Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

Les tissus utilisés pour l’immunohistochimie et l’histopathologie diagnostique sont systématiquement fixés dans du for formel tampon à 10% phosphate. La détection de l’antigène du virus de la rage dans le tissu cérébral qui a été fixé dans le formaline présente un défi unique, et le test IHC s’est avéré être une méthode sensible et spécifique pour la détection de l’antigène du virus de la rage. Le principal avantage de la biopsie ou d’autres méthodes de détection est que les antigènes peuvent être détectés par rapport à la morphologie tissulaire et cellulaire.

Avec l’IHC, la localisation de l’antigène de la rage dans les tissus cérébraux et non cérébraux, fournit des informations supplémentaires qui ne pourraient pas être obtenues par des sections de coloration de routine à l’hématoxyline et à l’éosine. Les tests de diagnostic de la rage sont importants pour le début de la prophylaxie post-exposition chez les humains exposés au virus de la rage. L’IHC est l’un des tests les plus couramment effectués sur les tissus fixés au for formel.

Avec des anticorps spécifiques, il peut être utilisé pour la détection d’agents pathogènes respectifs. Pour commencer cette procédure, placez des morceaux de tissu cérébral de trois à cinq millimètres, prélevés après une autopsie, dans une solution de forme tamponnée à 10% pendant 24 à 72 heures. Notez le poids approximatif des tissus, le type de tissu et le volume de forme.

Placez les tissus dans de l’éthanol à 70% pour un stockage plus long des tissus après la fixation du forgé et avant le traitement. Après la fixation de l’échantillon, disséquez le tissu pour inclure les zones importantes du cerveau, telles que les coupes transversales du tronc cérébral, du cervelet ou de l’hippocampe. Chacun, coupé à une épaisseur comprise entre trois et cinq millimètres.

Placez les tissus dans des cassettes de traitement. Traiter les cassettes de tissu pour l’infiltration de cire de paraffine. Intégrez-les dans des blocs de paraffine et sectionnez-les sur un microtome.

Configurez d’abord le plat de coloration comme indiqué à la figure 1 du protocole de texte. Remplissez chaque plat avec 250 millilitres de la solution préparée. Pour préparer la solution de substrat d’AEC, utilisez une pipette en verre pour dissoudre un comprimé de 20 milligrammes d’AEC dans 5 millilitres de N, N-Diméthylformamide.

Pour préparer la solution souche de protéase, dissoudre 7 milligrammes de protéase dans 200 millilitres de PBS. Pour préparer le tampon de rinçage, ajoutez 100 millilitres de Tween 80 à 990 millilitres de PBS, et mélangez bien pour former une solution homogène de PBT-T. À l’aide d’un microtome, faites une section de paraffine de cinq micromètres.

Chargez la section au bain-marie à 38 degrés Celsius et rassemblez-la sur des lames de verre. Étiquetez les lames avec un stylo résistant aux réactifs. Placez les lames sur un plateau et faites fondre dans un four à 55 à 60 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, retirez les lames du four et déparaffinez-les immédiatement, en utilisant 3 rinçages au xylène consécutifs de 5 minutes chacun. Après cela, réhydratez les sections de la lame par immersions séquentielles dans des dilutions décroissantes d’éthanol en eau désionisée, comme indiqué dans le protocole de texte. Traiter les lames avec la protéase pendant 30 minutes pour la récupération de l’antigène protéolytique, puis rincer les lames dans PBS-T pendant 10 minutes et les traiter avec du peroxyde d’hydrogène à 3% pendant 10 minutes.

Après cela, lavez à nouveau les lames avec PBS-T pendant 10 minutes. Pour commencer, retirez une lame du tampon, en vous assurant de ne manipuler qu’une seule lame à la fois, tandis que les autres restent immergées, et utilisez une serviette en papier pour éponger l’excès de tampon autour de la section de tissu. Placez les lames dans une chambre humide et incubez avec du sérum de chèvre normal à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, incuber les lames dans la chambre d’humidité avec l’anticorps antirabique primaire à dilution prédéterminée optimale et les anticorps témoins négatifs, à température ambiante pendant 60 minutes sans lavage entre les deux. Après cela, lavez les lames avec du PBS-T pendant 10 minutes et incubez dans une chambre d’humidité avec l’anticorps biotinylé à température ambiante pendant 15 minutes. Lavez à nouveau les lames avec PBS-T pendant 10 minutes.

Incuber les glissières et la chambre d’humidité avec la division en bande et le complexe HRB à température ambiante pendant 15 minutes et laver le PBS-T pendant 10 minutes. Ensuite, incuber avec de l’AEC dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 10 minutes. Lavez les lames dans de l’eau désionisée pendant 10 minutes et contre-tache avec l’hématoxilyn de Gill, diluée une à deux avec de l’eau désionisée pendant deux minutes.

Après cela, rincez l’excès d’hématoxyline en rinçant les lames par trempage dans de l’eau désionisée. Rincez les lames dans l’eau du robinet de Scott pendant 30 secondes et lavez-les à l’eau désionisée pendant 10 minutes. Retirez les glissières une à la fois et montez-les avec un support de montage soluble dans l’eau.

Ensuite, utilisez un microscope optique pour lire les diapositives. Dans cette étude, un test chimique immunocytaire est démontré pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel. Un résultat représentatif de coloration chimique immunocytaire d’échantillons témoins positifs et négatifs dans différents tissus cérébraux est montré ici, y compris le tronc cérébral, les cellules du cervelet et du purkinje, et l’hippocampe.

La coloration rouge magenta, qui indique le développement de la couleur en utilisant un substrat AEC sur le fond bleu contre-coloré, est due à la réactivité des anticorps contre l’antigène de la rage. Un résultat positif en immunohistochimie correspond à la coloration rouge magenta dans les sections de tissus. La coloration des inclusions cytoplasmiques et des inclusions granulaires de taille variable indique que les échantillons sont positifs pour les infections à RABV.

Les échantillons sont considérés comme négatifs si aucune coloration rouge spécifique ou seulement le fond bleu, dû à l’hématoxyline, n’a été observé. En plus de la coloration positive, la distribution des inclusions pourrait fournir une quantification indirecte des niveaux d’antigène de la rage dans l’échantillon, ce qui pourrait correspondre à la charge virale de l’échantillon de tissu. Quels que soient les niveaux de distribution, toute coloration spécifique classera l’échantillon comme positif pour la détection de l’antigène RABV.

Les tissus doivent être fixés adéquatement dans le for formel et éviter de congeler les tissus pendant ce processus. L’antigène de la rage est détecté par l’IHC, puis des techniques moléculaires peuvent être effectuées sur des coupes de paraffine pour déterminer la variante du lyssavirus en fonction des informations de séquence d’ARN. Les réactifs comme le xylène et le forme doivent être manipulés dans des hottes.

Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de l’AEC car il s’agit d’un cancérogène.