Préparation moyenne pour la culture de micro-organismes dans des conditions strictement anaérobies/anoxiques

Contrairement aux organismes aérobies, les micro-organismes strictement anaérobies nécessitent l’absence d’oxygène. Comme l’oxygène est omniprésent dans l’air, le maintien de conditions sans oxygène pendant la culture est une condition préalable à la culture anaérobie. La technique appliquée représente une méthode simple et peu coûteuse pour fournir des conditions anoxiques pour cultiver une population microbienne mixte dans la culture liquide.

Cette technique peut également être appliquée pour la culture de cultures pures. Cependant, pour les micro-organismes très sensibles à l’oxygène, cette procédure pourrait ne pas être applicable. Commencez par peser les ingrédients moyens dans un flacon approprié et dissolvez-les avec un demi-volume d’eau distillée.

Ensuite, ajoutez millilitre d’indicateur REDOX, suivi de vitamines dans la solution d’élément trace. Ajustez le pH en fonction des besoins de l’organisme, et porter le volume final à 1 litre avec de l’eau distillée. La couleur de l’indicateur REDOX dépend du pH et peut nécessiter un certain temps d’ajustement.

Remplissez les flacons de sérum de 120 millilitres de 50 millilitres de milieu, puis incubez-les dans un bain d’eau de 100 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes, afin de réduire la solubilité de l’oxygène dans la phase liquide. Rincer l’espace de la tête avec de l’azote. Prenez soin de la ventilation appropriée de la pièce lorsque vous travaillez avec de l’azote.

Fermez les flacons avec du septa en caoutchouc butyle et fixez les bouchons d’aluminium. Ensuite, ajoutez 0,1 millilitres d’agent réducteur à chaque flacon, afin de réduire davantage le potentiel REDOX. Et autoclave les flacons pendant 20 minutes à 121 degrés Celsius.

Un autoclave certifié pour la stérilisation des navires fermés doit être utilisé lors de l’application de ce protocole. Dans le cas contraire, la surpression dérivée de l’augmentation de la température pourrait provoquer l’explosion des flacons sériques. Pour préparer l’inoculum à partir d’un digesteur anaérobie, ajouter 400 millilitres d’eau distillée à un flacon et porter à ébullition.

Refroidissez-le jusqu’à environ 30 degrés Celsius tout en rinçant de façon permanente l’espace de la tête avec de l’azote. Ajouter environ 100 grammes de boues, dérivées d’un digesteur anaérobie, en s’assurant d’enregistrer la masse exacte de la boue pour déterminer la dilution. Échangez l’espace de la tête du flacon avec de l’azote et fermez-le avec un septum en caoutchouc butyle.

Agiter le flacon pendant 30 minutes à 120 rPM. Laissez sédimenter les particules de boue plus grosses, puis utilisez une seringue et une canule pour enlever 5 millilitres d’inoculum et injectez-les dans un flacon de sérum préparé précédemment. Incuber le flacon de sérum inoculé à une température appropriée pour l’expérience, en s’assurant de drainer la pression sur causée par l’augmentation de la température, environ 15 à 30 minutes après le début de l’incubation.

Pour évaluer la production et la composition du biogaz pendant la période d’incubation, enregistrez la pression atmosphérique actuelle et préparez un manomètre pour évaluer la pression à l’intérieur du flacon. Secouez les flacons et retirez 1 millilitre de gaz de l’espace de la tête à l’aide de la seringue et de la canule. Mesurer la concentration d’hydrogène, d’oxygène, de méthane et de dioxyde de carbone à l’aide de la chromatographie gazeuse.

Utilisez 1 millilitre de liquide de la fiole pour surveiller les concentrations de tous les acides gras grands, selon les instructions manuscrites, et égoutter les flacons sur la pression après l’avoir retourné à la température appropriée. Ce protocole a été utilisé pour créer des bioréacteurs miniatures effectuant des digestions anaérobies. Tryptophane, tyrosine, phénylalanine, extrait de viande et caséine ont été ajoutés à 3 concentrations différentes, et la production de méthane a été surveillée sur une période d’incubation de 28 jours.

Les méthanogènes ont été visualisés en rayonnant la co-enzyme F420, qui est un porteur d’électrons dans la méthanogenèse, et présente une fluorescence bleu-vert avec un maximum d’absorption à 420 nanomètres. Parallèlement à l’analyse du gaz, des échantillons ont été analysés pour les concentrations volatiles d’acides gras et d’acides phényles pendant la période d’incubation. Les méthodes biologiques moléculaires ciblant l’abondance de micro-organismes spécifiques et/ou la composition de la communauté microbienne, à un certain moment de l’expérience, peuvent être appliquées à l’aide de la procédure décrite.