REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés sur la glace ou à 4 oC pendant la nuit avant de procéder. Si les marqueurs standard de la macroautophagie et de l'activité protéasomal sont les seuls résiliations prévus, les échantillons de foie peuvent être congelés flash dans de l'azote liquide et stockés à -80 oC pour un traitement ultérieur. Pour examiner d'autres cibles de dégradation (p. ex., par protéomique), traiter les échantillons sans congélation.</li>
	<li>Procéder à l'euthanasie et disséquer la souris suivante jusqu'à ce que tous les échantillons sont acquis. Traiter les souris dans le même ordre de groupe qu'elles ont été injectées et enregistrer la durée de cette étape (voir Fichier supplémentaire "Données d'échantillon"). Chaque souris doit être traitée en moins de 5 min pour limiter la différence dans les temps d'exposition pour les inhibiteurs injectés.</li>
</ol>5. Fractionnement biochimique des échantillons de foie
REMARQUE: La figure 1B montre le schéma de fractionnement.
<ol><li>Transférer chaque échantillon de foie et 7 ml de HB dans un homogénéisateur Dounce de 15 ml. Homogénéiser l'échantillon avec 10 coups de piston lâche et 15 coups de piston serré. Retournez l'homogénéat brut résultant au tube conique de 15 ml dont il provient. Répétez l'opération jusqu'à ce que tous les échantillons de foie aient été homogénéisés.</li>
	<li>Faire tourner les échantillons d'homogénéisme brut à 700 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les noyaux et les débris. Transférer le top 4 ml de supernatant post-nucléaire (S1) dans un tube conique frais de 15 ml.</li>
	<li>Déterminer la concentration en protéines de la fraction S1 à l'aide de Bradford ou d'acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. Ensuite, égalisez les concentrations de tous les échantillons à 2,1 mg/mL ou à la concentration désirée en ajoutant du HB frais à S1 si nécessaire. Les échantillons normalisés sont la fraction « Protéines totales » (Tot). Pour des raisons d'analyse en aval et d'amélioration de la qualité, aliquot 500 'L de la fraction Tot et stocker à -80 oC.</li>
	<li>Transférer 1,5 ml de la fraction tot restante dans un tube de microcentrifuge et tourner à 3 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer 1 ml du supernatant résultant (S2) dans un tube de microcentrifuge frais et mis sur la glace.</li>
	<li>Aspirez le reste du supernatant et lavez le 3 000 x g de granule (3KP) deux fois avec 1,5 ml de HB froid. Le granule 3KP peut être stocké à sec à -80 oC si l'on s'attend à une protéomique en aval. Si l'on ne prévoit que des ballonnements occidentaux, suspendez la pastille 3KP dans 200 L de polyacrylamidede sulfate de sodium polyacrylamide gel électrophoresis (SDS-PAGE) et faites bouillir à 95 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Faire tourner la fraction S2 à 20 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Transférer le supernatant résultant (S3) dans un tube microcentrifuge frais. S3 est la fraction cytoplasmique (Cyto). Pour sDS-PAGE, combiner 150 oL de fraction cyto avec 50 oL de tampon d'échantillon SDS-PAGE 4x et faire bouillir à 95 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez le reste du supernatant de la 20 000 x g de granule (20KP) et lavez deux fois avec 1,5 ml de HB froid. Le granule de 20KP peut être stocké à sec à -80 oC si l'on s'attend à une protéomique en aval. Si l'on ne prévoit que des ballonnements occidentaux, suspendez la pastille de 20 KP dans 100 l de tampon d'échantillon SDS-PAGE et faites bouillir à 95 oC pendant 5 min.</li>
</ol>6. Western Blotting Readout
<ol><li>Afin de quantifier le flux macroautophagique et protéasomal par le biais du ballonnement occidental, composez une solution de stock de gst-LC3b purifié (2 g/mL), p62-His6 (2 g/mL), et Lys48 polyubiquitin lié (K48-Ub, 50 g/mL) dans 1 x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Après ébullition à 95 oC pendant 5 min, aliquot et conserver à -80 oC pour une utilisation future.</li>
	<li>Au moment de SDS-PAGE, générer une courbe standard de 6 points du mélange de protéines standard en diluant en série 1:3 dans 1x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Chargez 10 L de chaque échantillon de courbe standard sur un puits de 26 puits 4 à 12 % SDS-PAGE midi-gel, suivi de normes de protéines présagées (Tableau des matériaux), une norme de poids moléculaire commercial.</li>
	<li>Pour mesurer le flux autophagique, chargez 12 'L d'échantillon 3KP dans chaque puits. REMARQUE: En supposant que des traitements fictifs, de bortezomib et de leupeptin ont été faits et en supposant que 3 souris par traitement, chaque point de temps devrait se composer de 9 échantillons. Par conséquent, chaque midi-gel peut accueillir 2 points de temps plus la courbe standard et une expérience de série de temps typique nécessitera 3 midi-gels pour la lecture.</li>
	<li>Pour mesurer le flux protéasomal, chargez 12 'L de fraction cyto dans chaque puits.</li>
	<li>Séparer les échantillons de protéines par SDS-PAGE et le transférer aux membranes de fluorure de polyvinylide (PVDF) en utilisant des protocoles standard. Si l'on s'attend à des ballonnements occidentaux pour le LC3b, transférez les gels à l'aide d'un tampon de transfert contenant 20 % de méthanol. Dans le cas contraire, utilisez un tampon de transfert contenant 10 % de méthanol, car cela permettra un transfert plus efficace des espèces protéiques de poids moléculaire élevé.</li>
	<li>Effectuer des ballonnements occidentaux à l'aide de protocoles standard. Pour l'analyse du flux macroautophégique, les membranes de tache contenant des échantillons 3KP avec des anticorps anti-p62 ou anti-LC3b (1:1,000) pendant la nuit à 4 oC. Pour l'analyse du flux protéasomal, les membranes de tache contenant des échantillons de Cyto avec la polyubiquitine spécifique d'anti-Lys48 (1:1,000) pendant la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Image western blots à l'aide d'anticorps secondaires standard et des dispositifs d'imagerie. Imagetoutes de toutes les membranes qui constituent une expérience de série chronologique donnée ensemble.</li>
</ol>7. Analyse des données
REMARQUE: Voir Fichier supplémentaire "Données d'échantillon".
<ol><li>Pour effectuer la densitométrie sur des échantillons de taches occidentales, utilisez un logiciel graphiquestandard, Image Studio, ou bien ImageJ.</li>
	<li>Effectuer des mesures densitométriques sur des bandes d'intérêt pour la courbe standard et les échantillons expérimentaux. Dans Image Studio, en utilisant p62 comme exemple, dessinez un long rectangle englobant le monomère de protéines au fond et s'étendant jusqu'au sommet de la membrane. Copier, coller et déplacer le rectangle vers les échantillons restants. Il est important de garder le rectangle utilisé pour la quantification compatible entre les échantillons.</li>
	<li>Enregistrez la quantification dans une feuille de calcul en appuyant sur la feuille de calcul et de lancement en bas à droite de la fenêtre d'analyse.</li>
	<li>Générer une courbe standard densitométrique avec feuille de calcul à l'aide de l'échantillon standard dilué en série et utiliser une régression linéaire ou polynomiale pour obtenir une équation de courbe standard la plus adaptée. À l'aide de cette équation, extrapolez la quantité de p62, LC3b-II ou Lys48-poly Ub dans les échantillons expérimentaux.</li>
	<li>Pour obtenir des mesures de flux, soustrayez la quantité de protéines extrapolées de chaque échantillon traité par inhibiteur de la valeur moyenne des échantillons de PBS à partir du même point de temps (voir Fichier supplémentaire « Données d'échantillons »).</li>
	<li>Évaluer la signification statistique de la variation temporelle du renouvellement des protéines à l'aide d'ANOVA à sens unique. Cela peut être fait à l'aide d'un logiciel de tableur standard.</li>
</ol>

<ol><li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li>
<li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li>
<li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li>
<li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+protein+degradation%3A+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li>
<li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Logic+of+the+26S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li>
<li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li>
<li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Notre protocole décrit un moyen techniquement simple de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines chez les souris à l'aide d'équipements de biologie moléculaire couramment disponibles. En raison de la durée des expériences de la série chronologique et du nombre d'échantillons biologiques impliqués, il est important d'être cohérent dans l'ensemble de l'expérience en ce qui concerne la façon dont les souris sont injectées, le moment de l'acquisition des tissus et le traitement biochimique de Écha...

Les rythmes circadiens se réfèrent à des variations quotidiennes et prévisibles de la fonction biologique qui sont apparentes dans toute la nature. Ils existent à toutes les échelles biologiques, des comportements macroscopiques comme les cycles veille-sommeil, aux phénomènes moléculaires comme l'abondance rythmique des biomolécules. Ces dernières années, la recherche sur les rythmes circadiens a été transformée par la découverte de « gènes de l'horloge » qui sont essentiels pour la génération de rythmes circadiens. Les études dans les souris knock-out de gène d'horloge ont indiqué un rôle central pour des rythmes circadiens en organisant temporellement des processus cellulaires de noyau tels que le métabolisme1. Parmi les façons dont les rythmes circadiens y arriver est de transmettre une structure temporelle au catabolisme protéique.
Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont montré que les deux principales avenues pour le catabolisme des protéines cellulaires, l'autophagie et le système ubiquitine-protéasome, sont soumises à des rythmes diurnes2,3,4,5. L'autophagie représente le bras lysosome-dépendant du catabolisme protéique dans lequel les protéines d'intérêt sont livrées à cet organelle dégradante soit par la construction d'une vésicule nouvelle (macroautophagie) ou par translocation directe par un canal (autophagie médiée par chaperon)6. Le système ubiquitine-protéasome est la principale voie non-lysosomale, où les protéines sont poly-ubiquitinated et ensuite alimentés dans le protéasome, une machine de dégradation macromoléculaire trouvée dans tout le cytoplasme et le noyau7,8. Les rythmes dans l'activité autophagique et protéasomale sont importants parce qu'ils jouent probablement un rôle dans l'entretien ménager cellulaire. En conséquence, il est utile d'avoir une procédure standardisée qui peut détecter les oscillations quotidiennes dans le catabolisme protéique qui est compatible avec les modèles précliniques de maladie.
Ici, nous fournissons notre protocole pour quantifier les variations diurnes dans le flux autophégique dans le foie de souris, qui a servi de base pour le travail dans notre laboratoire3,9. Notre méthode est classée comme un « ruse »10, une approche utilisée par de nombreux groupes pour mesurer l'activité protéolytique (ou flux). Dans cette approche, des inhibiteurs de la protéase spécifiques aux lysosomes ou aux protéasomes sont administrés à des souris, puis des échantillons de tissus sont obtenus après un intervalle de temps fixe. En parallèle, des échantillons de tissus sont obtenus à partir de souris soumises à des injections fictives. Les échantillons de tissus sont homogénéisés, puis biochimiques séparés pour obtenir les fractions lysosome-enrichies et cytoplasmiques. Ces fractions sont ensuite analysées en parallèle par le biais de ballonnements occidentaux à l'aide d'anticorps spécifiques aux marqueurs macroautophanes (LC3b et p62) ou de substrats protéasomals (protéines poly-ubiquitinated). Au fil du temps, les animaux injectés avec des inhibiteurs de la protéase accumulent des protéines qui auraient normalement été recyclées. En conséquence, le taux de rotation est déduit en comparant l'abondance des protéines marqueurs dans les échantillons traités par protéase-inhibiteur aux échantillons traités par faux. En répétant cette méthode à intervalles fixes tout au long de la journée, il est possible de reconstituer les variations circadiennes de la protéolyse (Figure 1A).

<table><tbody><tr><td>4x SDS PAGE Tampon d’échantillon</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>EMD Millipore</td><td>Cat# 5.04314.0001 ; CAS : 179324-69-7</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Membrane PVDF 0,45 micron</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>Cat# IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>K48-linkage Polyubiquitine spécifique (D9D5) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>Cat#8081S ; RRID :AB_10859893</td><td></td></tr><tr><td>LC3a</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UL-430</td><td></td></tr><tr><td>LC3b anticorps</td><td>Novus</td><td>Cat#NB100-2220 ; RRID :AB_10003146</td><td></td></tr><tr><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>de l’anticorps LC3b</td><td>Cat#2775 ; RRID :AB_915950</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>Cat# L2884 ; CAS : 103476-89-7</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# WG1403BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NP0007</td><td></td></tr><tr><td>P62-his</td><td>Novus</td><td>Cat# NBP1-44490</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# 1610373</td><td></td></tr><tr><td>Lapin Anti-P62/SQSTM1</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat#P0067 ; RRID :AB_1841064</td><td></td></tr><tr><td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UC-230</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gels de taille midi</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# WG1403</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST Inhibiteur de protéase</td><td>Comprimés Millipore-Sigma</td><td>Cat# S8830</td><td></td></tr></tbody></table>

mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Les cellules utilisent plusieurs méthodes pour recycler les protéines indésirables et d'autres matériaux, y compris les voies lysosomal et non-lysosomal. La voie lysosome-dépendante principale est appelée autophagie, alors que la méthode non-lysosomale primaire pour le catabolisme de protéine est le système ubiquitine-protéasome. Des études récentes sur des organismes modèles suggèrent que l'activité de l'autophagie et du système ubiquitine-protéasome n'est pas constante tout au long de la journée, mais varie plutôt selon un rythme quotidien (circadien). La capacité de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines est importante pour comprendre comment le contrôle de la qualité cellulaire est atteint et pour comprendre la dynamique de protéines spécifiques d'intérêt. Ici nous présentons un protocole normalisé pour quantifier le flux autophagique et protéasomal in vivo qui capture la composante circadienne du chiffre d'affaires de protéine. Notre protocole inclut des détails pour la manipulation de souris, le traitement de tissu, la fractionnement, et la quantification automatique de flux utilisant le foie de souris comme matériel de commencement.

Les données représentatives sont présentées à la figure 2A,B, et la quantification de ces données est fournie à la figure 2C,D (voir aussi Le fichier supplémentaire « Données d'échantillon »). Par souci de simplicité, nous n'avons pas représenté les commandes de chargement à la figure 2, mais celles-ci doivent être obtenues en parallèle. Typiquement, les taches occidentales contre l...

Nous décrivons notre protocole pour mesurer des rythmes biologiques dans le catabolisme de protéine par l'autophagie et le protéasome dans le foie de souris.

Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Notre protocole permet de mesurer le taux d’autophagie et d’activité protéasomale dans les tissus de souris et est suffisamment sensible pour détecter les variations circadiennes au sein de ces activités. Cette technique peut être utilisée in vivo pour évaluer le catabolisme protéique dans les cellules et les tissus et les matériaux requis sont relativement peu technologiques et accessibles à n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire. Mikhaïl Ryzhikov, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pendant quinze minutes avant chaque point de temps, réchauffer les solutions de bouillon de leupeptine et de bortézomib à température ambiante et diluer le bortézomib décongelé dans un PBS stérile pour produire une solution de travail de 50 milligrammes par millilitre. Pour l’administration d’inhibiteurs de la protéase, injectez intrapétoneally 40 milligrammes par kilogramme de leupeptine ou 1,6 microgramme par kilogramme de bortézomib dans chaque animal expérimental. Pour un contrôle négatif, injecter aux souris 0,5 millilitres de PBS.Retournez chaque souris dans des cages regroupées par le type de traitement reçu au fur et à mesure qu’elles sont injectées et enregistrez

measuring-diurnal-rhythms-in-autophagic-and-proteasomal-flux

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Cette vidéo montre comment mesurer l’activité du protéasome dans différents compartiments subcellulaires de l’amygdale latérale à partir de cerveaux de rats conditionnés par la peur et contrôler à l’aide d’un test peptidique fluorogénique. Le protéasome clive le substrat peptidique fluorogène, libérant des molécules fluorescentes, qui sont quantifiées à l’aide d’un lecteur de plaques pour évaluer l’activité du protéasome dans les fractions protéiques nucléaires et synaptiques. L’augmentation de...

Mesure de l’activité du protéasome dans différents compartiments subcellulaires du cerveau du rat

L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Microscopie time-lapse de marqueurs de l'autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l'autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l'autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d'une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Ici, la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d'autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.

Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

Mitophagy, la dégradation sélective des mitochondries, a été impliquée dans l’homéostasie mitochondriale et est déréglementé dans diverses maladies humaines. Cependant, les méthodes expérimentales commodes pour mesurer l’activité de mitophagy sont très limitées. Ici, nous fournissons une analyse sensible pour mesurer l’activité mitophagy à l’aide de cytométrie en flux.

Mesure sensible des Mitophagy par Flow Cytometry à l’aide de la fonction du pH Fluorescent journaliste mt-Keima

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Ce protocole décrit le flux de travail pour le marquage métabolique des cellules sénescentes et non divisées avec SILAC pulsé, l’analyse par spectrométrie de masse non ciblée et un calcul rationalisé des demi-vies des protéines.

Mesure des taux de renouvellement des protéines dans les cellules cultivées sénescentes et non divisées avec marquage métabolique et spectrométrie de masse

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Une technique pour recueillir et mesurer les médiateurs biochimiques plaie chirurgicale à des moments précis.

Recueillir et mesurer les médiateurs nociceptifs et inflammatoires dans les plaies chirurgicales

Découvrez une méthode pour mesurer les rythmes diurnes du flux autophagique et protéasomal dans le foie de souris. Cette technique in vivo permet d'évaluer le catabolisme protéique avec des matériels accessibles.

Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

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