Name: Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Apprenez à isoler les leucocytes du lait maternel humain pour étudier la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps contre le VIH. Cette méthode permet d'évaluer la capacité phagocytaire des cellules immunitaires maternelles.

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Nous remercions la Dre Susan Zolla-Pazner, du Département de médecine et de microbiologie de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï, pour son examen des manuscrits. Le NIH/NICHD a fourni du financement pour ce projet sous le numéro de subvention R21 HD095772-01A1. En outre, R. Powell a été soutenu par des fonds du Département de médecine, Division des maladies infectieuses, Icahn School of Medicine à Mount Sinai.

Chaque participant à cette étude a été recruté et interviewé en accord avec l'approbation de la Commission d'examen éthique et institutionnel (CISR) avec les directives et l'autorisation du Programme de protection des sujets humains (PPHS) approuvé par le Mont Sinaï à l'aide d'un protocole pour l'obtention d'échantillons de lait maternel.
1. Cibler la préparation de la microsphère
<ol><li>Sélectionnez un antigène cible pertinent. REMARQUE : Dans cet exemple, la protéine recombinante V1V2-2F5K a été utilisée, qui a été conçue pour imiter l'apex trimérique de l'enveloppe indigène de VIH30.</li>
	<li>Effectuer la biotinylation à l'aide d'un kit commercial (Table of Materials) selon le protocole du fabricant.<ol>
<li>Calculer la mmol du réactif de biotine pour ajouter à la réaction pour un excès de molaire 5 fois à l'aide de la formule: mmol biotine - mL protéine x (protéine mg/mL protéine) x (protéine de biotine de mmol/mg) x (5 mmol biotine/protéine mmol)30,31. Calculez ensuite le réagent de biotine à ajouter à l'aide de la formule : biotine L et biotine de mmol x (1 000 000 l/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Équilibrez la biotine à température ambiante avant l'ouverture. Dissoudre la protéine dans 0.5-2.0 mL de saline phosphate-tamponné (PBS) selon le calcul fait ci-dessus.</li>
		<li>Préparer une solution de 10 mM de réactif de biotine dans le diméthylsulfoxide (DMSO) et ajouter le volume approprié de 10 mM de réactif de biotine à la solution protéique, et incuber la réaction sur la glace pendant 2 h ou à température ambiante pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlever l'excès de biotine à l'aide de concentrateurs de protéines (membranes polyéthersulfone [PES], 3 kDa de poids moléculaire coupé [MWCO], 0,5 mL; Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.<ol>
<li>Déposez l'échantillon dans la chambre supérieure de la colonne de spin et ajoutez du PBS jusqu'à 400 l. Cap, puis insérez cette chambre d'échantillon dans un tube de collecte. Centrifugeuse à 12 000 x g à température ambiante pendant 30 min.</li>
		<li>Jeter le flux à travers et ajouter PBS à 400 l. Répéter la centrifugation. Jetez le flux à travers et ajoutez pbS à 100 l. Mesurer la concentration de protéines par un spectrophotomètre. REMARQUE : Les protéines peuvent être aliquoted et congelées à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Phagocytose cellulaire anticorps-dépendante (ADCP) Préparation de plaque d'essai
<ol><li>Conjuguer les protéines biotinylated à 1 m microsphères (« perles »; Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.<ol>
<li>Par assiette de perles conjuguées, incuber 6 g de protéines avec 12 l de perles de bouillon dans 200 L de 0,1 % d'albumine de sérum bovin (BSA)-PBS à température ambiante pendant 1 h, vortexant doucement toutes les 20 min.</li>
		<li>Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant, le vortex doucement et le resuspendre en 1200 'L de 0,1% BSA-PBS. Répétez le spin et lavez l'étape 2x. Resuspendre en 1200 l de 0,1% BSA-PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 10 l de solution de perle par puits dans une plaque ronde de 96 puits. Préparer des dilutions d'anticorps ou de sérum immunitaire sédentaire dans 12 'L de 2% HSA HBSS, généralement à partir de 50 'g/mL d'anticorps ou une dilution de sérum 1/100. REMARQUE : Dans les données de l'échantillon, l'anticorps monoclonal (mAb) 830A a été utilisé.</li>
	<li>Ajouter 10 ldddd d'anticorps/sérum titrés à la plaque de perles et couver pendant 2 h à 37 oC. Ajouter 200 oL de 2 % de HSA HBSS à chaque puits et plaque de centrifugeuse à 2 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Retirez soigneusement le supernatant par un renversement rapide et une décantation du liquide des puits de plaque dans un évier pour éviter de déranger la boulette de perle invisible.</li>
</ol>3. Isolement des cellules du lait maternel
<ol><li>Obtenir du lait maternel humain auprès de femmes allaitantes en bonne santé, exprimé à l'aide de pompes électroniques ou manuelles doubles. Isoler les cellules à moins de 4 h de l'expression, en gardant le lait à température ambiante.</li>
	<li>À l'aide de tubes de 50 ml, centrifuger 50 ml de lait à 800 x g pendant 15 min. Verser soigneusement le lait écrémé et la graisse tout en laissant le granule cellulaire intact. Essuyez l'intérieur du tube avec une lingette sans papier pour enlever toute la graisse de la paroi du tube.</li>
	<li>Ajoutez 10 ml d'albumen de sérum humain de 2 % dans la solution de sel équilibrée de Hank (2 % HSA HBSS [sans Ca2 ou Mg)). Resuspendre le granule par pipetage doux pour éviter l'activation cellulaire et l'apoptose. Transférer dans un tube de 15 ml et une centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Verser le supernatant et répéter l'étape 1.3. Ensuite, resuspend doucement les cellules dans 1/2 ml de 2% HSA HBSS en fonction du nombre de cellules prévu, et compter les cellules par un hémocytomètre ou un compteur cellulaire automatisé, notant également la viabilité cellulaire.</li>
</ol>4. ADCP d'astoique
REMARQUE : Les méthodes décrites ici sont adaptées d'Ackerman et coll.32.
<ol><li>Ajoutez 50 000 cellules BM fraîchement isolées à chaque plaque d'adpode aDCP dans 200 L de 2 % De HSA-HBSS. Incuber pendant 2 h à 37 oC.<ol>
<li>Pour les expériences de contrôle, les cellules pré-incubées à 37 oC avec un inhibiteur de l'actine de 10 g/mL (cytochalasin-D), un agent de blocage De50 g/mL FcR (FcBlock) ou une combinaison des deux avant leur ajout aux plaques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min. Ajouter 200 l de 2 % HSA HBSS et répéter la centrifugation. Retirez soigneusement le supernatant comme à l'étape 2.7 et répétez le lavage.</li>
	<li>Enlever soigneusement les supernatants et les cellules tachées pour la viabilité en utilisant 0,5 g/mL (concentration finale) tache de viabilité fixable 450 par puits dans 50 'L de 2% HSA HBSS. Incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min et retirer le supernatant comme à l'étape 2.7. Ajouter 200 L de 2% HSA HBSS et plaque de centrifugeuse à nouveau suivie par l'enlèvement du supernatant comme à l'étape 2.7.</li>
	<li>Après coloration de viabilité, les cellules de tache pour les marqueurs de leucocyte d'intérêt, y compris un minimum d'une tache CD45-spécifique telle que PE-souris anti-humain CD45 (clone HI30) à une concentration optimisée (1 'g/L dans 50 'L de 1% BSA HBSS dans les données d'exemple). REMARQUE : Tous les marqueurs d'intérêt spécifiques à la lignée peuvent être inclus.</li>
	<li>Incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min et retirer le supernatant comme à l'étape 2.7. Ajouter 200 l de 1 % de BSA HBSS et répéter la centrifugation. Enlever le supernatant. Fixer les cellules dans 200 oL de 0,5 % de formaldéhyde dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min ou pendant la nuit à 4 oC. Réfrigérer dans l'obscurité jusqu'à l'analyse.</li>
</ol>5. Analyse par cytométrie de flux
<ol><li>Effectuer le gating initial pour éliminer les doublets sur une dispersion vers l'avant (FSC) par rapport à la dispersion latérale (SSC) parcelle et les débris (matériel plus petit que FSC 5000) (voir Figure 1). Utilisez une tache SSC vs viabilité (V450 dans ce cas) parcelle pour éliminer les cellules mortes (ceux qui sont positifs pour la tache de viabilité).</li>
	<li>Utilisez une parcelle SSC vs CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes (granulocytes, monocytes, lymphocytes) comme décrit sazèle 33,34. REMARQUE : Cette classification n'est que suggestive et des marqueurs spécifiques à la lignée sont nécessaires pour confirmer le type de cellule.</li>
	<li>Pour toutes les cellules CD45MD, ou pour chaque sous-ensemble d'intérêt des leucocytes, mesurez l'activité aDCP en gatingant avec un marqueur sur les cellules perlées-positives dans un histogramme du canal isothiocyanate de fluorescéine (FITC), où les perles fluorescentes sont détectées. REMARQUE : Les puits de contrôle négatifs dans lesquels les perles n'ont pas été ajoutées indiqueront où les cellules perlées-positives sont apparentes dans l'histogramme et donc où placer le marqueur de gating.</li>
	<li>Calculer les scores ADCP comme (intensité médiane de fluorescence [IMF] des cellules perlées-positives) x (% du Total CD45 - cellules dans la population positive). Utilisez un logiciel graphique pour tracer les scores à chaque concentration Ab/sérum et effectuer une analyse de zone sous la courbe (AUC). REMARQUE : L'ADCP est considéré comme positif si l'AUC est supérieur à 3 x 3 fois l'écart-type de l'AUC de score ADCP d'un mAb négatif non spécifique de contrôle (dans ce cas, 3865).</li>
</ol>

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<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La technique basée sur la cytométrie du débit pour mesurer l'activité ADCP décrite ci-dessus a été décrite pour la première fois en 201130 et a depuis fait ses preuves et a été citée dans plus de 80 études. Le protocole décrit ici adapte cette technique pour une utilisation avec des cellules BM primaires pour la première fois. Les études antérieures de la fonctionnalité fc-négociée par les cellules De MB ont été en grande partie limitées à la mesure des éclats oxydatifs ou des essais de phagocytos...

Le lait maternel humain (BM) est composé de cellules maternelles qui sont viablesà 90% 1 . La composition cellulaire est fortement affectée par le stade de lactation, l'état de santé de la mère et du nourrisson, et la variation individuelle, qui reste mal comprise1,2,3,4. Étant donné que la BM contient 103à 105 leucocytes/mL, on peut estimer que les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour5. Diverses études in vivo ont démontré que les leucocytes maternels fournissent une immunité critique au nourrisson et sont fonctionnels bien au-delà de ces sites d'ingestion initiale5,6,7,7 ,9,10,11. Toutes les cellules d'origine maternelle ingérées par le nourrisson ont le potentiel d'effectuer des fonctions immunitaires à côté ou de compenser les leucocytes12.
La transmission mère-enfant (TMT) du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste une crise dans les pays à ressources limitées. Étant donné que les maladies diarrhéiques et respiratoires sont responsables de taux de mortalité importants chez les nourrissons dans les pays à ressources limitées, et que ces maladies sont considérablement réduites par l'allaitement exclusif, les avantages pour les mères infectées par le VIH l'allaitement maternel l'emporte de loin sur les risques13,14,15. À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH16. Environ 100 000 MTT par l'intermédiaire de BM se produisent annuellement ; pourtant, seulement 15 % des nourrissons allaités par leur mère infectée par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur de la BM17,18,19,20,21. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour prévenir la transmission. Fait important, les anticorps spécifiques au VIH (Abs) dans le BM ont été corrélés avec une réduction du MTCT et/ou une réduction de la mortalité infantile par infection par le VIH22,23. Ce qui reste largement flou est la contribution de la fraction cellulaire de BM à ses qualités antivirales.
Beaucoup d'Abs facilitent une variété d'activités antivirales médiées par la région « constante » de la molécule d'immunoglobuline, le fragment cristallin (Fc), par l'intermédiaire de l'interaction avec des récepteurs de Fc (FcRs) trouvés sur pratiquement toutes les cellules immunitaires innées, pratiquement toutes qui se trouvent dans l'humain BM24. La phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) a été démontrée comme nécessaire pour le dégagement des infections virales et a été sous-étudiée dans le cas de la prévention du MTCT du VIH25,26,27, 28 Annonces , 29. Étant donné le manque de connaissances sur la contribution potentielle de l'activité ADCP par les phagocytes BM à la prévention du TMT du VIH, nous avons cherché à mettre au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules de la BM humaine afin d'entreprendre une étude de l'ADCP BM obtenu à divers stades de lactation.

<table><tbody><tr><td>1 et micro ; m FluoSpheres Microsphères marquées aux neutravidines&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Souris Anti-Humain CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning V-bottom polystyrène 96 puits plaque&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de biotine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubes coniques à centrifuger</td><td>Corning&nbsp ;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Teinture de viabilité fixable 450&nbsp ;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>252549&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sans calcium, magnésium ou phénol Red</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task</td><td>Wipers Kimberly-Clark Professional&nbsp ;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x Thermo</td><td>Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrène 10 mL Pipettes sérologiques</td> pH 7,4<td>Corning&nbsp ;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateurs de protéines PES, 3K MWCO, 0,5 mL</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de vih

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Même en l'absence de médicaments antirétroviraux, seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur du lait maternel (BM). À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour réduire la transmission de La BM. Les nourrissons allaités ingèrent par jour 105à 108 leucocytes maternels, bien que ce qui reste largement incertain, c'est la contribution de ces cellules aux qualités antivirales de la BM. Actuellement, nous avons cherché à isoler les cellules de la BM humaine afin de mesurer phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'une des réponses immunitaires innées les plus essentielles et les plus répandues, par les phagocytes BM contre les cibles du VIH. Des cellules ont été isolées de 5 échantillons humains de BM obtenus à divers stades de lactation. L'isolement a été effectué par centrifugation douce suivie d'une élimination soigneuse de la graisse de lait et le lavage répété de la pastille cellulaire. Les perles fluorescentes recouvertes d'épitope de l'enveloppe du VIH (Env) ont été utilisées comme cibles pour l'analyse du PCAA. Des cellules ont été souillées avec le marqueur de surface CD45 pour identifier des leucocytes. On a constaté que l'activité de l'ADCP était significative au-dessus des expériences de contrôle et reproductiblement mesurable à l'aide d'un anticorps spécifique au VIH 830A.

Le lait peut être conservé à température ambiante ou plus frais (mais non congelé); cependant, étant donné que nous avons observé une viabilité réduite lorsque le lait a été gardé très froid (données non montrées), et qu'il est plus simple de recueillir, de stocker brièvement et de transporter à des températures ambiantes, il est recommandé que les échantillons ne soient pas réfrigérés afin de réduire variabilité d'échantillon à échantillon. Dans le lait obtenu 7 à 183 jours après le part...

Le lait maternel transmet le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l'isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Nous avons mis au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules du lait maternel humain afin d’étudier la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps, ou ADCP, par phagocytes de lait maternel contre les cibles du VIH. Cette technique facilite l’isolement relativement rapide et facile des cellules du lait maternel afin d’évaluer la capacité des populations de leucocytes à effectuer l’ADCP. Alisa Fox, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure.Après avoir sélectionné un antigène cible pertinent, utilisez un kit commercial pour biotinylate la protéine d’intérêt selon le protocole du fabricant. Et déposez l’échantillon biotinylé dans la chambre haute d’une colonne de spin. Ajouter pbs jusqu’à 400 microlitres et capuchon de la chambre avant d’insérer la colonne dans un tube de collecte pour centrifugation.Après avoir jeté le flux à travers, ajouter PBS à 400 microlitres pour une deuxième centrifugation. Jetez le flux à travers, ajouter PBS à 400 microlitres, et mesurer la concentration de protéines par un spectrophotomètre pour conjuguer la protéine biotinylated aux microsphériques micromètres. Incuber six microgrammes de protéines avec 12 microlitres de perles de stock dans 200 microlitres de PBS par plaque de perles conjuguées à température ambiante pendant deux heures, avec vortex doux toutes les 20 minutes.À la fin de l’incubation, granuler les perles conjuguées par centrifugation et jeter le supernatant. Après un léger vortex, resuspendez la protéine en 1200 microlitres de 0,1%BSA dans PBS, et lavez le tube par centrifugation deux fois de plus comme cela vient de le démontrer. Après le dernier lavage, resuspendez la pastille en 1200 microlitres dans PBS plus BSA.Pour mettre en place des plaques d’analyse ADCP, préparez d’abord 12 dilutions microlitres d’anticorps, ou le sérum immunitaire d’intérêt, dans 2%BSA dans PBS dans une plaque ronde de puits de 96 bas. Ajouter 10 microlitres de perles conjuguées par puits à l’assiette pendant une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 200 microlitres de PBS plus BSA.Après avoir obtenu du lait maternel humain auprès de femmes allaitantes en bonne santé exprimant à l’aide d’une pompe, dans les quatre heures suivant l’expression séparer le contenu du lait par centrifugation et verser soigneusement le lait écrémé et la graisse, laissant la pastille cellulaire intacte. Essuyer l’intérieur du tube avec un lingette sans peluche pour enlever toute la graisse de la paroi du tube et ajouter 10 millilitres de PBS plus HSA. Resuspendez la pastille avec un tuyautage doux pour éviter l’activation cellulaire dans l’apoptose, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation.Après un deuxième lavage dans PBS plus HSA comme juste démontré, résuspendez doucement les cellules dans un à deux millilitres de PBS frais plus HSA pour compter. Pour un essai ADCP, inversez rapidement la plaque ADCP préparée pour décanter le supernatant après la centrifugation finale et ajoutez cinq fois 10 à une quatrième cellule de lait maternel fraîchement isolée dans 200 microlitres de PBS plus BSA pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, centrifuger les cellules et laver les granulés deux fois dans 200 microlitres de PBS frais comme démontré.Après le dernier lavage, tacher les cellules avec 0,5 microgramme par millilitre de tache fixable de viabilité 450 par puits dans 50 microlitres de PBS pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, pelleter les cellules pendant deux lavages dans pbs frais comme démontré, et tacher les cellules pour les marqueurs leucocytes d’intérêt pendant 30 minutes à température ambiante, protégé de la lumière. À la fin de l’incubation, recueillir la centrifugation des cellules, et laver les cellules deux fois dans 200 microlitres de 1%BSA plus PBS par lavage.Après le dernier lavage, fixer les granulés dans 200 microlitres de 0,5% de formaldéhyde par puits pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pour l’analyse cytométrique de flux des échantillons de cellules, réglez un cytomètre d’écoulement équipé d’un lecteur de plaque à haut débit pour retirer 175 microlitres d’échantillon et recueillir 5000 cellules par puits. Effectuez le gating initial pour éliminer les doublets et les débris sur une parcelle de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de dispersion latérale.Utilisez une parcelle de tache de dispersion latérale par rapport à la viabilité pour éliminer les cellules mortes. Et utilisez une parcelle latérale scatter versus CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes. Pour toutes les cellules positives CD45, ou pour chaque sous-ensemble de leucocytes d’intérêt, mesurez l’activité de phagocytose cellulaire dépendante de l’anticorps en çant avec un marqueur sur les cellules positives de perle dans un histogramme du canal fluorophore approprié pour les perles conjuguées.Calculez ensuite les scores de phagocytose cellulaire dépendante de l’anticorps comme médiane de l’intensité de fluorescence des cellules positives de perle par le pourcentage du CD45 total plus les cellules dans la population positive. Ici, la stratégie de gating pour éliminer des doublets, des débris, et des cellules mortes est montrée. Entre un et 12 % du total des cellules vivantes sont généralement des leucocytes positifs CD45, la plupart des prétendus ltéraux se dispersant faiblement à intermédiaire CD45 faibles monocytes semblant être des précurseurs, ou à des cellules immatures, basées sur la dispersion latérale par rapport au Gating CD45.Les prétendus granulocytes sont définis comme des cellules intermédiaires CD45 de dispersion latérale élevée. La mesure de l’activité ADCP des cellules du lait maternel fraîchement isolées à l’aide d’un anticorps monoclonal humain spécifique au VIH à un mois après le départ révèle que le traitement par inhibiteur de l’actine Cytochalasine D et ou récepteur Fc bloquant les anticorps avant l’incubation avec des perles couplées liées à l’anticorps entraîne une activité ADCP à ou en dessous de celle observée en présence d’anticorps témoins. Le score ADCP déterminé pour le total des cellules positives CD45 est généralement entre 25 et 35 fois au-dessus des niveaux de fond, défini à l’aide d’un contrôle négatif, anticorps monoclonal anti-anthrax.Chaque échantillon de lait maternel est unique et certaines granulés peuvent être difficiles à voir. En outre, les populations de leucocytes, et donc les scores ADCP, peuvent varier énormément d’un échantillon à l’autre.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des lymphocytes B du sang périphérique humain à l’aide d’anticorps biotinylés spécifiques des lymphocytes non B et de microbilles magnétiques conjuguées à la streptavidine.

Isolement et purification des lymphocytes B du sang périphérique humain

Cette vidéo présente un test permettant de mesurer la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) par les phagocytes du lait maternel. Des microsphères marquées par fluorescence, conjuguées à un complexe antigène-anticorps, sont combinées à une suspension cellulaire isolée du lait maternel pour induire une phagocytose cellulaire dépendante des anticorps par les leucocytes phagocytaires. Lors du marquage des cellules avec des anticorps contre l’antigène leucocytaire commun (CD45), la...

Un test in vitro pour mesurer la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps par les phagocytes

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Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

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Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.

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Apprenez à isoler les leucocytes du lait maternel humain pour étudier la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps contre le VIH. Cette méthode permet d'évaluer la capacité phagocytaire des cellules immunitaires maternelles.

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

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