Name: Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Découvrez l'induction de la différenciation des lignées épithéliales mammaires murines HC11 et EpH4 en culture tridimensionnelle. Cette méthode permet d'étudier la transformation néoplasique et d'identifier des cibles thérapeutiques pour le cancer du sein.

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La lignée cellulaire HC11 a été gentiment fournie par le Dr D. Medina (Houston, TX). Les auteurs sont reconnaissants au Dr Andrew Craig de l’Université Queen’s pour de nombreux réactifs et suggestions précieuses. Les cellules EpH4 étaient un cadeau du Dr C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick a fourni une excellente assistance technique pour les études de culture 3D.
L’aide financière du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG), des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), de la Fondation canadienne du cancer du sein (CBCF, section de l’Ontario), de l’Alliance canadienne de recherche sur le cancer du sein , les Centres d’excellence de l’Ontario, le Breast Cancer Action Kingston (BCAK) et le fonds de legs Clare Nelson par le biais de subventions à LR sont reconnaissants. BE a reçu un soutien de subvention des IRSC, de la FCCS, de la BCAK et de la Société de recherche sur le cancer inc. PTG est appuyé par une chaire de recherche du Canada, la Fondation canadienne pour l’innovation, les IRSC, le CRSR et la Société canadienne du cancer. MN a reçu l’appui d’un programme de formation Terry Fox en recherche transdisciplinaire sur le cancer de l’INCC, d’un prix d’études supérieures (QGA) et d’un prix du doyen de l’Université Queen’s. MG a reçu des bourses postdoctorales du Programme du cancer du sein de l’armée américaine, du ministère de la Recherche et de l’Innovation de la province de l’Ontario et du Comité consultatif de recherche de l’Université Queen’s. VH a reçu l’appui d’une bourse de doctorat de la FCCS et d’une bourse postdoctorale du Programme de formation de la Fondation Terry Fox en recherche transdisciplinaire sur le cancer, en partenariat avec les IRSC. Hanad Adan a reçu un stage d’été du CRSN. BS a reçu un prix d’études supérieures de l’Université Queen’s.

1. Placage des cellules HC11
<ol><li>Dans une hotte à débit laminaire utilisant des techniques stériles préparer une bouteille avec 50 ml de milieu cellulaire HC11: RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 5 g/mL d’insuline, et 10 ng/mL EGF (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Assiette d’environ 400 000 cellules par plat Petri de 3 cm : Passez deux plats Petri de 10 cm et 50 % en confluents dans vingt plats de 3 cm en milieu HC11. Les cellules doivent être bien étalées, mais le séchage doit être évité.<ol>
<li>Aspirer le milieu dans un flacon à l’aide d’une pompe à vide.</li>
		<li>Ajouter 250 l de trypsine (voir Tableau des matériaux)par plaque de 10 cm. Tourbillonner et frapper la plaque des côtés tout en la gardant horizontale pour répandre la trypsine et pour déloger les cellules attachées</li>
		<li>Observez sous la microscopie de contraste de phase avec un objectif 4x pour s’assurer que les cellules ont commencé à se détacher des bords avant la pipetting.</li>
		<li>Aspirez environ 1,5 ml de milieu HC11 dans une pipette Pasteur stérile de 9 pouces et giclez-la verticalement contre les cellules. Faites pivoter le plat Petri tout en giclant pour déloger toutes les cellules. Vous devez travailler rapidement pour éviter le séchage des cellules.</li>
		<li>Transférer toutes les cellules à la bouteille avec le milieu HC11 et tourbillonner.</li>
		<li>Pipette 2 ml de suspension cellulaire dans chaque plat Petri de 3 cm. Rock les plats Petri en travers pour répartir uniformément. Placer les cellules dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le lendemain, ou lorsque les cellules sont de 90 à 100% de confluents, aspirez le milieu, et remplacez-le par un moyen par du SF et de l’insuline, mais sans EGF.</li>
</ol>2. Induction de différenciation, surveillance et quantitation des cellules HC11
<ol><li>Après avoir fait pousser les cellules dans le milieu manquant d’EGF pendant 24 h, ajouter le milieu de différenciation (milieu de hip) à dix plaques de 3 cm : RPMI-1640 complété de 10 % de FBS, 1 g/mL Hydrocortisone (voir Tableau des matériaux), 5 g/mL Insulin et 5 og/mL Prolactin (voir Tableau des matériaux)pendant 10 jours.</li>
	<li>Gardez les dix autres plaques de 3 cm comme commandes : Changer à un milieu avec 10 % de FBS et 5 g/mL d’insuline dépourvud’EGF et de HIP.</li>
	<li>Changez le milieu tous les deux jours et tous les deux jours pour les cellules et les contrôles traités par HIP. Pipette le milieu soigneusement pour s’assurer que les cellules ne se détachent pas.</li>
	<li>Pour surveiller la différenciation (c.-à-d. la formation de « dômes »), observez les cellules sous microscopie de contraste de phase(figure 1A, panneau gauche). Si les cellules expriment la protéine de fluorescence verte (GFP), observez sous la microscopie de fluorescence (excitation 485/20 ; émission 530/25 ; grossissement 240x ; objectif 20x) (figure 1A, panneau droit).</li>
	<li>Pour quantifier le degré de différenciation, extraire les protéines d’un plat Petri chacune des cellules et des contrôles traités par HIP, une fois par jour pendant un total de 10 jours et sonder les taches occidentales pour la caséine (voir tableau des matériaux) (Figure 1B).<ol>
<li>Gratter les cellules sur la glace avec 1,5 ml de saline tamponnée de phosphate à froid (PBS) dans un tube de centrifugeuse en plastique de 1,8 ml.</li>
		<li>Pelleter les cellules à 350 x g,1 min, 4 oC.</li>
		<li>Laver rapidement les granulés 2x avec du PBS glacé. Égoutter les résidus.</li>
		<li>Faire un tampon de lyse : 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM phénylmethylsulphonyl fluorure (PMSF), 10 'g/mL aprotinin, 10 'g/mL leupeptin16. Ajouter 100 l par plat Petri de 3 cm.</li>
		<li>Clarifier le lysate par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min dans le froid.</li>
		<li>Déterminer la concentration en protéines (voir tableau des matériaux)et charger de 10 à 20 g de protéines de chaque échantillon sur un gel polyacrylamide-SDS de 10 %.</li>
		<li>Électrophorese pour 15 h à 45 V, ou à 100 V pour 2 à 2,5 h.</li>
		<li>Transférer sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF à l’aide d’un appareil de transfert électroblotting (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Bloc avec 5% d’albumine de sérum bovin (BSA) en saline tamponnée tris avec 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Ajouter l’anticorps primaire, la chèvre anti-caséine diluée 1:2,000 ou la souris anti-actine diluée 1:1,000 (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Laver 3x avec tBST, 5 min à chaque fois.</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps secondaire, le raifort peroxidase (HRP) lié à l’anti-chèvre d’âne dilué 1:2,500, ou HRP a lié l’anticorps anti-souris de cheval dilué 1:10.000.</li>
		<li>Laver 3x avec tBST, 5 min à chaque fois.</li>
		<li>Ajouter des réactifs ECL à la membrane selon les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Placage et croissance 3D des cellules EpH4 dans la matrice EHS
REMARQUE : La matrice est liquide à des températures de 10 oC et solide à des températures supérieures. Conserver à -80 oC. Décongeler à 4 oC la veille de l’utilisation. Pré-réfrigérer les plaques de culture tissulaire et les pointes de pipette à -20 oC avant la manipulation et garder la matrice, les plaques et les pointes de pipette sur la glace pour l’empêcher de se solidifier.
<ol><li>Cultivez des cellules EpH4 en 2D dans le milieu RPMI-1640 avec 10% de FBS et 5 'g/mL d’insuline (EGF n’est pas nécessaire).</li>
	<li>Préparer le milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 10 % (v/v, 3 500 l) ou de 20 % (v/v 2 000 l) dans deux tubes coniques de 50 ml. Conserver sur la glace jusqu’au moment de l’utilisation.</li>
	<li>Enrober 10 puits (1 cm2 chacun) d’une plaque de 24 puits avec 150 l de matrice non diluée. Étendre la matrice à l’aide d’une pointe de pipette. Évitez de créer des bulles. Appuyez doucement sur les côtés de la plaque tout en la tenant horizontalement pour s’assurer que la matrice est répartie uniformément sur le fond du puits.</li>
	<li>Incuber la plaque de 24 puits à 37 oC pendant 1 h pour permettre à la matrice de se solidifier.</li>
	<li>Trypsiniser les cellules EpH4 comme décrit ci-dessus pour les cellules HC11 et les compter avec un hémocytomètre. Transférer 5 x 104 cellules par puits dans un tube de centrifugeure conique stérile de 1,5 ml et tourner à 250 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le milieu et placez le tube sur la glace.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 350 oL de milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 20% à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml tout en gardant le tube conique sur la glace. Évitez les bulles. Il est important d’assurer une suspension à cellule unique.</li>
	<li>Une fois que la matrice de couche inférieure s’est solidifiée (la matrice doit sembler translucide et plus claire par rapport au revêtement initial des puits), ajoutez les 350 l de suspension cellulaire à chaque puits enduit et placez-la dans un incubateur de CO2 à 37 oC pour 1 h pour permettre à la couche de matrice de 20 % de se solidifier.<ol>
<li>Observez les cellules microscopiquement sous contraste de phase avec un objectif 4x. Les cellules individuelles doivent être visibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 200 l de milieu EpH4 contenant 10% de matrice au-dessus des 350 l de cellules suspendues dans une matrice de 20%. Incuber à 37 oC.</li>
</ol>4. Induction différenciation des cellules EpH4 cultivées en 3D (Figure 2)
REMARQUE : Outre la différenciation, les cellules EpH4 peuvent également subir la tubulogénèse lorsqu’elles sont stimulées par hGF (facteur de croissance des hépatocytes) dans la culture 3D. On peut voir des excroissances tubulaires après 10 jours de stimulation du HIP et du HGF.
<ol><li>Commencer l’induction de différenciation des cellules EpH4 1 jour après le placage dans la matrice. Retirez soigneusement 150 l de milieu supérieur contenant 10 % de matrice des puits à l’aide d’une pointe de pipette en plastique. Ajouter 200 oL de milieu EpH4 contenant du HIP et une matrice de 10 %.</li>
	<li>Remplacez le milieu de 10 % de matrice-HIP tous les 2 jours pendant une durée pouvant aller jusqu’à 10 jours. Cultivez des cellules témoins dans le même milieu matricieux de 10 % sans HIP.</li>
	<li>Surveiller la formation de la mammosphère sous contraste de phase (Figure 3A, panneau inférieur).</li>
</ol>5. Induction tubulogénèse des cellules EpH4 cultivées en 3D (Figure 3A et 3C)
<ol><li>Préparer 24 plaques de puits et cellules EpH4 pour la croissance de la matrice comme détaillé dans les étapes 3.1-3.9. Le lendemain du placage des cellules dans la matrice, retirez 150 l de milieu EpH4 contenant 10 % de matrice des puits à l’aide d’une pointe de pipette en plastique. Ajouter 200 oL de milieu EpH4 contenant 10 % de matrice, HIP et 20 ng/mL HGF (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Remplacez le milieu de matrice/HIP/HGF de 10 % tous les 2 jours pendant une journée allant jusqu’à 12 à 14 jours.</li>
	<li>Surveiller la formation de tubule au microscope à l’aide d’un objectif 20x ou 40x(figure 3A, panneau droit).</li>
</ol>6. Quantitation de la différenciation : Blotting occidental pour la caséine
<ol><li>Pipette soigneusement hors du milieu de matrice-HIP de 10% des puits. Rincer la couche de matrice de 20 % 2x avec 350 L de PBS glacé. Les sphéroïdes doivent toujours être présents dans la couche matricielle.</li>
	<li>Ajouter 700 à 1 000 l de PBS glacé avec 1 mM d’acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) directement dans les puits. Détachez délicatement la couche inférieure de la matrice de 100 % du puits avec une pointe de pipette pour récupérer les sphéroïdes présents dans cette couche. Agiter doucement pendant 30 min à 4 oC.</li>
	<li>Transférer soigneusement la suspension sphéroïde dans un tube conique. Rincer les puits avec 500 l de PBS-EDTA pour récupérer les sphéroïdes restants dans les puits et ajouter au tube conique.</li>
	<li>Roche sur la glace pendant 30 min supplémentaires. Assurez-vous que la matrice est complètement dissoute. Si des amas de matrice visibles sont observés, ajoutez plus de PBS-EDTA ou secouez plus longtemps.</li>
	<li>Centrifuger la solution pour granuler les sphéroïdes à 350 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez le supernatant, lyser les sphéroïdes dans le tampon de lyse glacée, et sonder pour la caséine, la cycline D1, et p120RasGAP par le ballonnement occidental comme à l’étape 2.5 au-dessusde 16. Comme anticorps primaires, utilisez la chèvre anti-caséine diluée 1:2,000, lapin anti-cyclin D1 dilué 1:2,000, et souris anti-p120 dilué 1:2,000. Pour les anticorps secondaires, utilisez HRP lié âne anti-chèvre dilué 1:2,500, HRP lié âne anti-lapin dilué 1:2,500, et HRP lié cheval anti-souris dilué 1:10,000.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Les cellules HC11 sont idéalement adaptées à l’étude de la différenciation en conjonction avec la transformation néoplastique. Un avantage supplémentaire est que les cellules HC11 sont facilement infectables avec des vecteurs rétroviraux à base de Mo-MLV pour exprimer une variété de gènes. Dans nos mains, les cellules EpH4 étaient plus difficiles à infecter avec les mêmes vecteurs rétroviraux que le HC112.
Le contact de cellule à cellule et l’arrêt de croissance sont de...

Dans les tissus normaux ou les tumeurs, les cellules ont de vastes possibilités d’adhérence à leurs voisins dans une organisation tridimensionnelle, et cela est imité dans la culture par la croissance cellulaire de haute densité. L’adhérence de cellule à cellule est négociée principalement par des récepteurs de cadhérine, qui définissent l’architecture cellulaire et tissulaire. Fait intéressant, il a été récemment démontré que les cadhérines jouent également un rôle puissant dans la transduction du signal, en particulier dans la signalisation de survie1. Paradoxalement, certains de ces signaux d’adhérence cellulaire à cellule émanant de cadhérines se sont récemment avérés partagés à la fois par la différenciation et la néoplasie2. Ici, nous décrivons des méthodes d’induction et d’évaluation de la différenciation dans deux types représentatifs de lignées épithéliales de sein de souris, HC11 et EpH4.
La lignée épithéliale du sein de souris HC11 peut fournir un modèle utile pour l’étude de la différenciation épithéliale des cellules. Les cellules HC11 sont une lignée cellulaire dérivée de COMMA-1D, provenant de la glande mammaire d’une souris Balb/c mi-enceinte3. Contrairement à d’autres clones dérivés de COMMA-1D, le clone HC11 n’a pas besoin d’ajouter exogènement la matrice extracellulaire ou la cocultivation avec d’autres types de cellules pour l’induction in vitro du gène endogène de la casémine par les hormones lactogéniques3. Cette lignée cellulaire a été largement utilisée dans les études de différenciation parce qu’elle a conservé des caractéristiques importantes de l’épithélium mammaire normal : les cellules HC11 peuvent reconstituer partiellement l’épithélium canalaire dans un coussinet de graisse mammaire dédouané4. En outre, ils peuvent se différencier dans une culture bidimensionnelle (2D) lorsqu’ils sont cultivés à la confluence attachée à une surface de plat Petri en plastique en présence d’un stéroïde comme Hydrocortisone ou Dexamethasone, en plus de insulin et Prolactin (HIP moyen) dépourvu de facteur de croissance épidermique (EGF), un inhibiteur de la différenciation5,6,7. Dans ces conditions, les cellules HC11 produisent des protéines de lait telles que la caséine et le WAP, qui sont détectables par le ballonnement occidental dans les 4 jours suivant l’induction. Dans le même temps, une partie des cellules HC11 forme des structures rudimentaires ressemblant à des glandes mammaires appelées « dômes » d’une manière stochastique. Les dômes sont visibles 4 à 5 jours après l’induction et augmentent graduellement en taille jusqu’au jour 10, concomitant avec une augmentation de la production de caséine8. Fait intéressant, les cellules HC11 possèdent mutant p539, et représentent donc un état prénéoplastique. Pour cette raison, le modèle HC11 est idéal pour étudier les réseaux de signalisation de différenciation en conjonction avec la néoplasie dans le même système cellulaire.
Les cellules EpH4, un dérivé des cellules IM-2, sont une lignée cellulaire nontumorigenic dérivée à l’origine de cellules épithéliales de glande mammaire de souris spontanément immortalisées isolées d’une souris Mi-enceinte de Balb/c10. Les cellules EpH4 forment des monocouches épithéliales continues dans la culture 2D, mais ne se différencient pas en structures glandulaires10,11. Cependant, après la croissance 3D dans un matériau composé d’un mélange de protéines de matrice extracellulaire produites par les cellules de sarcome de souris EHS12 (matrice EHS, matrice, ou Matrigel, voir Tableau des matériaux), en plus de la stimulation avec HIP, les cellules EpH4 peuvent récapituler les étapes initiales de la différenciation des glandes mammaires. Dans ces conditions, les cellules EpH4 forment des sphéroïdes (également appelés mammosphères) qui présentent une polarité apical-basale et un lumen creux, et sont capables de produire les protéines du lait- caséine et WAP, semblables aux cellules épithéliales mammaires. Contrairement aux cellules HC11, qui sont indifférenciées, et certains marqueurs mésenchymal express13, epH4 cellules présentent une morphologie purement lumineuse14. Les cellules EpH4 ont également été rapportées pour produire des protéines de lait dans la culture 2D par la stimulation avec la dexaméthasone, l’insuline, et la prolactine15. Cependant, cette approche empêche l’étude des effets réglementaires qui imitent le microenvironnement de glande mammaire dans la culture 3D.

<table><tbody><tr><td>30 % Acrylamide/0,8 % Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin D1</td><td>anticorps lapin, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Souris anticorps anti-p120</td><td>, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-&beta ; souris anticorps anti-actine Anti-&beta ; actine</td><td>, Cell Signalling technology</td><td>3700</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-&bêta ; anticorps contre la caséine</td><td>chèvre, Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Acide bicinchoninique Solution</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC Détermination des</td><td>protéines</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Détermination des protéines</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II)</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Détermination des protéines</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Coloration</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Coloration</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Milieu pour cellules HC11 Sérum</td></tr><tr><td>de veau fœtal</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Moyenne Chèvre - Anti Lapin-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Facteur de croissance hépatocytaire recombinant</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Cheval Anti-souris HRP</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>7076</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Insuline moyenne</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP</td></tr><tr><td>Medium Laminar-flow hood</td><td>BioGard Hood Cell</td><td></td><td>Culture</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Matrice tampon de lyse</td></tr><tr><td>(matrice Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Chèvre HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Réactif</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Coloration</td></tr><tr><td>Microscope confocal multiphotonique</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Nikon appareil photo numérique</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>Coloration</td></tr> Phase <tr><td>Contrast Microscope</td><td>Olympus IX70</td><td></td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Phénylméthylsuphonyl fluorure</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolactine</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Cell Milieu de culture</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire-24 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td> Appareil de transfert de <td>culture cellulaire</td></tr><tr><td></td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot Système d’électrophorèse sur gel véritique</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blot</td></tr></tbody></table>

différenciation des cellules epithéliales de l’épithélial de souris hc11 et eph4

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Les cadhérines jouent un rôle important dans la régulation de la différenciation cellulaire ainsi que de la néoplasie. Nous décrivons ici les origines et les méthodes de l’induction de la différenciation de deux lignées épithéliales de sein de souris, HC11 et EpH4, et leur utilisation pour étudier des étapes complémentaires du développement de glande mammaire et de la transformation néoplastique.
La lignée épithéliale de cellules épithéliales de sein de souris de HC11 a provenu de la glande mammaire d’une souris enceinte de Balb/c. Il se différencie lorsqu’il est cultivé à la confluence attachée à une surface de plat Petri en plastique dans le milieu contenant le sérum foetal de veau et Hydrocortisone, insulin et Prolactin (hip medium). Dans ces conditions, les cellules HC11 produisent les protéines du lait et la protéine acide de lactosérum (WAP), semblables aux cellules épithéliales mammaires en lacactation, et forment des structures mammaires rudimentaires appelées « dômes ».
La lignée cellulaire EpH4 a été dérivée de cellules épithéliales de glande mammaire de souris spontanément immortalisées isolées d’une souris Enceinte de Balb/c. Contrairement à HC11, les cellules EpH4 peuvent se différencier entièrement en sphéroïdes (également appelés mammosphères) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de croissance tridimensionnelles (3D) dans le milieu HIP. Les cellules sont trypsinisées, suspendues dans une matrice de 20% composée d’un mélange de protéines de matrice extracellulaire produites par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), plaquées sur une couche de matrice concentrée recouvrant un plat Petri en plastique ou une plaque multiwell, et recouvertes d’une couche de 10% de milieu hip contenant une matrice de 10%. Dans ces conditions, les cellules EpH4 forment des sphéroïdes creux qui présentent une polarité apical-basale, un lumen creux, et produisent de la caséine et du WAP.
En utilisant ces techniques, nos résultats ont démontré que l’intensité du signal cadhérine/Rac est essentielle à la différenciation des cellules HC11. Alors que Rac1 est nécessaire pour la différenciation et de faibles niveaux de racV12 activé augmenter la différenciation, les niveaux élevés RacV12 bloquer la différenciation tout en induisant la néoplasie. En revanche, les cellules EpH4 représentent un stade précoce de la différenciation épithéliale mammaire, qui est inhibée par même de faibles niveaux de RacV12.

On sait depuis longtemps que la différenciation des cellules épithéliales et des adipocytes nécessite la confluence et l’engagement des cadhérines2. Nous et d’autres avons démontré que l’adhérence de cellule à cellule et l’engagement de E- ou N-cadherin et cadherin-11, comme cela se produit avec la confluence des cellules cultivées, déclenche une augmentation spectaculaire de l’activité de la petite protéine GTPases Rac et de contrôle de la division cellulaire 42 (Cdc42), et ce processus conduit à...

Nous décrivons des techniques pour l’induction de différenciation de deux lignes épithéliales de sein, HC11 et EpH4. Tandis que les deux exigent le sérum foetal de veau, l’insuline, et la prolactine pour produire des protéines de lait, les cellules d’EpH4 peuvent entièrement différencier dans les mammospheres dans la culture tridimensionnelle. Ces modèles complémentaires sont utiles pour les études de transduction de signal de différenciation et de néoplasie.

Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Les cellules HC11 et EpH4 sont des lignées cellulaires épithéliales du sein de souris qui peuvent se différencier en culture. Dans le même temps, ces cellules peuvent être transformées par un certain nombre d’oncogènes. Ces cellules sont idéales pour l’étude de l’interrelation entre la différenciation et la transformation néoplastique.Ces techniques peuvent être utilisées dans des études de transduction de signaux pour découvrir des cibles pour la thérapie contre le cancer. Par exemple, la petite GTPase Rac et d’autres molécules peuvent déclencher la transformation des cellules épithéliales du sein lorsqu’elles sont exprimées à des niveaux élevés, mais étonnamment à de faibles niveaux, elles peuvent induire une différenciation. D’autres transducteurs de signaux peuvent se comporter de la même manière.Les principes peuvent également s’appliquer à d’autres types de différenciation lorsque la confluence cellulaire joue un rôle important, par exemple la différenciation des adipocytes ou des myotubes. Quelqu’un exécutant cette technique pour la première fois devrait garder à l’esprit que le placage des cellules HC11 est important. C’est parce que le contact cellule-cellule est important pour la différenciation.Un autre point à surveiller est que l’extraction correcte des cellules EpH4 de la matrice est essentielle pour la quantitation des protéines, car tous les résidus affecteront la détermination des protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est utile parce que certains détails du protocole sont difficiles à décrire sur papier. Commencez par préparer une bouteille de 50 millilitres de milieu cellulaire HC11 selon les directives manuscrites.Pour plaquer les cellules, aspirer le milieu de cinq plats Petri de six centimètres 50% confluents et laver les cellules avec environ 1,8 millilitres de trypsine à l’aide d’une pipette pasteur stérile de neuf pouces en coton branché. Ajouter ensuite 200 microlitres de trypsine par plaque et faire tourbillonner la plaque pour déloger les cellules attachées. Observez les cellules sous microscopie de contraste de phase avec un objectif 4X pour s’assurer qu’elles ont commencé à déloger.Ensuite, aspirez environ 1,5 millilitres de HC11 moyen avec une pipette pasteur stérile de neuf pouces et gicler verticalement contre les cellules tout en tournant le plat en s’assurant d’éviter les éclaboussures. Transférer toutes les cellules dans la bouteille avec HC11 moyen et tourbillonner pour se disperser uniformément dans la bouteille. Puis aliquot la suspension cellulaire en 20 boîtes de Pétri de trois centimètres par pipetting deux millilitres de cellules par plat.Rock les boîtes de Petri pour répandre les cellules et les incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, lorsque les cellules sont 90 à 100% confluent, aspirer le milieu et le remplacer par moyen par FBS, mais sans FEM. Après avoir fait pousser les cellules à moyen sans FEM pendant 24 heures, ajouter le milieu de différenciation à 10 plats et faire pousser les cellules jusqu’à 10 jours en gardant les 10 autres plats comme témoins.Changez le milieu tous les deux à trois jours avec les cellules traitées hip et de contrôle. Pour surveiller la différenciation, observez les cellules avec la microscopie de contraste de phase. Utilisez la microscopie par fluorescence si les cellules expriment des protéines fluorescentes vertes.En outre, quantifier le degré de différenciation en extrayant des protéines des cellules traitées et de contrôle hip une fois par jour et en effectuant l’analyse western blot. Rassemblez et placez le milieu de croissance EpH4, la matrice EHS et deux tubes coniques de 50 millilitres sur la glace. Préchill les plaques de culture tissulaire avec des pointes pipette à moins 20 degrés Celsius et de préparer eph4 milieu de croissance complété par 10 ou 20% matrice en deux tubes coniques de 50 millilitres et les garder sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à utiliser.Après avoir récupéré les plaques de culture tissulaire préchilées à moins 20 degrés Celsius, enduire 10 puits de la plaque de 24 puits de 150 microlitres de matrice non diluée en étalant la matrice à l’aide d’une pipette. Évitez de créer des bulles lors de la propagation de la matrice. Puis appuyez doucement sur les côtés de la plaque et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la matrice de se solidifier.Pendant ce temps, préparez-vous à la différenciation en trypsinisant les cellules EpH4 ainsi que précédemment décrit et en assurant des suspensions cellulaires simples après la résuspension des cellules trypsinisées. Ensuite, comptez les cellules en suspension à l’amiomètre. Transférer cinq fois 10 dans les quatre cellules par puits dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 1,5 millilitre et les faire tourner à 250 fois g pendant cinq minutes.Aspirez soigneusement le milieu supernatant et placez le tube sur la glace. Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour résuspendre les cellules dans 350 microlitres de milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 20%, tout en gardant les tubes sur la glace en s’assurant d’éviter les bulles. Une fois que la couche inférieure s’est solidifiée, ajoutez les 350 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits enduit et placez-le dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la couche matricielle de 20 % de se solidifier.Observez les cellules avec la microscopie de contraste de phase pour s’assurer que les cellules simples sont visibles. Ajouter ensuite 200 microlitres de milieu EpH4 avec 10% de matrice sur le dessus et incuber la plaque à 37 degrés Celsius. Commencez l’induction de différenciation un jour après le placage des cellules dans la matrice.Retirez soigneusement 150 microlitres du milieu matriciel supérieur de 10 % et ajoutez 200 microlitres de milieu EpH4 contenant hip et 10% matrice et pour les contrôles ajouter un milieu matricielle de 10% sans HIP. Remplacer le milieu tous les deux jours jusqu’à 10 jours en surveillant la formation de mammosphère par une microscopie à contraste de phase. Pour quantifier la différenciation, pipette soigneusement le milieu HIP 10% matrice des puits et rincer la couche matricielle de 20% avec 350 microlitres de PBS glacé.Ajouter ensuite 70 à 100 microlitres de PBS glacé avec un millimolaire EDTA directement dans les puits et détacher doucement la couche inférieure de la matrice à 100 % avec une pointe de pipette. Agiter doucement l’assiette à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférer délicatement la suspension sphéroïde dans un tube conique et rincer les puits avec 500 microlitres de PBS EDTA pour récupérer les sphéroïdes restants.Rock le tube sur la glace pendant 30 minutes supplémentaires en s’assurant que la matrice se dissout complètement. Si des touffes matricielles visibles sont vues, ajoutez plus de PBS EDTA ou secouez plus longtemps. Centrifugeuse de la solution à 350 fois g pour pelleter les sphéroïdes.Puis aspirer le supernatant, lyse les sphéroïdes, et sonder les cellules pour la bêta-caséine, cycline D1, et p120RasGAP par ballonnement occidental. Il existe une dépendance frappante de différenciation sur la force du signal Rac dans les cellules HC11. Alors que le CRAC1 endogène est nécessaire pour la différenciation et de faibles niveaux de RacV12 activé par mutation provoquent une augmentation de la capacité de différenciation, des niveaux élevés de RacV12 déclenchent un bloc de différenciation et induisent la néoplasie.Quand les propriétés de différenciation des cellules d’EpH4 ont été explorées dans une culture de matrice 3D, il a été constaté que la production de bêta-caséine a culminé à huit à 10 jours et l’expression de cyclin D1 était maximale à quatre à six jours après stimulation de HIP. Pour déterminer le positionnement des cellules individuelles, elles ont été tachées de DAPI et photographiées avec une microscopie confoccale. La mort interne de cellules et la formation des lumens creux ont été observées dans les mammosphères tandis que l’addition de HGF a eu comme conséquence la formation des structures tubulaires.Quelqu’un effectuant cette technique pour la première fois doit garder à l’esprit que le placage des cellules HC11 est important. Une extraction correcte des cellules EpH4 de la matrice est également essentielle à la quantitation des protéines, car tout résidu affectera la détermination des protéines. Cette technique peut être utilisée pour étudier d’autres transducteurs de signaux qui peuvent se comporter de la même manière.S’il y a des mutations de conducteur dans un cancer, alors leur inhibition complète ne sera pas nécessaire puisque de bas niveaux restants induisent réellement la différenciation.

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