Name: Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur dévolution microfluidique pour lobservation en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez la technologie microfluidique cancer-on-chip pour étudier la dynamique tumorale en temps réel au niveau cellulaire. Cette méthode permet de contrôler les populations mixtes et d'évaluer la morphologie, la motilité et la migration des cellules cancéreuses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par NSF PHY-1659940.

1. Fabrication d'un dispositif microfluidique
<ol><li>Générer le modèle microfluidique souhaité à l'aide d'un logiciel de conception de mise en page (voir Matériaux supplémentaires).</li>
	<li>Fabriquez le photomasque. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.<ol>
<li>Utilisant un auteur de laser, écrivez le modèle sur une plaque en verre de soude-lime enduite de 100 nm de Cr et 500 nm de photoresist AZ1518.</li>
		<li>Développer le photoresist avec le développeur AZ300MIF pour 60 s.</li>
		<li>Etch loin le chrome sans protection contre le photoresist à l'aide cr-7 Chromium Etchant.</li>
		<li>Dénuder le photoresist résiduel à l'aide d'une décapante photorésistante à 70 oC pendant 45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Modèle de la photoresist. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.<ol>
<li>Spin coat HMDS sur plaquette de silicium à 4000 tr/min pour 40 s.</li>
		<li>Spin coat photoresist AZ4330 sur plaquette de silicium à 4000 tr/min pour 40 s.</li>
		<li>Cuire doucement la plaquette de silicium à 95 oC pour 60 s.</li>
		<li>Utilisez l'aligneur de masque pour exposer les UV à la plaquette de silicium.</li>
		<li>Développer le photoresist avec le développeur AZ300MIF pour 4 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer la gravure DRIE. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.<ol>
<li>Sécher la plaquette modelée avec le photoresist à l'aide d'un système de gravure à ion réactif profond de silicium (DRIE) pour 100 m de profondeur.</li>
		<li>Dénuder le photoresist avec de l'acétone et de l'équaire de plasma avec un écheron à plasma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oxydation et silanisation des gaufrettes. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.<ol>
<li>Effectuer l'oxydation thermique sur la plaquette de silicium gravée dans un four à 1100 oC pendant 1 h.</li>
		<li>Attendez que la plaquette de silicium refroidisse, puis placez la plaquette dans un dessiccateur avec quelques gouttes de trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) égouttédans dans un petit récipient près de la plaquette.</li>
		<li>Pomper la pression du dessiccateur à 0,5 atm à température ambiante pendant 60 min. Le moule de gaufrette de silicium devrait devenir hydrophobe après la silanisation appropriée, qui peut être examinée en ajoutant plusieurs gouttelettes d'eau sur la plaquette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lithographie douce. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.<ol>
<li>Mélanger le kit pré-polymère et cross-linker (à partir du kit de polyméthylsiloxane (PDMS) à un rapport de 10:1 par poids.</li>
		<li>Verser le PDMS mélangé pour créer un film de 10 mm de hauteur sur le moule silanisé de plaquette de silicium.</li>
		<li>Décorez le système de gaufrettes PDMS-silicium qui en résulte dans un dessiccateur de 30 min à 1 h.</li>
		<li>Incuber la plaquette de silicium PDMS dans un incubateur de 70 oC pendant la nuit pour guérir le PDMS.</li>
		<li>Une fois que le PDMS est guéri, épluchez soigneusement le film PDMS de la plaquette de silicium.</li>
		<li>À l'aide d'aiguilles de biopsie, percer des trous dans les ports d'entrée en fonction de l'emplacement du motif sur le PDMS et utiliser un poinçon circulaire pour couper des copeaux de 27 mm de diamètre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liaison de couche PDMS.<ol>
<li>Traitement de la chaleur deux piles de 27 mm pDMS cylindres (sans motifs), qui deviendra la couche réservoir et la couche de plafonnement de l'appareil.</li>
		<li>Découpez deux cercles de 7 mm autour des bras de mer sur la couche du réservoir et utilisez une aiguille de biopsie pour percer les trous dans les ports d'entrée de la couche de plafonnement.</li>
		<li>Associez trois piles de PDMS (pile à motifs, couche réservoir, couche de plafonnement) avec un traitement plasmatique à l'oxygène.</li>
		<li>Avec l'aiguille de biopsie, percer les trous aux prises et au port central de l'appareil.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation des médias et des lignes cellulaires
<ol><li>Préparer les médias pour la culture des lignées cellulaires PC3, y compris PC3-EMT et PC3-EPI: mélanger RPMI 1640 milieu avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1x antibiotique-antimycotique. Générer des lignées cellulaires comme décrit précédemment14. REMARQUE : Les lignées cellulaires PC3 sont maintenues dans les milieux ci-dessus dans des incubateurs humidifiés à 37 oC avec 5 % de CO2. Cellules divisées et sous-culture tous les 3 jours, avant qu'elles n'atteignent 100% de confluence.</li>
	<li>Lignes de cellules transfect avec des marqueurs fluorescents cytoplasmiques marqués pour une meilleure visualisation, comme décrit précédemment12, tel que PC3-EMT exprime GFP cytoplasmique et PC3-EPI exprime mCherry cytoplasmique. Notez que la technologie est également compatible avec toutes les cellules fluorescentes ainsi que l'imagerie brightfield de cellules non étiquetées.</li>
</ol>3. Configuration expérimentale
<ol><li>Fabrication du support de plaque en métal<ol>
<li>Fabriquer un porte-plaque qui est suffisant pour contenir simultanément des plats de culture perméables au gaz pour des expériences parallèles par l'usinage ou l'impression 3D. Le fichier CAO 3D ("3-bien plaque. FCStd") peut être trouvé sur GitHub comme référence (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Dévisser les composants du support (Figure 2) avec un tournevis. Désinfecter les composants par exposition aux UV pendant au moins 1 h et laisser dans un environnement stérile. REMARQUE : Le support est conçu pour fournir des conditions substantielles pour l'équilibre thermique et les compositions idéales de gaz, avec des entrées de canal de gaz qui permettent le flux d'air. Plus de détails peuvent être trouvés dans notre travail précédent12.</li>
		<li>Préparez jusqu'à trois plats de culture perméables au gaz, dont la membrane de culture cellulaire est relativement flexible.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensemencement de ligne de cellules<ol>
<li>24 heures avant le début de l'expérience, récolter les cellules PC3-EPI et PC3-EMT par trypsinisation pendant 5 min. Ajouter les supports de culture préchauffés, puis centrifuger à 150 x g pendant 3 min et jeter le supernatant.</li>
		<li>Compter les cellules de chaque PC3-EPI et PC3-EMT à l'aide d'un hémocytomètre et isoler un total de 2,5 x 104 de chaque type de cellule pour chaque plat de culture perméable au gaz.</li>
		<li>Mélanger et resuspendre les deux types de cellules dans 2 ml de culture et semer les cellules dans chacun des plats de culture perméables au gaz.</li>
		<li>Laisser le support entier de plaque dans l'incubateur pendant la nuit pour que les cellules se fixent.</li>
		<li>Désinfecter les dispositifs PDMS par exposition aux UV pendant au moins 1 h et laisser dans un environnement stérile.</li>
	</ol></li>
	<li>Mise en place d'une unité de contrôle thermique et d'un système d'approvisionnement en gaz<ol>
<li>Comme le montre la figure 3, mettre en place un système d'approvisionnement en gaz qui se compose à la fois d'unités de contrôle CO2 et O2, d'une pompe à essence, d'une chambre de mélange de gaz, d'un humidificateur ou d'un bulleur, et de trois ensembles distincts de soupapes de gaz et de jauges de pression. Plus de détails peuvent être trouvés dans notre travail précédent12.</li>
		<li>Mettre en place les unités de contrôle CO2 et O2 de telle sorte qu'elles ajustent le taux de mélange du gaz des réservoirs DE CO2 et N2 et de la source O2. Alternativement, tout système d'approvisionnement en gaz qui fournit du gaz en état de normoxie fonctionnerait.</li>
		<li>Assurez-vous que le gaz qui est combiné dans la chambre de mélange et humidifié par un bulleur de sorte que l'humidité relative est augmentée jusqu'à 85% (comme lu à partir d'un moniteur d'humidité relative) et que le gaz conduit à trois vannes de gaz indépendantes avec des jauges de pression afin de contrôler et surveiller le débit de gaz dans le porte-plaque.</li>
		<li>Placer le support entier de la plaque dans une unité de contrôle thermique d'incubation sur scène avec des sous-unités de chauffage séparées pour le couvercle et la plaque inférieure, toutes les unités étant fixées à 37 oC. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.</li>
	</ol></li>
	<li>Installation d'un dispositif microfluidique. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.<ol>
<li>Identifier que les composants détaillés du porte-plaque à 3 puits sont en ordre, comme dans la figure 2. Chacun des trois puits est identique et indépendant, avec une paire de canaux de gaz pour chaque puits. Chaque puits possède un porte-plat de culture perméable au gaz, un porte-puces PDMS, un porte-fenêtre en verre et une paire de fenêtres en verre de 35 mm. Ces composants peuvent être assemblés à l'aide des vis ajustées. REMARQUE : Les vitres s'assurent qu'il y a un espace thermiquement isolé entre la membrane de culture perméable au gaz et le puits de sorte qu'aucune condensation d'eau ne se produise en raison des différences de température à l'interface. Notez que les 3 puits sont indépendants, et 3 expériences peuvent être faites séparément.</li>
		<li>Pré-chauffer le milieu de culture à 37 oC et les dégazer dans une chambre à vide pendant 20 min.</li>
		<li>Traiter les puces PDMS à l'aide d'un système plasma d'oxygène pour 30 s afin de maintenir l'hydrophilie.</li>
		<li>Configurez le système de seringues. Chargez lentement deux seringues avec des supports de croissance et deux autres seringues avec le réactif d'intérêt désiré (médias, médias avec la drogue, etc.). Connectez chaque seringue individuelle à un tube de 50 cm (0,020 po x 0,060 po) par une aiguille distributrice de 23 G dans une goupille en acier creux. Insérer une goupille creuse en acier à l'autre extrémité du tube.</li>
		<li>Primer le tube et insérer la goupille d'acier dans chaque puce PDMS à travers la couche de plafonnement. Remplissez la couche réservoir et mouillez le modèle de couche PDMS avec des supports. La couche de réservoir fonctionne comme un piège à bulles sur puce pour empêcher les bulles d'air d'entrer dans le modèle microfluidique.</li>
		<li>Chargez une seringue de 1 ml avec des supports culturels. Connectez la seringue à un tube de 5 cm (0,020 po x 0,060 po) par une aiguille distributrice de 23 G dans une goupille en acier creux. Insérez une goupille creuse en acier à l'autre extrémité du tube et amorcez le tube.</li>
		<li>Insérez la goupille creuse en acier dans le trou central de la puce, où un support excessif peut être extrait de la puce plus tard pendant le processus d'étanchéité des copeaux.</li>
		<li>Comme chaque appareil PDMS nécessite quatre seringues de 10 ml chargées sur une pompe à seringues, chargez deux seringues de 10 ml par puce dans le pont avant. Placez les deux autres seringues dans le pont de retrait du système de seringues.</li>
		<li>Placez la puce directement sur les membranes de culture perméables au gaz (avec des cellules déjà adhérées aux membranes). Afin d'éviter d'piéger les microbulles dans le modèle microfluidique, distribuez 1 ml de support préchauffé et dégazé dans le plat de culture perméable au gaz de 35 mm avant l'assemblage, puis assurez-vous que la puce s'approche de la surface liquide avec un angle d'inclinaison de 15 degrés.</li>
		<li>Clamp le plat de culture perméable au gaz et le puits dans le porte-vaisselle de culture perméable au gaz pour chaque puce, avec le support de puce PDMS poussant le dispositif PDMS vers le bas.</li>
		<li>Collez une feuille d'un scelleur sur le dessus de l'appareil PDMS et pincez-la avec le support de la puce PDMS afin d'empêcher la puce de se dessécher.</li>
		<li>Définir le débit des médias autour du tableau pour qu'il soit de 20 l/h.</li>
		<li>Placez la plaque entière dans l'incubateur sur scène sur le stade motorisé d'un microscope inversé. Connectez le système d'approvisionnement en gaz aux canaux de gaz et pressurisez la membrane de culture perméable au gaz contre la puce PDMS installée pour assurer l'étanchéité de l'appareil. Maintenir la pression de la jauge à 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).</li>
		<li>Extraire lentement les milieuis excessifs dans la puce à l'aide de la seringue de 1 ml du trou central. Observez la puce sous le microscope tout en extrayant le support, puis arrêtez d'extraire lorsque la puce est scellée. L'étanchéité des copeaux devrait être évidente puisqu'une partie des cellules serait écrasée par les microstructures.</li>
		<li>Connectez l'unité de détection de température de l'incubateur sur scène à la plaque de 3 puits et fixez-la à 37 oC.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imagerie en accéléré à cellule unique
<ol><li>Configurez un logiciel d'imagerie utilisant un microscope inversé pour l'acquisition d'images en time-lapse. Notez qu'un microscope fluorescent inversé avec stade x-y entièrement motorisé, bouton de mise au point, obturateur et cubes de filtre est nécessaire pour une expérience EA.</li>
	<li>Configurer un logiciel pour acquérir des images sur deux canaux à 10x grossissement pour chaque puce avec l'image automatique de couture après un tour de mise au point automatique. Sachez que les systèmes de correction automatique comme Perfect Focus ne garantissent pas une qualité d'image satisfaisante. Il est plus recommandé de générer une surface de mise au point personnalisée pour l'acquisition d'images à long terme basée sur l'autofocus ou la mise au point manuelle à travers la puce.</li>
	<li>Prenez des images toutes les heures et laissez l'expérience se dérouler sur l'échelle de temps des semaines. Surveillez la qualité de l'image sur une base quotidienne et mettez à jour la surface de mise au point si nécessaire.</li>
	<li>Préparer la puce PDMS et le plat de culture perméable au gaz pour l'analyse immunofluorescente ultérieure, comme décrit précédemment13.</li>
</ol>5. Traitement et analyse d'images
<ol><li>Traitement post-expérimental<ol>
<li>Convertir les images en format TIFF pour le traitement et les mesures d'images en utilisant Fidji/ImageJ.</li>
		<li>Compresser les fichiers TIFF pour faciliter le traitement d'images.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse Fidji/ImageJ<ol>
<li>Pour identifier les cellules, effectuez l'analyse de soustraction et de particules de fond pour identifier les points lumineux fluorescents pour la détection de localisation cellulaire et le comptage automatique des cellules.</li>
		<li>Utilisez des plugins (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) pour analyser la motilité cellulaire et la migration.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li>
<li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue%3A+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li>
<li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214(2012).</li>
<li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142(2015).</li>
<li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li>
<li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine%3A+From+chip+to+the+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li>
<li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li>
<li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Convergent+Science+Physical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001(2017).</li>
<li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid%2C+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li>
<li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trackmate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine%3A+From+chip+to+the+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li>
<li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cambridge+Quarterly+of+Healthcare+Ethics%22%5BJournal%5D)">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li>
<li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+in+vitro+microvessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li>
<li>Zañudo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002(2017).</li>
</ol>

Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.

La culture cellulaire conventionnelle a été développée il y a près d'un siècle et demeure le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé dans la recherche biomédicale, malgré sa capacité limitée prouvée de prédire les résultats cliniques dans le cancer17. Les modèles animaux offrent la plus grande pertinence physiologique et la similitude génétique raisonnable avec les humains, mais ont longtemps été reconnus pour avoir des limites significatives dans la prévision des résultats humains<sup clas...

Le cancer est de plus en plus reconnu comme un écosystème complexe qui dépend non seulement de la dysrégulation continue des populations de cellules mutées, mais aussi des interactions vitales entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement hôte. En ce sens, le cancer évolue sur un paysage adaptatif qui se manifeste par une combinaison de facteurs, y compris un microenvironnement tumoral hétérogène et un crosstalk avec une variété de cellules hôtes, qui contribuent toutes à des pressions sélectives pour d'autres changements épigénétiques1,2,3. Dans le contexte des tumeurs solides, la distribution inégale des produits chimiothérapeutiques et d'autres gradients de ressources contribue à leur hétérogénéité moléculaire et peut jouer un rôle dans le développement de la résistance aux médicaments, augmentation de l'angiogenèse à une tumeur particulière sous-populations, et même métastasis4,5,6. Les études conventionnelles de culture cellulaire 2D in vitro, tout en possédant une capacité expérimentale pratique à grande échelle, fournissent des conditions de champ moyen, uniformes et fixes, souvent dépourvues du contrôle environnemental spatial et temporel précis nécessaire pour imiter la dynamique tumorale in vivo. Ainsi, il est nécessaire de modèles ex vivo plus représentatifs pour reproduire le microenvironnement tumoral avant les modèles animaux dans le pipeline de développement de médicaments afin d'une meilleure prédiction de la progression du cancer ainsi que des réponses aux médicaments dans le stress dynamique Paysages. Des microfluidiques ont été proposés pour combler l'écart entre les études de culture cellulaire 2D et les études animales in vivo plus complexes qui pourraient ne pas être en mesure de soutenir les études quantitatives contrôlables7,8,9.
Un système in vitro idéal pour caractériser la dynamique des cellules cancéreuses devrait posséder la capacité de générer un microenvironnement hétérogène pour imiter les réponses cellulaires adaptatives qui peuvent avoir lieu dans une tumeur, ainsi que permettre l'observation de ces dynamiques à un résolution unicellulaire. Dans cet article, nous décrivons une plate-forme de culture cellulaire microfluidique, un dispositif basé sur le PDMS appelé « accélérateur d'évolution » (EA), qui permet des études in vitro parallèles de la dynamique des cellules cancéreuses à la résolution cellulaire avec l'acquisition de données en temps réel sur le cours de semaines, tout en maintenant de façon stable des gradients de stress à travers le paysage culturel. La conception de cette plate-forme est basée sur nos travaux précédents, dans lesquels la dynamique évolutive des organismes dans une métapopulation peut être accélérée10,11. Plus précisément, dans un groupe de populations spatialement séparées qui interagissent à un certain niveau, lorsqu'elles sont exposées à un paysage de stress hétérogène, les espèces les plus aptes peuvent dominer plus rapidement dans une population locale que celle d'une grande population uniforme. Les espèces avantageuses migrent ensuite vers les microhabitats voisins à la recherche de ressources et d'espace, et finissent par dominer toute la population. Comme le montre la figure 1, le modèle de la puce EA microfluidique est composé de (i) une paire de canaux serpentins qui fournissent une circulation médiatique fraîche et construisent des conditions limites fixes pour la diffusion chimique, et (ii) la région de culture cellulaire hexagonale qui se compose de 109 chambres hexagonales interconnectées et 24 chambres semi-hexagonales au centre, ressemblant à une structure en nid d'abeilles. La puce est de 100 m de profondeur. Les canaux médiatiques et la région de la culture cellulaire sont reliés à de petites fentes (environ 15 m de large), qui empêchent le flux direct des médias et le stress de cisaillement qui en résulte dans la zone de culture cellulaire, tout en permettant aux produits chimiques de se diffuser à travers de petites fentes et d'échanger des nutriments, déchets métaboliques, etc. La génération de gradients chimiques est démontrée dans la figure 1B, où un canal média contient 0,1 mM de fluorescéine tandis que l'autre canal est exempt de fluorescéine. Les cellules sont cultivées sur une membrane perméable au gaz, encapsulées par les microstructures par la pression arrière positive sur la membrane contre la puce. Les composants du support de l'appareil sont illustrés dans la figure 2, et la configuration expérimentale est illustrée dans la figure 3, où la culture est maintenue sur un microscope inversé à 37 oC, avec une humidité relative supérieure à 85 %, et conditionnée sous composition du gaz normoxia.
Ce système fournit une observation détaillée des interactions cellulaires localisées par l'intermédiaire de canaux lumineux et fluorescents et permet des essais en aval résolus spatialement tels que l'immunofluorescence, la tache occidentale, ou la spectrométrie de masse. Nous avons déjà démontré comme preuve de principe de ce modèle microfluidique de cancer-sur-puce sur la co-culture à long terme des cellules cancéreuses de la prostate de PC3 épithélial et mésenchymal12 aussi bien que l'émergence du géant polyploïde de drogue-résistance cellules cancéreuses utilisant la lignée cellulaire épithéliale PC313. Tandis que nous présentons l'application de cette plate-forme pour comprendre la dynamique spatiotemporale des cellules épithéliales DE CANCER de la prostate et de la prostate mésenchymale sous un gradient de stress du docétaxel, le système microfluidique peut être facilement appliqué à n'importe quelle combinaison des lignées cellulaires et les gradients de ressources (c.-à-d. médicaments, nutriments, oxygène).

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Seringues à embout Luer-Lok</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x anti-anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>révélateur AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Cr Gravure au chrome</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66+</td><td>Photomask d’écriture</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Pour l’amélioration de l’adhérence de la photorésine</td></tr><tr><td>Broches creuses en acier</td><td>Nouveau Angleterre Petit Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp ;. 025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Système de chauffage, plaques multi-puits, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>Incubateur sur scène&nbsp ;</td></tr><tr><td>Aiguille de distribution Luer-Lok 23 G</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Pour connecter des seringues et des tubes</td></tr><tr><td>Lumox dish 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Boîte de culture cellulaire perméable aux gaz</td></tr><tr><td>Microposit Remover 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Microposit Remover 1165</td><td>Décapant photosensible</td></tr><tr><td>Microseal B Adhesive Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories MSB1001</td><td>Adhesive </td></tr> joint torique de scelleuse <tr><td>(pour l’étanchéité des plaques Lumox)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Dash No. 27 ; 1-5/16 » ID x 1-7/16 » OD ; Duro 70</td></tr><tr><td>Joint torique (pour l’étanchéité de la vitre inférieure)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Dash No. 20 ; 7/8 » ID x 1 » OD ; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Système de nettoyage/gravure au plasma</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Système plasma Plasma-Preen</td><td>Oxygen</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Système de gravure par ions réactifs</td></tr><tr><td>profonds Suss MA6 aligneur de masque</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td><td>Aligneur de masque&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Élastomère de silicone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Élastomère PDMS</td></tr><tr><td>TePla M4L Graveur plasma</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>Graveur plasma</td></tr><tr><td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Pour la silanisation des plaquettes de silicium</td></tr><tr><td>Tube microbore Tygon (0.020 » x 0.060"OD)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td>Tubes pour la diffusion multimédia</td></tr></tbody></table>

génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur d'évolution microfluidique pour l'observation en temps réel

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

La culture cellulaire conventionnelle demeure le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé, malgré sa capacité limitée prouvée de prédire les résultats cliniques dans le cancer. Des modèles microfluidiques de cancer sur puce ont été proposés pour combler le fossé entre les cultures 2D conventionnelles trop simplifiées et les modèles animaux plus compliqués, qui ont une capacité limitée de produire des résultats quantitatifs fiables et reproductibles. Ici, nous présentons un modèle microfluidique de cancer-sur-puce qui reproduit des composants clés d'un microenvironnement complexe de tumeur d'une manière complète, mais est assez simple pour fournir des descriptions quantitatives robustes de la dynamique de cancer. Ce modèle microfluidique de cancer-sur-puce, le « accélérateur d'évolution, » décompose une grande population de cellules cancéreuses dans un éventail interconnecté de microenvironnements de tumeur tout en générant un paysage hétérogène de stress chimiothérapeutique. La progression et la dynamique évolutive du cancer en réponse au gradient de drogue peuvent être surveillées pendant des semaines en temps réel, et de nombreuses expériences en aval peuvent être effectuées complémentaires aux images en time-lapse prises au cours des expériences.

Validation de la croissance cellulaire optimale sur puce L'un des principaux objectifs de la plate-forme expérimentale est de reproduire les composants clés et les interactions dans un microenvironnement tumoral complexe d'une manière globale, mais assez simple pour fournir des données quantitatives, fiables et reproductibles. Cet objectif ne peut être atteint que si nous avons le plein contrôle des facteurs environnementaux physiques et biochimiques. Nous devons soit ...

Nous présentons un modèle microfluidique de cancer sur puce, la technologie « Accélérateur d'évolution », qui fournit une plate-forme contrôlable pour des études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à une cellule unique niveau. Cette technologie devrait servir de modèle in vitro pour la recherche fondamentale ou le développement de médicaments précliniques.

Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur d'évolution microfluidique pour l'observation en temps réel

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Ce modèle microfluidique de cancer sur puce, que nous appelons l’accélérateur d’évolution, fournit une plate-forme contrôlable pour les études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à un seul niveau cellulaire. La technologie nous permet de sonder la dynamique évolutive du cancer dans un paysage de stress tumoral. Fournir de l’information, y compris la morphologie, la population, la motilité et la migration au fil du temps au niveau cellulaire.Avec la capacité de contrôler et de surveiller le comportement des populations mixtes de tumeurs sous des gradients de stress bien contrôlés notre technologie peut présenter un modèle plus physiologiquement pertinent pour le développement de médicaments précliniques. La méthode d’emballage d’étanchéité sous pression présentée peut également être mise en œuvre dans d’autres systèmes microfluidiques qui nécessitent un ajustement sophistiqué de la composition du gaz ambiant ainsi que de la capacité d’expérimentation en aval. Les clés pour mener à bien une expérience à long terme est de sécuriser un environnement physiquement et biochimiquement stable.Les facteurs, y

generation-heterogeneous-drug-gradients-across-cancer-populations-on

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous décrivons un protocole pour la microfabrication de l'appareil de gradient générant microfluidique qui peuvent générer des gradients spatiaux et temporels bien définis microenvironnement. Dans cette approche, l'appareil de gradient générant microfluidiques peuvent être utilisées pour étudier la migration cellulaire dirigée, l'embryogenèse, la cicatrisation, et les métastases du cancer.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

Nous présentons la procédure pour la fabrication et le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui recrée hétérogènes micro-environnements...

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

Nous décrivons un test de sensibilité aux médicaments à haut débit pour les cellules primaires du myélome multiple. Il s’agit d’une reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse (y compris la matrice extracellulaire et le stroma) dans des plaques multi-puits, et d’une méthode non invasive de quantification longitudinale de la viabilité cellulaire.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

Le contrôle des gradients chimiques et d’oxygène est essentiel pour les cultures cellulaires. Cet article fait état d’un dispositif microfluidique polydiméthylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) capable de générer de manière fiable des combinaisons de gradients chimiques et d’oxygène pour les études de migration cellulaire, qui peut être utilisé dans la pratique dans les laboratoires de biologie sans instrumentation sophistiquée.

Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d&#39;oxygène

Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires. Ce dispositif permet l’analyse des réponses cellulaires aux signaux solubles dans les microenvironnements 3D avec des gradients chimioattractant définis. Les organoïdes sont meilleurs que les cellules simples à la détection des faibles entrées bruyantes.

Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l'analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l'essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d'immunofluorescence et l'imagerie confocale, afin d'évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l'identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

Ce rapport décrit une méthode microfluidique basée sur la puce pour mettre en place une expérience de culture cellulaire unique dans laquelle l'appariement à haut rendement et l'analyse microscopique de plusieurs cellules individuelles peuvent être atteints.

Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique

Nous présentons un système microfluidique pour les études à haut débit sur les machines de vie complexes, qui se compose de 1500 unités de culture, une gamme de pompes périsaltiques améliorées et un module de mélange sur place. La puce microfluidique permet d’analyser in vivo les conditions micro-environnementales très complexes et dynamiques.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

L’hypoxie est une caractéristique du microenvironnement tumoral et joue un rôle crucial dans la progression du cancer. Cet article décrit le processus de fabrication d’un cancer-sur-une-puce hypoxique basé sur la technologie 3D d’impression cellulaire pour récapituler une pathologie hypoxie-connexe du cancer.

Cancer hypoxique sur puce imprimé par cellules 3D pour récapituler la progression pathologique du cancer solide

Découvrez la technologie microfluidique cancer-on-chip pour étudier la dynamique tumorale en temps réel au niveau cellulaire. Cette méthode permet de contrôler les populations mixtes et d'évaluer la morphologie, la motilité et la migration des cellules cancéreuses.

Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur dévolution microfluidique pour lobservation en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur d'évolution microfluidique pour l'observation en temps réel

Explorer plus de vidéos