Name: Un régime sans sang pour les moustiques anophèles arrière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Découvrez un régime artificiel sans sang pour élever les moustiques Anopheles, évitant les contraintes éthiques du sang animal. Cette méthode facilite la recherche sur le paludisme et améliore l'élevage d'insectes.

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Nous tenons à remercier Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) pour son soutien technique, Joana Gomes et Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) pour le maintien des colonies de moustiques Anopheles. Financé par la Fondation Bill et Melinda Gates (OPP1138841), Fundaçao para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Des souris ont été obtenues de la maison d'animalie d'IHMT. Les expériences sur les animaux ont été menées dans le strict respect de la loi portugaise et des lignes directrices pour l'utilisation d'animaux de laboratoire. Le Direça-Geral de Veterinaria, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal a approuvé tous les protocoles d'étude (approbations d'id: 023351 et 023355).
REMARQUE : Effectuez tous les tests d'alimentation à 26 oC.
1. Les moustiques
<ol><li>Maintenir Anopheles coluzzii (ancienne forme Anopheles gambiae M) Moustiques de la souche Yaoundé à 26 oC, 75 % d'humidité sous une lumière de 12 h :12 h : cycle sombre. Maisons les moustiques en utilisant des conditions insectaires standard pour garantir l'accouplement.</li>
	<li>Recueillir les pupae de moustiquedans un petit récipient d'eau. Placez le contenant à l'intérieur d'une cage à moustiques pour permettre aux moustiques adultes d'émerger et de s'accoupler. Fournir une solution d'alimentation au glucose de 10 %. Trois jours après l'émergence recueillir le nombre nécessaire de moustiques de la cage de stock à l'aide d'un aspirateur.</li>
	<li>Un jour avant les essais d'alimentation, retirez la solution d'alimentation au glucose de 10 %. REMARQUE : 3 moustiques d'un jour ont été utilisés tout au long des expériences.</li>
</ol>2. Alimentation des moustiques
<ol><li>Préparation de régimes liquides artificiels<ol>
<li>Préparer les régimes liquides artificiels dans des conditions stériles dans une armoire à débit laminaire. Préparer le régime riche liquide (r-liq_diet) en ajoutant ce qui suit au régime liquide initial (i-liq_diet; Le milieu eagle modifié de Dulbecco [glucose élevé avec L-glutamine], voir tableau 1) : 0,55 g/L ATP, 1 g/L de cholestérol et 200 g/L d'albumine de sérum bovin (BSA). Mélanger tous les ingrédients à fond et filtrer à l'aide d'un microfiltre de 0,45 m. REMARQUE : Ne stockez pas les régimes; préparer des régimes fraîchement à partir des solutions de stock pour chaque expérience car ils perdent la qualité lorsqu'ils sont stockés. Les composantes des régimes alimentaires sont décrites dans le tableau 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collecte de sang de souris<ol>
<li>Anesthésiez les souris femelles CD1 de 6 à 8 semaines (Mus musculus) avec de la kétamine (120 mg/kg) et de la xylazine (16 mg/kg) en utilisant la voie intrapéritonéale.</li>
		<li>Effectuer une ponction cardiaque (figure 1) lorsque la souris ne montre aucune réaction musculaire en réponse à différents stimuli physiques (p. ex., pincements d'orteil et de queue).</li>
		<li>Recueillir le sang à l'aide d'une seringue stérile de 1 ml avec une aiguille de 27 G x 1/2 (0,4 x 12 mm2) qui contient 100 l d'héparine de 1 mg/mL (sel de sodium) pour prévenir la formation de caillots sanguins. Maintenir le sang à 37 oC à l'aide d'un bain d'eau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentation artificielle<ol>
<li>Recueillir environ 30 moustiques femelles de la cage à stock à l'aide d'un aspirateur.</li>
		<li>Transférer les moustiques femelles dans des gobelets en papier de 500 ml et couvrir d'une fine maille de moustiquaire afin qu'ils ne puissent pas s'échapper. Appliquer une mangeoire en verre reliée à des tubes en plastique pour maintenir un débit d'eau constant au sommet de chaque tasse (Figure 2). Fournir un débit d'eau constant à la tuyauterie cylindrique et la mangeoire de sorte que la température à l'intérieur est maintenue à environ 37,5 oC. REMARQUE : Un appareil d'alimentation artificielle standard de cloche en verre16 a été employé pour fournir les régimes formulés aux moustiques femelles.</li>
		<li>Étirez la membrane de film de paraffine à travers l'embouchure de la mangeoire en verre pour contenir le repas.</li>
		<li>Préchauffer l'i-liq_diet et le r-liq_diet à 37 oC à l'aide d'un bain d'eau. Appliquer 1 ml dans la mangeoire en verre. Nourrir les moustiques pendant 60 min dans l'obscurité avec soit i-liq_diet, r-liq_diet ou du sang de souris fraîche. Effectuer des essais à 26 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Évaluation du taux d'alimentation.<ol>
<li>Après l'alimentation artificielle, anesthésier à froid les moustiques à -20 oC pour 30 s. Placer les moustiques dans un plat Petri réfrigéré.</li>
		<li>Enregistrez le nombre de moustiques femelles entièrement engorgées (figure 3). REMARQUE : Le pourcentage de moustiques nourris est utilisé comme indicateur du succès de l'alimentation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Traits d'histoire de la vie
<ol><li>Production et fertilité d'oeufs<ol>
<li>Transférer les femelles entièrement engorgées, à l'aide d'un pinceau, dans des cages individuelles (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Gardez les moustiques à 26 '1 'C, 75% d'humidité et un 12 h:12 h de lumière:cycle sombre avec 10% de glucose ad libitum.</li>
		<li>Quarante-huit h après l'alimentation, ajouter un papier filtre humidifié au fond pour la ponte (Figure 4). Compter les œufs à 48 h et 72 h après l'ajout du papier de ponte à l'aide d'une loupe de poche. Inonder le papier filtre d'eau distillée pour recueillir les œufs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mortalité des larves<ol>
<li>Recueillir les œufs dans des plateaux (23 cm x 15 cm x 6 cm) remplis d'eau distillée (figure 5). Maintenir le niveau d'eau dans les plateaux constant séminaud pendant les expériences.</li>
		<li>Nourrir les larves quotidiennement avec environ 13 mg d'aliments pour poissons de fond par plateau. Appliquer un régime d'alimentation similaire à tous les plateaux de repli.</li>
		<li>Enlever les pupae mortes et les larves tous les jours. Finaliser les expériences lorsque toutes les puneuses se sont développées en adultes et compter le nombre de mâles et de femelles adultes.</li>
		<li>Enregistrez les dates d'éclosion et de décès et calculez les taux de mortalité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Longévité<ol>
<li>Recueillir 15 mâles adultes et 15 femelles adultes de la génération F1 de chaque groupe alimentaire. Gardez les mâles et les femelles dans la même cage.</li>
		<li>Nourrir les adultes avec une solution de glucose de 10% ad libitum. Retirez les adultes morts tous les jours.</li>
		<li>Maintenir les moustiques à la même température, l'humidité, les conditions du cycle léger et le régime d'alimentation en sucre comme décrit ci-dessus.</li>
		<li>Enregistrez les dates de décès et calculez la longévité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesure de la longueur des ailes<ol>
<li>Anesthésiez à froid les moustiques adultes F1 de cinq jours (mâles et femelles) de chaque groupe alimentaire à -20 oC pour 90 s.</li>
		<li>Sous un stéréoscope, saisissez délicatement le thorax de chaque moustique avec des forceps et placez-le côté ventral vers le haut.</li>
		<li>Recueillir les deux ailes à l'aide d'un scalpel et les placer sur une lame de microscope propre contenant une goutte séchée de milieu de montage. À l'aide d'une aiguille de 20 G, ajoutez des supports de montage supplémentaires aux bordures de la glissière et abaissez lentement la couverture sur les ailes.</li>
		<li>Mesurer la longueur de l'aile (figure 6) à l'aide d'un stéréoscope à l'aide d'un micromètre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le succès de notre régime sans sang formulé est probablement le résultat de l'effet physiologique synergique de tous les composants ajoutés à l'i-liq_diet (riche en sucre, acides aminés, vitamines et microéléments): BSA (source de protéines), ATP (phagostimulant) et cholestérol (source lipidique). La supplémentation du r-liq_diet avec les composants individuels seuls n'était pas efficace en stimulant la production d'oeufs (données non montrées). Un inconvénient du protocole pourrait être le coût de certains des composants, tels que le cholestérol. Malgré cela, sa présence est fondamentale, car les insectes sont incapables de le synthétiser19 et cette molécule est le précurseur des hormones ecdystéroïdes qui régulent la synthèse du jaune et la maturation des œufs chez les arthropodes20. Des quantités plus faibles de cholestérol doivent être testées afin d'optimiser la quantité nécessaire dans le but de réduire les coûts et d'augmenter les avantages de l'alimentation artificielle.
Une autre limitation de la méthode est que le régime artificiel doit être fraîchement préparé à partir de solutions de stock, comme une fois préparé dans sa forme liquide finale, il perd de la qualité après stockage. À l'avenir, notre régime alimentaire formulé pourrait être préparé comme une puissance séchée, similaire à SkitoSnackt, un substitut de repas de sang artificiel pour les moustiques Aedes aegypti 21.
En plus de fournir les nutriments nécessaires, un repas artificiel doit attirer et stimuler les moustiques femelles à se nourrir de la même manière que lorsqu'ils se nourrissent de sang frais vertébré. Le régime artificiel sans sang décrit ci-temps a eu comme conséquence une augmentation de 20% des moustiques femelles entièrement engorgés comparés au groupe de sang vertébré alimenté. Cette mesure indirecte de l'attraction pourrait être clarifiée en utilisant des olfactomètres pour confirmer que le régime artificiel est plus attrayant et plus attrayant pour les moustiques que le sang frais.
L'impact le plus élevé de l'alimentation sur la mortalité larvaire a été observé chez les larves dérivées de moustiques nourris avec du sang, ce qui suggère qu'un régime artificiel de composition stable peut contribuer à réduire la mortalité et à améliorer le succès de la reproduction des moustiques par rapport au sang frais. L'issue moins prévisible d'un repas de sang peut résulter des variations d'hôte dans la composition17 et de la présence dans le sang des molécules qui peuvent interférer avec la physiologie de moustique22. Les faits précédents soulignent les avantages pour l'élevage de moustiques de haute qualité de régimes sans sang frais.
Dans l'ensemble, le nombre moyen d'œufs pondus dans notre étude était faible par rapport à ceux signalés chez certains insectaires, mais le nombre moyen d'œufs oviposites était comparable à la souche d'études en laboratoire A. gambiae nourrie au sang humain (22,6 à 5,5 œufs/femelle)23. Aucune différence statistique significative n'a été observée entre nos groupes expérimentaux nourris de sang frais ou de repas artificiels (tableau 2), suggérant que la mise en œuvre d'un système d'alimentation à membrane artificielle avec notre régime formulé est suffisante pour maintenir et propager les colonies de moustiques anophèles en captivité.
Les repas artificiels sans sang peuvent maintenir les colonies d'Aedes 22,mais lorsqu'ils sont appliqués aux moustiques anophèles, ils sont de succès limité ou nul11. Récemment, un repas artificiel à base de plasma pour les moustiques anophèles a été décrit24, mais les taux d'alimentation et le potentiel reproducteur était faible. Nos résultats représentent une avancée substantielle dans l'état de l'art (révisé par Gonzales et Hansen11) que notre r-liq_diet formulé avait une performance similaire ou meilleure que le repas de sang vertébré standard. D'autres améliorations de la stabilité et du coût du stockage devraient élargir la portée de son application.

Les maladies à transmission vectorielle touchent plusieurs millions d'êtres humains dans le monde et causent des millions de décès chaque année. Ils sont transmis par des insectes infectés par des micro-organismes pathogènes (protozoaires, virus) acquis lorsqu'ils se nourrissent du sang d'un hôte infecté. Par la suite, le vecteur infecté transmettra l'agent pathogène à un nouvel hôte au cours du prochain repas sanguin. Le paludisme est la maladie à transmission vectorielle la plus mortelle qui est transmise par plusieurs espèces différentes de moustiques anophèles et touche 40 % de la population mondiale1. Le parasite protiste du paludisme est responsable de plus de 400 000 décès chaque année, dont la plupart sont des enfants de moins de 5 ans (Organisation mondiale de la santé). Le moustique femelle Anopheles transmet le parasite du paludisme du genre Plasmodium entre les humains et d'autres animaux lorsqu'il se nourrit de sang vertébré, une étape nécessaire pour la production et le développement d'œufs2.
Les stratégies actuelles d'éradication du paludisme et d'autres maladies transmises par les moustiques vecteurs mortels émergents reposent sur le développement de stratégies novatrices de lutte contre les moustiques3,4,5, qui comprennent la libération dans la nature d'un grand nombre de moustiques élevés dans des insectes. Cependant, un facteur limitant crucial est la dépendance à l'approvisionnement en sang frais pour l'élevage et la reproduction efficaces des moustiques. La composition variable du sang vertébré peut avoir un impact négatif sur la fertilité et la progenénité des moustiques et limiter la fiabilité et la durabilité des colonies reproductrices captives. Les programmes de libération et de lutte contre les moustiques nécessitent des systèmes de production de moustiques à grande échelle et un approvisionnement régulier en grandes quantités de sang vertébré. Il s'agit d'un obstacle majeur pour la production de moustiques et soulève une série de questions éthiques liées à l'utilisation d'animaux vivants et les limitations logistiques causées par les règlements de sécurité exigeants connexes. Cela rend les coûts d'entretien et de sécurité des colonies de moustiques élevés et remet en question la durabilité des pratiques actuelles d'élevage des moustiques, en particulier dans les pays à faible revenu où la menace du paludisme est beaucoup plus grande.
Récemment, la recherche a été axée sur le développement de substituts sanguins qui imitent un repas de sang vertébré, mais jusqu'à présent, seul succès limité a été atteint6,7,8,9. Un régime artificiel réussi doit (1) provoquer l'engorgement complet de moustique femelle, (2) déclencher la production de vitellogenin, (3) produire de grandes quantités d'oeufs viables, et (4) produire la progéniture bruyère10. En outre, les régimes artificiels ont une composition standard et sont donc plus fiables pour la production de moustiques à des fins de recherche et de lutte. Des régimes sans sang ont été développés pour les moustiques Aedes (révisés par Gonzales et Hansen11), mais pas pour Anopheles spp. Les régimes artificiels existants contiennent un phagostimulant (p. ex., ATP10), une source de protéines pour la maturation des œufs6,12, les glucides comme source d'énergie, et les acides aminés (aa)13 qui sont fondamentaux pour la production d'œufs et sont un facteur limitant majeur pour la fertilité14. Un régime artificiel sans sang doit également fournir le cholestérol15, ce qui améliore la production d'œufs. Ici nous décrivons un régime sans sang artificiel pour les moustiques femelles d'anophèle et démontrons qu'il a une exécution cohérente et équivalente à un repas de sang vertébré de haute qualité.

<table><tbody><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate (ATP) sel disodique hydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A790G</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>MP Biomedicals</td><td>199342</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified Eagle’s medium (teneur élevée en glucose avec L-glutamine)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Montage Entellan moyen</td><td>Merck</td><td>1079610100</td><td></td></tr><tr><td>Glassfeeder</td><td>Vitrier local</td><td>par conception</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Sodium Salt</td><td>Pan Reac AppliChem</td><td>A3004,0001</td><td></td></tr><tr><td>Imalg&egrave ; ne 1000</td><td>Merial, Portugal</td><td>01MER122</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 20 G x 1" 0,9 x 25 mm aiguille</td><td>Terumo Europe</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer, Portugal</td><td>7427831</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisation Millex-HV 0,45</td><td>Millipore</td><td>SLHVR25KS</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 1ml, 27 G x &frac12 ; " Aiguille 0,4 x 12 mm</td><td>Terumo Europe</td><td>BS-NIN2713</td><td></td></tr><tr><td>Teich Mix Astra Pond</td><td>Astra</td><td>4030733100957</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Flakes</td><td>Tetra</td><td>4004218742642</td><td></td></tr></tbody></table>

un régime sans sang pour les moustiques anophèles arrière

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

La recherche sur le paludisme exige des conditions de reproduction et de production à grande échelle pour les moustiques(Anopheles spp.) en captivité. La production durable et fiable de moustiques est actuellement inhibée par l'approvisionnement en sang vertébré frais. Des solutions de rechange au sang sont nécessaires pour promouvoir des stratégies de lutte efficaces contre le paludisme et d'autres maladies à transmission vectorielle transmises par les insectes qui se nourrissent de sang. Dans cet esprit, les régimes liquides artificiels ont été formulés comme substituts au sang frais de vertébré. Ici, nous rapportons un régime liquide artificiel sans sang qui fournit des taux d'alimentation similaires au sang et imite les effets physiologiques d'un repas de sang vertébré frais. Le régime induit la maturation ovarienne et d'oeuf des moustiques d'anophèle et produit également la bonne survie larvaire et le développement des adultes fonctionnels. Le régime liquide sans sang formulé est une avancée importante vers une reproduction durable des moustiques en captivité et réduira les coûts d'entretien des colonies de moustiques et éliminera le besoin de sang vertébré frais.

Les résultats décrits ci-dessous comparent les performances des moustiques anophèles femelles nourris avec le repas artificiel riche formulé (r-liq_diet) et les moustiques nourris sur le régime liquide initial (i-liq_diet) ou un repas de sang frais. Le régime a été testé selon le protocole schématique décrit à la figure 7. Le r-liq_diet décrit ci-dessous fait partie d'un brevet (PCT/IB2019/052967).
Pourcentage de femelles entièrement engorgées
Le nombre de moustiques femelles engorgés nourris avec le r-liq_diet (89%) était significativement plus élevé que le nombre de femelles engorgées nourries de sang (56 %) (Figure 8).
Fécondité et fertilité
La fécondité et la fertilité féminines pour le premier cycle gonotrophique ont été utilisées pour évaluer la qualité nutritionnelle des i-liq_diet et r-liq_diet. En moyenne, 24 à 11 œufs ont été pondus par des femelles nourries de sang vertébré frais, tandis que les femelles nourries au r-liq_diet pondaient en moyenne de 25 à 5 œufs(tableau 2). Aucune ponte n'a été observée par les femelles nourries sur le i-liq_diet.
Mortalité F1
La condition physique des moustiques F1 a été évaluée entre les colonies nourries au sang de vertébrés ou le r-liq_diet. Des larves, des pupae et la mortalité adulte ont été enregistrées. La variabilité (erreur standard de la moyenne [SEM]) était plus élevée chez les moustiques nourris au sang(figure 9 et tableau 2) par rapport aux moustiques nourris au r-liq_diet. La génération F1 de moustiques nourris au sang ou au r-liq_diet avait des taux de mortalité et de survie comparables.
Espérance de vie F1
Le Center for Disease Control and Prevention estime que les moustiques femelles adultes sauvages vivent jusqu'à un mois, mais ne survivent probablement pas pendant plus d'une semaine et demie et que les mâles vivent environ une semaine et se nourrissent exclusivement de nectar et d'autres sources de sucre. Il est à noter que les différences dans l'apport alimentaire des parents peuvent affecter la survie de la progéniture demoustiques 17. Dans notre expérience, les femelles adultes et les mâles dans le sang (femelle s'il y a 24,5 à 6,8; mâle sa il y a 18,5 à 6,9) et le r-liq_diet (femelle : 22,5 à 8,1; mâle : 11,9 à 6,9) les groupes avaient une espérance de vie moyenne similaire(tableau 3) et les femmes présentaient une durée de vie accrue par rapport aux hommes.
Taille du corps F1
La longueur de l'aile a été utilisée comme indicateur de la taille du corps adulte. Par rapport à d'autres espèces, les anophèles adultes sont des moustiques de petite à moyenne taille avec une longueur d'aile comprise entre 2,8 et 4,4 mm longueur d'aile18. La taille du corps adulte des moustiques F1 Anopheles nourris au r-liq_diet se situe dans la fourchette prévue et est semblable aux moustiques insectifs nourris au sang (figure 10).
Analyse statistique
Les données présentées représentent la moyenne d'au moins trois expériences indépendantes (sauf indication contraire). Les barres d'erreur représentent le SEM. Lorsque les données ont suivi une distribution gaussienne, des groupes indépendants ont été comparés à l'aide du test t de l'étudiant, sinon le test Mann-Whitney a été appliqué. Les différences entre les groupes nourris au régime artificiel ont été analysées à l'aide du test exact du pêcheur et ont été considérées comme significatives à P - 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> Figure 1 : Collecte de sang de souris CD1 par perforation intracardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> Figure 2 : Appareil d'alimentation artificielle standard. La mangeoire en verre contient des r-liq_diet qui sont nourris aux moustiques anophèles femelles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> Figure 3 : Moustiques anophèles après alimentation artificielle. De gauche à droite : une femelle entièrement engorgée qui s'est vu offrir une liq_diet r, une femelle non engorgée qui s'est vu offrir une femme r-liq_diet, mâle et entièrement engorgée qui s'est vu offrir du sang de souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> Figure 4 : Oeufs d'anophèle pondus 48 h après l'alimentation des femelles avec le r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> Figure 5 : Stades de larves L2 qui se sont développés à partir des œufs et qui ont été recueillis sur du papier filtre et placés dans des plateaux contenant de l'eau distillée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> Figure 6 : Aile droite d'une génération F1 d'un moustique femelle Anopheles coluzzii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> Figure 7 : Protocole schématique des tests de régime artificiel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> Figure 8 : Taux d'alimentation des moustiques femelles nourries soit par les régimes artificiels, soit par le sang. Les astérisques indiquent des différences significatives entre les moustiques nourris avec les régimes r-liquide et i-liquide et le groupe témoin alimenté par le sang. Test exact de Fisher à deux face : P 0,0001 (risque relatif : 0,4828, 95% de confiance Niveau [CL]: 0.3776 à 0.6194) pour le régime r-liquide contre le sang,'P ' 0.0335 (risque relatif: 1.379, 95% CL: 1.044 à 1.836) pour le sang par rapport à l'alimentation i-liquide. Bleu: non nourri; rouge: nourri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> Figure 9 : Effet du repas sans sang formulé sur la mortalité et le rapport hommes/femmes des moustiques F1 Anopheles coluzzii. Trois expériences indépendantes ont été réalisées, chacune utilisant 30 moustiques par régime. Un t-test non apparié n'a montré aucune différence significative entre le groupe de sang-alimenté et le groupe de r-liq_diet alimenté(valeurs de P ont varié de 0.5047 à 0.8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> Figure 10 : Longueur de l'aile. La distance entre l'incision axiale et la veine R4-5 à l'exclusion de l'ensemble de franges a été utilisée pour déterminer la longueur de l'aile. La taille a été évaluée pour 5 femelles et 5 mâles de chaque groupe diététique (moyenne - SEM). Les valeurs sont représentées comme la moyenne - SEM. Saumon: r-liq_diet; rouge : sang vertébré. T-test non apparié; aile gauche féminine : t 1.300, df 8, P 0,2298; aile gauche masculine : t 2,400, df 8, P 0,0432; aile droite féminine : t 1.300, df 8, P 0,2298; aile droite masculine : t 2,277, df 7, P 0,0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composants</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triphosphate d'adénosine</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumin de sérum bovin</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cholestérol</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de calcium anhydre anhydre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de choline</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pantothénate D-calcium (vitamine B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anhydrous d-glucose</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide folique</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycine</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-inositol (I-inositol)</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-arginine monohydrochlorure</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dihydrochlorure de L-cystine</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monohydrate de monochlorure de L-histidine</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monochlorure de L-lysine</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-méthionine</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-phénylalanine</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-serine</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-thréonine</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tryptophane</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dihydrate de sel de lisodium de L-tyrosine</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-valine</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anhydre de sulfate de magnésium</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niacinamide (nicotinamide)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rouge phénol</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de potassium</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyridoxine Monohydrochlorure</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sel de sodium à l'acide pyruvic</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riboflavine (vitamine B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bicarbonate de sodium</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de sodium</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anhydrous monobasic de phosphate de sodium</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amonohydrochlorure de thiamine (vitamine B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Seulement en r-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Composition du régime i-liquide et du régime r-liquide.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Nombre total d'œufs (SEM)</td>
			<td>Oeufs/femelles (SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sang</td>
			<td>733 à 330</td>
			<td>De 24 à 11 ans</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 à 164</td>
			<td>25 à 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Lots d'œufs produits par les femelles Anopheles coluzzii. Trois expériences indépendantes ont été réalisées pour chaque régime expérimental utilisant 30 moustiques femelles dans chacun.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Femmes (jours et SEM)</td>
			<td>Mâles (jours et SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sang</td>
			<td>24,5 à 6,8</td>
			<td>De 18,5 à 6,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22,5 à 8,1</td>
			<td>De 11,9 à 6,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Espérance de vie des moustiques F1 Anopheles. La longévité des moustiques F1 à partir de F0 nourris artificiellement a été évaluée en enregistrant les dates de naissance et de décès de chaque moustique provenant du même groupe alimentaire (15 femelles et 15 mâles ont été suivis). Les résultats sont représentés comme la durée de vie moyenne des moustiques par groupe de régime.

Un protocole est présenté pour la formulation d'un régime artificiel sans sang pour nourrir les moustiques anophèles en captivité. Ce régime a une performance similaire au sang vertébré et déclenche l'oogenèse et la maturation des œufs et produit une descendance adulte viable.

Un régime sans sang pour les moustiques anophèles arrière

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Les parasites du paludisme tels que les moustiques qui jouent un rôle majeur dans la propagation de la maladie. Jusqu’à présent, il a été impossible d’élever les moustiques antipaludiques sans sang. Et pour surmonter cette limitation, notre protocole décrit un régime de remplacement du sang qui est capable de soutenir la reproduction des moustiques dans l’insecte.L’utilisation d’un régime sans sang est très avantageux sur le sang. Un régime sans sang n’a pas les contraintes éthiques que l’utilisation de sang humain, ou des animaux expérimentaux. Le remplacement des animaux à l’expérimentation fait partie de notre politique de trois R.Remplacer, réduire, affiner. Le fait de ne pas utiliser de sang réduit les coûts et la logistique associée à la collecte, au stockage et à l’entretien du sang rouge. L’utilisation de régimes artificiels peut faciliter l’essai des molécules d’anti plasmodium.Jusqu’à présent, nous avons testé notre alimentation en utilisant différentes espèces d’anophèles. Dans tous, le régime alimentaire était bien engorgé par les femelles et permettait la production et la ponte d’œufs. Nous croyons que ce régime a une utilisation potentielle pour l’élevage d’autres espèces de moustiques.En fait, nous le testons maintenant pour les aedes, un vecteur de nombreuses maladies telles que la dengue, le virus Zika ou la fièvre jaune. Maintenir anopheles coluzzii yaonde souche moustiques dans une pièce à 26 degrés Celsius, 75% d’humidité, et sous un cycle sombre de lumière de 12 heures à 12 heures. Abritez les moustiques en utilisant des conditions insectifuges standard dans une seule cage pour garantir l’accouplement.Utilisez une pipette en plastique pour recueillir les pupes moustiques dans un petit récipient d’eau. Placez le contenant à l’intérieur d’une cage à moustiques pour laisser les moustiques adultes émerger et s’accoupler. Fournir une solution d’alimentation à 10% de glucose dans la cage.Trois jours après l’émergence, utiliser un aspirateur pour recueillir le nombre nécessaire de femelles de la cage de stock dans une tasse en papier. Pour distinguer, les femelles sont plus grandes et les mâles ont une trompe plus large et plumeuse. Un jour avant les sentiers d’alimentation, retirez la solution d’alimentation à 10 % de glucose.Le lendemain, préparez des régimes liquides artificiels dans des conditions stériles dans l’armoire à écoulement laminaire selon le manuscrit. Ajouter tous les ingrédients dans un tube en plastique. Bien mélanger tous les ingrédients et filtrer à l’aide d’un microfiltre de 0,45 micron.Remplissez une seringue stérile de 1 millilitre munie d’une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27 avec 100 microlitres d’un milligramme par millilitre d’héparine. Puis, anesthésier six à huit semaines CD une souris femelle avec kétamine et xylazine en utilisant la voie intra péritonéale. Évaluer si la souris affiche une réaction musculaire et une réponse à différents stimuli physiques.Effectuez la ponction cardiaque. Puis recueillir le sang de la souris dans un micro tube et maintenir le sang à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Ensuite, recueillir environ 30 moustiques femelles de la cage de stock à l’aide d’un aspirateur.Transférer les moustiques femelles dans des gobelets en papier de 500 millilitres et couvrir d’une fine maille de moustiquaire afin qu’ils ne puissent pas s’échapper. Étirez la membrane du parafilm à travers la bouche de la mangeoire en verre pour contenir le repas. Appliquez un appareil d’alimentation artificiel à cloche de verre relié aux tubes en plastique sur le dessus de chaque tasse.Fournir un débit d’eau constant vers le tube cylindrique et la mangeoire de sorte que la température à l’intérieur est maintenue à environ 37,5 degrés Celsius. Appliquez un millilitre de régime liquide préchauré à 37 degrés Celsius ou du sang de souris frais dans une mangeoire en verre. Nourrissez les moustiques pendant 60 minutes dans l’obscurité à 26 degrés Celsius.Après l’alimentation artificielle, le froid anesthésie les moustiques à 20 degrés Celsius pendant 30 secondes. Ensuite, placez les moustiques dans une boîte de Pétri réfrigérée. Enregistrez le nombre de moustiques femelles entièrement engorgés.Séparez 30 femelles entièrement engorgées et mettez-les sur une nouvelle cage. Maintenant, placez un papier filtre humidifié au fond de chaque cage. Gardez les moustiques à 26 degrés Celsius, 75% d’humidité, et sous un cycle sombre clair de 12 heures à 12 heures avec 10% de glucose ad libitum.À 96 heures et 120 heures après l’alimentation, comptez les œufs à l’aide d’une loupe portatif. Inonder le papier filtre d’eau distillée pour recueillir les œufs dans des plateaux remplis d’eau distillée. Nourrir les larves quotidiennement avec environ 13 milligrammes de nourriture pour poissons moulus par plateau.Retirer les pupes mortes et les larves avec une pipette en plastique tous les jours. Lorsque tous les pupes sont nés en adultes, comptez le nombre de mâles et de femelles adultes, enregistrez les dates d’éclosion et de décès et calculez les taux de mortalité. Pour vérifier la longévité, rassemblez 15 mâles adultes et 15 femelles adultes de la génération F1 de chaque groupe diététrique dans une tasse en papier.Nourrir les adultes avec 10% de glucose solution ad libitum. Utilisez une pince à épiler ou une brosse pour enlever les adultes morts tous les jours. Maintenez les moustiques à la même température, humidité, conditions de cycle léger et régime d’alimentation en sucre.Enregistrez les dates de décès et calculez la longévité. Pour mesurer la longueur des ailes, le froid anesthésie les moustiques adultes mâles et femelles de F1 de cinq jours de chaque groupe alimentaire à 20 degrés Celsius pendant 90 secondes. Sous un stéréoscope, saisir délicatement le thorax de chaque moustique avec des forceps, et les placer côté ventral vers le haut.Recueillir les deux ailes à l’aide d’un scalpel, et les placer sur une lame de microscope propre contenant une goutte séchée de milieu de montage pour une mesure plus supplémentaire à l’aide d’un oculaire gradué. Mesurez la longueur de l’aile à l’aide d’un stéréoscope à l’aide d’un micromètre. Dans cette étude, la performance des moustiques anophèles femelles nourris sur le repas artificiel riche formulé et les moustiques nourris sur le régime liquide initial, ou un repas de sang frais a été comparé.Le nombre de moustiques femelles engorgés nourris avec un riche repas artificiel à 89% était significativement plus élevé que le nombre de femelles engorgées nourries au sang à 56%La génération F1 de moustiques nourris sur le sang ou le repas artificiel riche avait des taux de mortalité et de survie comparables. La variabilité était plus élevée chez les moustiques nourris au sang que chez les moustiques nourris avec le riche repas artificiel. En ce qui concerne la taille du corps adulte, les moustiques anophèles F1 nourris avec un repas artificiel riche se trouvait dans la fourchette prévue, et était similaire aux moustiques insectifuges nourris au sang.À mon avis, il est très important d’assembler les mangeoires correctement avec le parafilm pour éviter sa rupture. Si la membrane n’est pas bien fixée à la mangeoire en verre, vous pouvez perdre le repas et probablement perdre certains des moustiques car ils peuvent être couverts par le repas et mourir. Nous aimerions effectuer un essai d’attraction à double choix, par exemple à l’aide d’un olfactomètre afin que nous puissions réellement évaluer si nos femelles sont plus attirées par le régime artificiel ou par le sang.En outre, nous sommes maintenant lyophiliser le régime artificiel et d’étudier sa stabilité entre les différentes températures depuis longtemps. Outre les améliorations évidentes à la stabilité et le stockage que nous avons travaillé sur, l’utilisation à long terme de l’alimentation sur la condition physique des moustiques et la physiologie devrait être étudiée. Je crois que la production d’anophèles sans sang facilitera la recherche extrêmement vectorielle et la mise en œuvre d’outils de lutte qui dépendent d’un grand nombre de moustiques.

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Cette vidéo illustre les techniques générales utilisées pour l'arrière Anopheles gambiae dans le laboratoire. Les méthodes pour prendre soin de moustiques de laboratoire sont démontrées par tous les stades du cycle de vie de l'organisme à partir de larves en pupes au sang maternel adultes.

Protocole pour l&#39;élevage des moustiques (A. gambiae)

Pour parvenir à la suppression de la population d’Aedes aegypti à l’aide du système RIDL® (Libération d’insectes porteurs d’une létalité dominante), un grand nombre de moustiques mâles doivent être relâchés. Cela nécessite l’utilisation de techniques et de technologies d’élevage en masse pour fournir des systèmes fiables permettant d’obtenir le maximum de moustiques mâles de haute qualité.

Production en masse d’Aedes aegypti génétiquement modifié pour les disséminations sur le terrain au Brésil

Source : Liu, X., et al. Un test oral bactérien avec des moustiques traités aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’appauvrissement du microbiote intestin naturel chez les moustiques à l’aide d’une solution contenant des antibiotiques en saccharose. Cela est suivi d’une recolonisation contrôlée avec une suspension bactérienne délivrée via un système d’alimentation membranaire afin d’établir une population bactérienne définie dans l’intestin du moustique.

Établissement d’une population bactérienne intestinale définie chez les moustiques adultes

Cette vidéo montre un test d’alimentation sanguine permettant d’évaluer la mortalité et la fécondité de composés d’essai ayant de nouveaux modes d’action sur des moustiques femelles. Cette technique permet de sélectionner de nouvelles classes d’insecticides pour tuer la population résistante de moustiques et contrôler la propagation des maladies.

Essai d’alimentation des moustiques : méthode d’évaluation des effets des composés d’essai sur la mortalité et la fécondité des moustiques femelles adultes

Les analyses RNA-Seq deviennent de plus en plus importantes pour identifier les fondements moléculaires des traits adaptatifs dans les organismes non modèles. Ici, un protocole permettant d’identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les moustiques Aedes albopictus diapause et non diapause est décrit, de l’élevage des moustiques au séquençage de l’ARN et aux analyses bioinformatiques des données RNA-Seq.

Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d'ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un protocole est développé pour examiner les effets d’un médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques.  Nous décrivons ici les procédures d’exposition aqueuse de DZNep aux moustiques immatures et d’exposition sanguine de DZNep aux moustiques adultes, en plus de mesurer l’inhibition de l’hydrolase de l’HSA.

Les analyses toxicologiques pour Effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia sont libérés dans les populations naturelles de supprimer la transmission des arbovirus. Nous décrivons des méthodes arrière Ae. aegypti Wolbachia infections en laboratoire pour des expériences et sortie de terrain, prendre des précautions pour réduire au minimum la sélection et l’adaptation de laboratoire.

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia

Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

L’objectif de ce protocole est de livrer des repas de sang artificiels et d’origine animale aux moustiques Aedes aegypti par l’intermédiaire d’une mangeoire à membrane artificielle et de quantifier avec précision le volume de repas ingérés.

Alimentation et quantification du sang d’origine animale et des repas artificiels chez les moustiques Aedes aegypti

L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

Découvrez un régime artificiel sans sang pour élever les moustiques Anopheles, évitant les contraintes éthiques du sang animal. Cette méthode facilite la recherche sur le paludisme et améliore l'élevage d'insectes.

Un régime sans sang pour les moustiques anophèles arrière

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