Name: Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez la micro-aspiration à cellule unique pour isoler des virus géants de faible abondance à partir de Vermamoeba vermiformis. Cette méthode offre une alternative efficace au tri cellulaire activé par fluorescence.

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Les auteurs tiennent à remercier à la fois Jean-Pierre Baudoin et Olivier Mbarek pour leurs conseils et Claire Andréani pour son aide dans les corrections et les modifications en anglais. Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Etat Français gérée par l'Agence Nationale de la Recherche dans le cadre du programme "Investissements d'avenir)" avec la référence ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) et par Région Provence Alpes Côte d'Azur et financement européen FEDER PRIMI.

1. Culture Amoeba
<ol><li>Utilisez Vermamoeba vermiformis (souche CDC19) comme support cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 30 ml de protéase-peptone-levure extrait-glucose milieu (PYG) (tableau 1) et 3 ml d'amibes à une concentration de 1 x 106 cellules/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm2.</li>
	<li>Maintenir la culture à 28 oC.</li>
	<li>Après 48 h, quantifier les amibes à l'aide de diapositives de comptage.</li>
	<li>Pour rincer, récolter les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL et granuler les amibes par centrifugation à 720 x g pendant 10 min. Retirez le supernatant et suspendez le granule dans le volume approprié du milieu de famine pour obtenir 1 x 106 cellules/mL (tableau 1).</li>
</ol>2. Propagation du virus des stocks dans les amibes
REMARQUE: Avant la dilution, il est important de culture de l'échantillon de stock pour obtenir suffisamment de culture fraîche, puis procéder à la filtration.
<ol><li>Utilisez 1 x 106 de la culture de l'amibe dans le milieu de la famine.</li>
	<li>Inoculer le mélange de virus émis par la solution stock (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 ou Faustovirus/Clandestinovirus ST1) après le processus de co-culture sur le support cellulaire à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01. REMARQUE: Le MOI est important pour réduire l'abondance de la population virale majeure et le nombre de cellules infectées.</li>
	<li>Incuber à 30 oC jusqu'à ce que les effets cytopathiques (CPE) soient induits, comme l'arrondi de l'amibal ou la lyse, environ 10 à 14 h après l'infection.</li>
	<li>Recueillir les supports et les filtrate à travers un filtre de 5 m pour enlever les débris cellulaires.</li>
</ol>3. Dilution de point final
<ol><li>Effectuer une dilution en série (10-1 à 10-11) de l'échantillon viral dans le milieu de la famine (tableau 1).</li>
	<li>Inoculer 2 ml de 1 x 106 Vermamoeba vermiformis contenudans chaque plat Petri avec 100 l l de l'inoculum de mélange.</li>
	<li>Placer la vaisselle Petri dans un sac en plastique hermétique à 30 oC.</li>
	<li>Commencez à observer les plats Petri avec microscopie optique inversée à 6 h postinfection et vérifiez la morphologie cellulaire tous les 4 à 8 h.</li>
	<li>À l'apparition de l'effet cytopathique caractérisé par les cellules arrondies, commencer le processus de micro-aspiration à cellule unique.</li>
</ol>4. Micro-aspiration à cellule unique
<ol><li>
Préparez l'hôte. REMARQUE: Cette préparation est faite pour la libération de cellules individuelles infectées à un soutien cellulaire frais.<ol>
<li>Traiter les amibes dans la culture avec un agent antimicrobien contenant 10 g/mL de vancomycine, 10 g/mL d'imipenem, 20 g/mL de ciprofloxacine, 20 g/mL de doxycycline et 20 g/mL de voriconazole. Ce mélange est utilisé pour éviter la contamination bactérienne et fongique. REMARQUE: La procédure se déroule sur un banc à l'extérieur de la station de sécurité microbiologique. Ajouter 2 ml d'amibes concentrées à 1 x 106 cellules/mL chacune dans 15 plats Petri. Pour l'adhésion à l'amibe, incuber la culture à 30 oC pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez le plat Petri utilisé pour la micro-aspiration à partir de la dilution limite selon les critères suivants : 1) absence de contamination visible par des agents fongiques et bactériens, 2) preuve d'effet cytopathique des amibes due aux virus, et 3) prélyse et la phase d'arrondissement des amibes (pour éviter l'aspiration des particules virales).</li>
	<li>
Mettre en place un poste de travail avec les matériaux suivants (voir la figure 1A,B) : Micromanipulateur, qui permet un positionnement microcapillaire; Dispositif de pression de commande manuel, utilisé pour aspirer et libérer les cellules dans le microcapillary; microscope inversé; Branchez et jouez aux modules moteurs; Appareil photo; Module informatique pour visualiser la manipulation et prendre des photos.</li>
	<li>Choisissez un microcapillary (voir Figure 1C). REMARQUE: La taille des cellules, la déformation et l'adhérence de leurs membranes aux surfaces, et la motilité cellulaire peuvent avoir un impact sur le bon déroulement de la micro-aspiration. Le diamètre microcapillaire peut être choisi avec précision et adapté à des types de cellules spécifiques en fonction de leur taille et de leurs méthodes d'aspiration. Un microcapillaire de 20 m de diamètre intérieur a été utilisé pour aspirer une amibe arrondie (diamètre de 10 m). Cela permet l'entretien d'une position interne et une libération facile de la cellule.</li>
	<li>
Montez le système.
	<ol>
<li>Fixez l'angle de fonctionnement du système de préhension sur le module motorisé à 45 degrés.</li>
		<li>Effectuer une double installation, d'abord sur le système de préhension, puis sur le microcapillary.</li>
		<li>Concentrez-vous sur les cellules après avoir fait fonctionner quelques gouttes d'huile à travers le microcapillaire. REMARQUE: L'huile minérale avec compatibilité biologique est fournie par l'appareil.</li>
		<li>Montage complet suivant les recommandations du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellules clones (voir Figure 2A,B). REMARQUE : Cette procédure est similaire à celle décrite par Frôhlich et Konig31.<ol>
<li>Placer le plat Petri contenant 2 ml d'amibes infectées sous le microscope.</li>
		<li>Concentrez-vous d'abord sur les cellules, puis sur le microcapillaire immergé dans la culture.</li>
		<li>Choisissez une cellule unique arrondie et rapprochez le microcapillary du micromanipulateur.</li>
		<li>Exercez une aspiration douce avec un contrôle manuel de la pression sur la cellule, en la prenant à l'intérieur du microcapillaire. Retirez la cellule unique du premier échantillon et relâchez-la dans le support cellulaire, puis incubez-la à 30 oC.</li>
		<li>Effectuez des observations quotidiennes avec un microscope optique inversé pour observer l'apparence des cellules et pour surveiller l'émergence de l'effet cytopathique.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Dépistage PCR
REMARQUE: Après l'étape 4, un dépistage systématique par PCR est crucial pour confirmer la séparation. Dans les systèmes usurpativirus/Faustovirus et clandestinovirus/Faustovirus, la conception et l'application des systèmes spécifiques d'apprêt et de sonde ont été faites à l'aide de Primer-BLAST en ligne32 (tableau 2).
<ol><li>Extraire l'ADN d'une partie des échantillons de culture positive (c.-à-d. où un effet cytopathique est observé), à l'aide d'un système d'extraction automatisé selon le protocole du fabricant.</li>
	<li>Utilisez des amorces bien conçues. REMARQUE: Ici, nous avons conçu des amorces pour amplifier les gènes de base annotés comme RpB2 (Faustovirus), LCD7 protéine capside majeure (Usurpatvirus) et protéine capside mineure (Clandestinovirus)</li>
	<li>
Effectuez PCR standard à l'aide d'un thermocycler.
	<ol>
<li>Effectuer 20 réactions PCR ll avec 50 M de chaque amorce (tableau 2), 1x Master Mix, et de l'eau libre RNase.</li>
		<li>Activer la polymérase d'ADN Taq pendant 5 min à 95 oC, puis suivre avec 45 cycles de dénaturation de 10 s à 95 oC, annealing des amorces pour 30 s à 58 oC, et l'extension pour 30 s à 72 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécuter les produits PCR sur un gel agarose de 1,5%, tache avec la tache de gel d'ADN (Tableau des matériaux), et visualiser avec UV.</li>
</ol>6. Production et purification de virus
<ol><li>Remettre le reste de la culture du plat Petri dans un petit flacon.</li>
	<li>Pour la production du virus, préparer 15 flacons de 145 cm2, contenant 40 ml de vermiforme Vermamoeba dans le milieu de la famine et 5 ml du virus isolé déjà transféré du plat Petri à de petits flacons.</li>
	<li>Traiter avec le même mélange antibiotique et antifongique utilisé à l'étape 4.1.</li>
	<li>Incuber à 30 oC. Observez tous les jours avec la microscopie optique inversée.</li>
	<li>Après l'infection complète, mettre en commun tous les flacons. Utilisez un filtre de 0,45 m pour éliminer les débris.</li>
	<li>Ultracentrifuge tous les supernatants à 50.000 x g pendant 45 min.</li>
	<li>Après centrifugation, retirer le supernatant de chaque tube par aspiration et resuspendre le granule dans 1 ml de phosphate tamponné salin (PBS).</li>
	<li>Purifez le virus produit à l'aide de 25 % de saccharose (27,5 g de saccharose dans 100 ml de PBS, stérilisé par filtration).</li>
	<li>Centrifugement 8 ml de saccharose et 2 ml de suspension virale à 80 000 x g pendant 30 min. Resuspendre la pastille virale dans 1 ml de PBS. Conservez-le à -80 oC.</li>
</ol>7. Microscopie négative de la coloration et de la transmission d'électrons
REMARQUE: Bou Khalil et coll. ont déjà publié ce protocole27.
<ol><li>Déposer 5 ll du supernatant de lyse sur la grille lumineuse. Laisser reposer environ 20 min à température ambiante. REMARQUE: La décharge lumineuse nous permet d'obtenir un réseau hydrophile par application de plasma.</li>
	<li>Séchez soigneusement la grille et déposez une petite goutte de molybdate d'ammonium de 1 % pendant 10 s. Laissez la grille sécher pendant 5 min.</li>
	<li>Procéder à des observations de microscopie électronique à 200 keV.</li>
</ol>8. Caractérisation du clandestinovirus ST1 et de l'usurpativirus LCD7
<ol><li>Caractériser les populations pures de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7 en utilisant le séquençage du génome, l'assemblage du génome, les analyses bioinformatiques, et l'étude de leur cycle réplicif comme nous l'avons fait pour d'autres virus10,20, 29.</li>
</ol>

<ol><li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li>
<li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Giant+Virus+in+Amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033(2003).</li>
<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum%2C+a+new+30%2C000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285(2018).</li>
<li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166(2018).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus%2C+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus%2C+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300(2016).</li>
<li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372(2018).</li>
<li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li>
<li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76(2016).</li>
<li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medusavirus%2C+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430(2019).</li>
<li>Abrahão, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749(2018).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li>
<li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaumoebavirus%2C+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278(2016).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orpheovirus+IHUMI-LCC2%3A+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779(2018).</li>
<li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li>
<li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+brown+tide+virus+%28AaV%29%2C+the+little+giant+of+the+Megaviridae%2C+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li>
<li>Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+%28CeV%29+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li>
<li>Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+%28BsV%29%2C+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235(2018).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li>
<li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26(2016).</li>
<li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104(2016).</li>
<li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacmanvirus%2C+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li>
<li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722(2017).</li>
<li>Fröhlich, J., König, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).</li>
<li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li>
</ol>

Tous les auteurs n'ont rien à divulguer.

La durée de la manipulation de micro-aspiration à cellule unique et son bon fonctionnement dépendent de l'opérateur. Les différentes étapes de l'expérience exigent de la précision. L'utilisation des composants de micromanipulation du poste de travail doit être sous contrôle constant en observant le processus de micro-aspiration et la libération de la cellule. Le suivi par observation microscopique est nécessaire pour la capture et le transfert d'une cellule. Un opérateur expérimenté peut prendre 1 à 2 h pour isoler 10 ce...

Les virus nucléocytoplasmiques de gros virus d'ADN (NCLDV) sont extrêmement divers, définis par quatre familles qui infectent des eucaryotes1. Les premiers virus décrits avec des génomes supérieurs à 300 kbp étaient Phydcodnaviridae, y compris Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. L'isolement et la première description de Mimivirus, a montré que la taille des virus a doublé en termes à la fois de la taille de la particule (450 nm) et la longueur du génome (1,2 Mo)3. Depuis lors, de nombreux virus géants ont été décrits, généralement isolés à l'aide d'une procédure de co-culture de l'amibe. Plusieurs virus géants avec des morphologies et des contenus génétiques différents peuvent être isolés à partir des cellules acanthamoeba sp., y compris les virus de Marseille, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, et récemment Médusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. En parallèle, l'isolement de Vermamoeba vermiformis a permis l'isolement et la description des virus géants Faustovirus, Kaumoebavirus, et Orpheovirus18,19,20. D'autres virus géants ont été isolés avec leurs protistes hôtes, tels que la cafétéria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, et Bodo saltans 24. Tous ces isolements sont le résultat d'un nombre croissant d'équipes travaillant sur l'isolement et de l'introduction de mises à jour de stratégie à haut débit25,26,27,28, telles que le l'amélioration du système de co-culture avec l'utilisation de la cytométrie de flux.
En 2016, nous avons utilisé une stratégie associant la co-culture et la cytométrie des flux pour isoler les virus géants27. Cette stratégie a été développée pour augmenter le nombre d'échantillons inoculés, pour diversifier les protistes utilisés comme supports cellulaires, et pour détecter rapidement la lyse du support cellulaire. Le système a été mis à jour en ajoutant une étape supplémentaire pour éviter l'identification préliminaire de la biologie moléculaire et la détection rapide d'une population virale inconnue comme dans le cas de Pacmanvirus29. La cytométrie de flux de couplage au tri cellulaire a permis la séparation d'un mélange de Mimivirus et cedratvirus A1130. Cependant, nous avons plus tard rencontré les limites de la séparation et de la détection de ces sous-populations virales par cytométrie de flux. Après le séquençage, lorsque nous avons assemblé les génomes du Faustovirus ST125 et du Faustovirus LCD7 (données non publiées), nous avons étonnamment trouvé dans chaque assemblage deux génomes supplémentaires de deux nouveaux virus non identifiés dans les bases de données du génome public. Cependant, ni la cytométrie de flux ni la microscopie électronique de transmission (TEM) n'ont montré que les amibes étaient infectées par deux virus différents, le clandestinovirus ST1 et l'usurpativirus LCD7. Nous avons conçu des systèmes PCR spécifiques pour amplifier les marqueurs de Faustovirus, d'Usurpativirus et de Clandestinovirus respectivement en fonction de leurs génomes ; notre but était d'avoir des systèmes basés sur PCR qui permettent de vérifier la pureté des virus séparés. Cependant, la dilution et la cytométrie de flux de point final n'ont pas réussi à les séparer. L'isolement de cette population virale unique a été difficile parce que ni la morphologie ni les éléments réplicateurs des populations de clandestinovirus et d'usurpativirus n'ont été caractérisés. Nous avons détecté une seule population virale par cytométrie de flux due au chevauchement des deux populations (testéeaprès la séparation effective). Nous avons essayé de les séparer à l'aide d'un seul tri de particules sur des plaques de 96 puits, mais nous n'avons observé aucun effet cytopathique, et nous n'avons détecté ni clandestinovirus ni usurpativirus par amplification PCR. Enfin, ce n'est que la combinaison de la dilution des points de terminaison suivie d'une seule micro-aspiration à l'amibe qui a permis la séparation de ces deux virus géants à faible abondance des Faustovirus. Cette méthode de séparation fait l'objet de cet article.

<table><tbody><tr><td>Agarose Standard</td><td>Euromedex</td><td>Unkown</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398876</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Contrôlez les cellules pendant le processus de microaspiration</td></tr><tr><td>Flacons de culture cellulaire Corning 150 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430825</td><td>Culture</td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire Corning 25 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430639</td><td>Culture</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Corning flacons de culture cellulaire 75 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td> CLS430641</tr><tr><td>Caméra DFC 425C LEICA</td><td></td><td>Unkown</td><td>Observation/Monitoring</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-S Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Unkown</td><td>Observation/Monitoring</td></tr><tr><td>EZ1 avancé XL</td><td>Quiagen</td><td>9001874</td><td>Extraction d’ADN</td></tr><tr><td>Glasstic Slide 10 avec grilles de comptage</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td>Comptage cellulaire</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td>Standard</td></tr><tr><td>PCR Microcapillaire 20 & micro ; m</td><td>Eppendorf</td><td>5175 107.004</td><td>Microaspiration et libération de cellules</td></tr><tr><td>Micromanipulateur InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>631-0210</td><td>Positionnement microcapillaire</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9920</td><td>PCR standard</td></tr><tr><td>Optima XPN Ultracentrifugeuse</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A94469</td><td>Purification du virus</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Culture/observation</td></tr><tr><td>Filtres stériles pour seringues 5 & micro ; m</td><td>Sigma-aldrich</td><td>SLSV025LS</td><td>Filtration</td></tr><tr><td>SYBR vert Type I</td><td>Invitrogen</td><td>inconnu</td><td>Sondes moléculaires fluorescentes/cytométrie en flux</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>PCR standard ; Coloration au gel d’ADN</td></tr><tr><td>Tecnai G20</td><td>FEI</td><td>Unkown</td><td>Microscopie électronique</td></tr><tr><td>Type 70 Ti Rotor à angle fixe en titane</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>337922</td><td>Purification du virus</td></tr><tr><td>Tube ultra-transparent, 25 x 89 mm2</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>344058</td><td>Purification du virus</td></tr></tbody></table>

micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Pendant le processus de co-culture de l'amibe, plus d'un virus peut être isolé dans un seul puits. Nous avons précédemment résolu ce problème par dilution de point final et/ou tri activé de cellules de fluorescence (FACS) appliqué à la population virale. Cependant, lorsque les virus dans le mélange ont des propriétés morphologiques similaires et que l'un des virus se multiplie lentement, la présence de deux virus est découverte au stade de l'assemblage du génome et les virus ne peuvent pas être séparés pour une autre caractérisation. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une procédure de micro-aspiration à cellule unique qui permet la séparation et le clonage de virus très similaires. Dans le présent travail, nous présentons comment cette stratégie alternative nous a permis de séparer les petites sous-populations virales de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7, virus géants qui se développent lentement et ne conduisent pas à la lyse amiale par rapport à la lytique et à croissance rapide Le Faustovirus. Le contrôle de pureté a été évalué par amplification spécifique de gène et des virus ont été produits pour davantage de caractérisation.

La micro-aspiration à cellule unique est un processus de micromanipulation optimisé dans ce manuscrit (figure 1). Cette technique permet la capture d'une amibe arrondie et infectée (figure 2A) et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibes non infectées (figure 2). Il s'agit d'un prototype fonctionnel qui s'applique au système de co-culture et a réussi à isoler les virus géants non-lytiques. Cette ap...

Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.

Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

La micro-aspiration à cellule unique est une méthode qui complète les différentes techniques utilisées dans le domaine de la microbiologie en général et de la virologie en particulier. Il pourrait répondre à la question clé et résoudre les problèmes rencontrés lors de l’isolement des virus géants en séparant un virus d’un mélange viral présentant un virus de faible abondance comme c’était le cas pour les virus de chiffre d’affaires, le virus clandisinal, et le virus uzibati d’un autre, qui est Faustovirus, présent en abondance élevée de toute façon. Le principal avantage de cette approche est l’utilisation d’une stratégie indirecte.Il consiste à séparer et clonage l’hôte infecté pour obtenir une séparation virale. Ainsi, cette méthode surveille les différentes étapes de la capture à la libération des cellules et confirme le processus de tri par observation microscopique. Enfin, la biologie moléculaire est utilisée pour confirmer le tri et la microscopie électronique pour observer les particules virales séparées.Cette approche résoudra le problème majeur de la séparation des virus. Il s’agit d’un potentiel pour le clonage ameba ou le clonage protists en général. La personne qui essaie d’utiliser cette technique pour la première fois doit être rigoureuse et précise lors du contrôle de la pression.Le contrôle visuel est essentiel pour confirmer la capture et la libération d’une seule cellule. Utilisez Vermamoeba Vermiformis, souche CDC 19, comme support cellulaire. Ajouter 30 millilitres de PYG moyen et trois millilitres de l’amibe à une concentration d’une fois dix à la sixième cellule par millilitre dans un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés.Maintenir la culture à 28 degrés Celsius dans un incubateur. Après 48 heures, transférer 10 millilitres de la culture cellulaire amibe sur une diapositive de comptage et le placer sous un microscope pour quantifier l’amibe. Pour rincer, récolter 30 millilitres de la culture cellulaire dans un tube et granuler l’amibe par centrifugation à 720 fois G pendant 10 minutes.Enlevez le supernatant et resuspendez la pastille dans le volume approprié de milieu de famine pour obtenir la concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Préparer le soutien cellulaire avec l’ajout d’agent antimicrobien. Dans un cabinet de biosécurité, ajouter une fois 10 à la sixième de la culture amibe en deux millilitres de milieu de famine.Puis inoculer 100 millilitres de la solution de stock contenant le mélange de virus dans le soutien de la culture cellulaire amibe à une multiplicité d’infection de 0,01. Incuber le support de culture cellulaire amibe infecté. Ajouter 30 degrés Celsius pendant 10 à 14 heures ou jusqu’à ce que des effets cytopathiques soient induits comme l’arrondi amibal ou la lyse.Ensuite, utilisez une seringue pour recueillir les médias et filtrate à travers un filtre de cinq microns pour enlever les débris cellulaires. Effectuer une dilution céréalière de l’échantillon viral dans le milieu de famine dans différents puits. Inoculer deux millilitres d’une fois 10 à la sixième Vermamoba Vermaformis contenue dans chaque boîte de Pétri avec 100 millilitres du mélange inoculum.Ensuite, placez les boîtes de Petri dans un sac en plastique étanche à 30 degrés Celsius. À six heures après l’infection, observez les boîtes de Petri avec microscopie optique inversée et vérifiez la morphologie cellulaire toutes les quatre à huit heures. Le traitement anti-microbien est pour le soutien cellulaire.Choisissez parmi les boîtes de Pétri celles qui ne sont pas contaminées visuellement par des agents fongiques et bactériens et avec des preuves de l’effet cytopathique des amibeux dus aux virus et avec la phase de pré-lyse et d’arrondi de l’amibe pour éviter l’aspiration des particules virales. Installez un poste de travail avec micro manipulateur, dispositif de pression de commande manuelle, microscope inversé, modules Plug and Play Motor, caméra et module informatique. Choisissez un micro capillaire de 20 microns de diamètre intérieur pour permettre l’entretien d’une position interne et une libération facile de la cellule.Fixez l’angle de fonctionnement du système de préhension sur le module motorisé à 45 degrés. Effectuez une double installation, d’abord sur le système de préhension, puis sur le micro capillaire. Concentrez-vous sur les cellules.Pour cloner les cellules, placez la boîte de Pétri contenant deux millilitres d’amibe infecté sous le microscope. Concentrez-vous d’abord sur les cellules, puis sur le micro capillaire immergé dans la culture. Cueillir une seule cellule arrondie et rapprocher le micro capillaire du micromanipulateur.Exercez une aspiration douce avec un contrôle manuel de la pression sur la cellule qui la prend à l’intérieur du micro capillaire Retirez la cellule unique du premier échantillon et relâchez-la dans le support de culture cellulaire de l’amibe. Puis l’incuber à 30 degrés Celsius. Contrôlez soigneusement la pression pour être en mesure d’aspirer une seule cellule et de contrôler votre aspiration par l’observation de la libération d’une seule cellule.Effectuer des observations quotidiennes avec un microscope optique inversé pour observer l’apparence des cellules et surveiller l’émergence de l’effet cytopathique. Maintenant, utiliser un système d’extraction automatisé pour extraire l’ADN d’une partie des échantillons de culture positive où un effet cytopathique est observé. Concevoir des amorces pour amplifier les gènes pauvres annotés comme RBP2 pour Faustovirus, protéine capsidique majeure pour Usurpatvirus, et protéine capsid mineure pour clandestinovirus.Effectuez pcr standard à l’aide d’un thermocycleur selon le manuscrit. Effectuer 20 microlilitres de réactions PCR avec 50 micromolaires de chaque amorce, 1X Master Mix, et l’eau sans ribonuclease. Exécutez les produits PCR avec la tache de gel d’ADN sur un gel d’agarose de 1,5% à la tension de 135 volts et visualisez avec UV. Ce protocole optimise un processus de micromanipulation avec une micro aspiration à cellule unique.Cette technique permet la capture d’une amibe arrondie et infectée et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibettes non infectées. Cette approche a réussi à isoler un nouveau virus géant à faible abondance nommé Userpatvirus LCD7. Votre Userpatvirus n’a été observé que dans le clone sept avec la présence de l’ADN userpatvirus LCD7 et l’absence d’ADN faustovirus.La microscopie électronique a indiqué l’aspect de Clandestinovirus ST1, qui a une morphologie icosahedral typique sans fibrilles aussi bien qu’Usurpatvirus LCD7 avec un capside icosahedral d’environ 250 nanomètres. Une faible cytométrie confirme le chevauchement des populations de Faustovirus et de Nauvoirus. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée facilement.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est la nécessité d’un rituel d’observations minimales concernant la taille des entités avec la bonne manipulation des compétents du poste de travail et la vérification de tout problème de contamination. Cette approche peut être utilisée comme technique de tri sur la base de la morphologie cellulaire. Actuellement, il est utilisé dans notre laboratoire pour le clonage d’amibe spécifique.Un point critique de cette technique est de maintenir l’intégrité cellulaire. En effet, nous pouvons avoir quelques problèmes avec la non-observation de la cellule ou la libération. Ceci est dû principalement à la désintégration de la cellule dans le micro capillaire.Cette méthode pourrait être une alternative efficace lorsque la télémétrie des défauts et le tri des faits ne sont pas disponibles et lorsque des limitations techniques spécifiques sont atteintes. N’oubliez pas que dans certains cas, la cellule n’est pas libérée par le micro capillaire. Cela est dû en partie aux caractéristiques de l’amibe et à leur capacité d’adaptation, puis à partir de la membrane cellulaire.

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Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants (Vidéo) | JoVE Journal

Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

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