Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

La micro-aspiration à cellule unique est une méthode qui complète les différentes techniques utilisées dans le domaine de la microbiologie en général et de la virologie en particulier. Il pourrait répondre à la question clé et résoudre les problèmes rencontrés lors de l’isolement des virus géants en séparant un virus d’un mélange viral présentant un virus de faible abondance comme c’était le cas pour les virus de chiffre d’affaires, le virus clandisinal, et le virus uzibati d’un autre, qui est Faustovirus, présent en abondance élevée de toute façon. Le principal avantage de cette approche est l’utilisation d’une stratégie indirecte.

Il consiste à séparer et clonage l’hôte infecté pour obtenir une séparation virale. Ainsi, cette méthode surveille les différentes étapes de la capture à la libération des cellules et confirme le processus de tri par observation microscopique. Enfin, la biologie moléculaire est utilisée pour confirmer le tri et la microscopie électronique pour observer les particules virales séparées.

Cette approche résoudra le problème majeur de la séparation des virus. Il s’agit d’un potentiel pour le clonage ameba ou le clonage protists en général. La personne qui essaie d’utiliser cette technique pour la première fois doit être rigoureuse et précise lors du contrôle de la pression.

Le contrôle visuel est essentiel pour confirmer la capture et la libération d’une seule cellule. Utilisez Vermamoeba Vermiformis, souche CDC 19, comme support cellulaire. Ajouter 30 millilitres de PYG moyen et trois millilitres de l’amibe à une concentration d’une fois dix à la sixième cellule par millilitre dans un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés.

Maintenir la culture à 28 degrés Celsius dans un incubateur. Après 48 heures, transférer 10 millilitres de la culture cellulaire amibe sur une diapositive de comptage et le placer sous un microscope pour quantifier l’amibe. Pour rincer, récolter 30 millilitres de la culture cellulaire dans un tube et granuler l’amibe par centrifugation à 720 fois G pendant 10 minutes.

Enlevez le supernatant et resuspendez la pastille dans le volume approprié de milieu de famine pour obtenir la concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Préparer le soutien cellulaire avec l’ajout d’agent antimicrobien. Dans un cabinet de biosécurité, ajouter une fois 10 à la sixième de la culture amibe en deux millilitres de milieu de famine.

Puis inoculer 100 millilitres de la solution de stock contenant le mélange de virus dans le soutien de la culture cellulaire amibe à une multiplicité d’infection de 0,01. Incuber le support de culture cellulaire amibe infecté. Ajouter 30 degrés Celsius pendant 10 à 14 heures ou jusqu’à ce que des effets cytopathiques soient induits comme l’arrondi amibal ou la lyse.

Ensuite, utilisez une seringue pour recueillir les médias et filtrate à travers un filtre de cinq microns pour enlever les débris cellulaires. Effectuer une dilution céréalière de l’échantillon viral dans le milieu de famine dans différents puits. Inoculer deux millilitres d’une fois 10 à la sixième Vermamoba Vermaformis contenue dans chaque boîte de Pétri avec 100 millilitres du mélange inoculum.

Ensuite, placez les boîtes de Petri dans un sac en plastique étanche à 30 degrés Celsius. À six heures après l’infection, observez les boîtes de Petri avec microscopie optique inversée et vérifiez la morphologie cellulaire toutes les quatre à huit heures. Le traitement anti-microbien est pour le soutien cellulaire.

Choisissez parmi les boîtes de Pétri celles qui ne sont pas contaminées visuellement par des agents fongiques et bactériens et avec des preuves de l’effet cytopathique des amibeux dus aux virus et avec la phase de pré-lyse et d’arrondi de l’amibe pour éviter l’aspiration des particules virales. Installez un poste de travail avec micro manipulateur, dispositif de pression de commande manuelle, microscope inversé, modules Plug and Play Motor, caméra et module informatique. Choisissez un micro capillaire de 20 microns de diamètre intérieur pour permettre l’entretien d’une position interne et une libération facile de la cellule.

Fixez l’angle de fonctionnement du système de préhension sur le module motorisé à 45 degrés. Effectuez une double installation, d’abord sur le système de préhension, puis sur le micro capillaire. Concentrez-vous sur les cellules.

Pour cloner les cellules, placez la boîte de Pétri contenant deux millilitres d’amibe infecté sous le microscope. Concentrez-vous d’abord sur les cellules, puis sur le micro capillaire immergé dans la culture. Cueillir une seule cellule arrondie et rapprocher le micro capillaire du micromanipulateur.

Exercez une aspiration douce avec un contrôle manuel de la pression sur la cellule qui la prend à l’intérieur du micro capillaire Retirez la cellule unique du premier échantillon et relâchez-la dans le support de culture cellulaire de l’amibe. Puis l’incuber à 30 degrés Celsius. Contrôlez soigneusement la pression pour être en mesure d’aspirer une seule cellule et de contrôler votre aspiration par l’observation de la libération d’une seule cellule.

Effectuer des observations quotidiennes avec un microscope optique inversé pour observer l’apparence des cellules et surveiller l’émergence de l’effet cytopathique. Maintenant, utiliser un système d’extraction automatisé pour extraire l’ADN d’une partie des échantillons de culture positive où un effet cytopathique est observé. Concevoir des amorces pour amplifier les gènes pauvres annotés comme RBP2 pour Faustovirus, protéine capsidique majeure pour Usurpatvirus, et protéine capsid mineure pour clandestinovirus.

Effectuez pcr standard à l’aide d’un thermocycleur selon le manuscrit. Effectuer 20 microlilitres de réactions PCR avec 50 micromolaires de chaque amorce, 1X Master Mix, et l’eau sans ribonuclease. Exécutez les produits PCR avec la tache de gel d’ADN sur un gel d’agarose de 1,5% à la tension de 135 volts et visualisez avec UV. Ce protocole optimise un processus de micromanipulation avec une micro aspiration à cellule unique.

Cette technique permet la capture d’une amibe arrondie et infectée et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibettes non infectées. Cette approche a réussi à isoler un nouveau virus géant à faible abondance nommé Userpatvirus LCD7. Votre Userpatvirus n’a été observé que dans le clone sept avec la présence de l’ADN userpatvirus LCD7 et l’absence d’ADN faustovirus.

La microscopie électronique a indiqué l’aspect de Clandestinovirus ST1, qui a une morphologie icosahedral typique sans fibrilles aussi bien qu’Usurpatvirus LCD7 avec un capside icosahedral d’environ 250 nanomètres. Une faible cytométrie confirme le chevauchement des populations de Faustovirus et de Nauvoirus. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée facilement.

La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est la nécessité d’un rituel d’observations minimales concernant la taille des entités avec la bonne manipulation des compétents du poste de travail et la vérification de tout problème de contamination. Cette approche peut être utilisée comme technique de tri sur la base de la morphologie cellulaire. Actuellement, il est utilisé dans notre laboratoire pour le clonage d’amibe spécifique.

Un point critique de cette technique est de maintenir l’intégrité cellulaire. En effet, nous pouvons avoir quelques problèmes avec la non-observation de la cellule ou la libération. Ceci est dû principalement à la désintégration de la cellule dans le micro capillaire.

Cette méthode pourrait être une alternative efficace lorsque la télémétrie des défauts et le tri des faits ne sont pas disponibles et lorsque des limitations techniques spécifiques sont atteintes. N’oubliez pas que dans certains cas, la cellule n’est pas libérée par le micro capillaire. Cela est dû en partie aux caractéristiques de l’amibe et à leur capacité d’adaptation, puis à partir de la membrane cellulaire.