Name: Résoudre leau, les protéines et les lipides dIn Vivo Confocal Raman Spectra de Stratum Corneum par une approche chimiométrique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Découvrez la spectroscopie Raman confocale pour analyser l'eau, les protéines et les lipides du stratum corneum humain. Cette méthode chimiométrique permet d'identifier et d'exclure les valeurs aberrantes spectrales avec résolution en profondeur.

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Les auteurs reconnaissent grandement le soutien financier du service d'analyse de la fonction corporative et du service de nettoyage personnel. Nous tenons à exprimer notre gratitude aux directeurs associés analytiques Mme Jasmine Wang et Dr Robb Gardner pour leurs conseils et leur soutien et à Mme Li Yang pour son aide sur la collecte de données.

Cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'Hôpital pour enfants de Beijing conformément aux lignes directrices éthiques de la Déclaration d'Helsinki de 1975. Il a été mené conformément aux lignes directrices du PCI pour les bonnes pratiques cliniques. L'étude a eu lieu de mai à juillet 2015.
1. Collection de spectres raman confocalininin in vivo de sujets humains avec la dermatite atopique
<ol><li>Inclure les sujets en conformité avec les critères suivants.<ol>
<li>Inclure les sujets âgés de 4 à 18 ans.</li>
		<li>Inclure les sujets présentant une dermatite atopique légère à modérée (score de 2 ou 3 selon l'évaluation globale du médecin) présentant des symptômes de maladie séfoisclée sur 5 à 30 % de la surface du corps, avec au moins deux lésions sur les bras.</li>
		<li>Inclure les sujets qui sont en bonne santé, à l'exclusion des symptômes directement liés à la maladie de la MA.</li>
		<li>Inclure les sujets qui donnent un consentement éclairé écrit.</li>
		<li>Inclure les sujets dont la valeur d'angle de topologie (ITA) est supérieure à 40 à l'emplacement de test.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exclure les sujets qui répondent à l'un des critères suivants.<ol>
<li>Exclure les sujets qui participent actuellement ou qui ont déjà participé à une étude clinique dans n'importe quel établissement d'essai au cours des quatre semaines précédentes.</li>
		<li>Exclure les sujets atteints de cancer ou qui ont été diagnostiqués ou traités pour un cancer dans les 5 ans précédant l'étude.</li>
		<li>Exclure les sujets diabétiques.</li>
		<li>Exclure les sujets qui ont une maladie immunologique ou infectieuse qui pourrait mettre le sujet à risque ou interférer avec l'exactitude des résultats de l'étude (c.-à-d. l'hépatite, la tuberculose, le VIH, le sida, le lupus ou la polyarthrite rhumatoïde).</li>
		<li>Exclure les sujets qui ont des conditions cutanées qui pourraient interférer avec les mesures instrumentales ou empêcher l'évaluation claire de la peau que de dermatite atopique. Les exemples incluent la peau extrêmement sèche, la peau endommagée, les coupures, les rayures, les coups de soleil, les taches de naissance, les tatouages, les cicatrices étendues, les éruptions cutanées, la croissance excessive de cheveux, ou l'acné.</li>
		<li>Exclure les sujets qui utilisent des médicaments immunosuppresseurs oraux, des antibiotiques ou d'autres thérapies systémiques au cours du dernier mois, à l'exception des tranquillisants mineurs.</li>
		<li>Exclure les sujets atteints d'autres affections médicales qui, de l'avis de l'enquêteur, les empêchent d'étudier.</li>
		<li>Exclure les sujets ayant une pigmentation plus élevée dans la zone d'essai.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étiqueter la zone de lésion du participant à l'étude de dermatite atopique et marquer avec une zone de 3 cm x 4 cm sur ou près du site de lésions comme indiqué dans la figure 1A.</li>
	<li>Étiqueter la zone de non-lésion avec le même marqueur dans le site du corps homologue (p. ex., avant-bras gauche vs avant-bras droit) comme le montre la figure 1B.</li>
	<li>Placez le site du corps marqué en contact étroit avec la fenêtre de l'instrument raman confocal in vivo comme le montre la figure 2A et la figure 2B. Couvrez toute la fenêtre pour éviter l'impact de la lumière de la pièce sur le site du corps.</li>
	<li>Effectuer la collecte de données Raman. REMARQUE : L'instrument a une résolution spectrale de 2 cm-1 et 50x d'objectif de microscopie (NA - 0,9 immersion d'huile), à l'aide d'un laser de 671 nm d'une puissance de 17 mW. La longueur d'onde est calibrée à l'aide du spectre d'une lampe au néon-argon intégrée. L'étalonnage de l'intensité se fait en mesurant le spectre d'une norme d'étalonnage du verre du NIST (National Institute of Standards).<ol>
<li>Déplacez la mise au point jusqu'à ce qu'un spectre tel qu'illustré dans la figure 2C soit observé, puis déplacez-la loin de la surface de la peau de 10 m.</li>
		<li>Démarrez la collecte de données pendant 26 étapes avec une taille d'étape de 2 m dans la région de fréquence de 2 510 cm-1à 4 000 cm-1. Utilisez un temps d'exposition de 1 s et mesurez huit répliques pour chaque zone d'une durée totale de 10 à 15 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Collection de spectres Raman confocals à partir de matériaux de référence
<ol><li>Placez les matériaux de référence, les principaux composants de la strate de peau humaine corneum19, sur la fenêtre de l'instrument raman confocal (voir Tableau des matériaux: Albumine de sérum bovin (BSA), eau déionisée (eau DI), céramide, cholestérol, libre l'acide gras et le squalène).</li>
	<li>Recueillir les spectres Raman des matériaux de référence consécutivement de l'extérieur du matériau au centre des matériaux en utilisant les mêmes paramètres de collecte que décrits ci-dessus.</li>
	<li>Intégrez la zone sous chaque spectre Raman entre la plage de 2 510 à 4 000 cm-1 et identifiez les trois principaux points de valeur maximale dans ces 26 mesures. Moyenne des spectres Raman à partir de ces trois points pour obtenir les spectres de matériau de référence final.</li>
</ol>3. Enlèvement des spectres aberrants par l'analyse chimiométrique
<ol><li>Déterminez la surface de la peau et enlevez les spectres hors de la peau.<ol>
<li>Modifiez l'extension de fichier de '.ric' à '.mat' et chargez le fichier .mat vers la plate-forme logicielle MATLAB.</li>
		<li>Corriger la ligne de base à l'aide de Baseline (Automatic Weighted Least Squares) en cliquant à droite sur l'ensemble de données importés sous Analyse . Autres outils (fr) Prétraitement dans le logiciel PLS-Toolbox avec paramètre par défaut.</li>
		<li>Résumez les valeurs entre 2 910 et 2 965 cm-1 pour obtenir les valeurs d'intensité sous chaque spectre Raman à partir des 26 étapes consécutives de mesure comme indiqué à la figure 3A via la fonction de somme dans MATLAB.</li>
		<li>Interpoler la valeur de compensation de l'instrument (valeur de l'axe X dans la figure 3B) de 26 à 260 en utilisant la fonction linspace dans MATLAB.</li>
		<li>Interpoler la valeur d'intensité de 26 à 260 en utilisant la méthode spline dans MATLAB, en tirant parti des 260 valeurs de position nouvellement générées.</li>
		<li>Utilisez les fonctions polyfit et polyval de MATLAB pour obtenir le nouvel ensemble de valeurs d'intensité avec 260 points. Tout d'abord, utilisez les 260 valeurs de position et d'intensité comme entrées X et Y pour la fonction polyfit, respectivement. Définir la valeur de degré à 20. Ensuite, utilisez les coefficients de sortie et les 260 valeurs de position étendues comme entrée pour polyval pour obtenir les valeurs finales d'intensité de 260.</li>
		<li>Utilisez les fonctions max et min de MATLAB pour identifier les points maximum et minimum des valeurs d'intensité nouvellement interpolées de 260.</li>
		<li>Calculez la valeur moyenne de l'intensité en divisant la somme de la valeur d'intensité maximale et minimale par deux.</li>
		<li>Identifiez la valeur d'intensité des 260 valeurs d'intensité (calculées à partir de l'étape 3.1.6) qui est la plus proche de la valeur d'intensité moyenne et fixez sa valeur de position correspondante en tant que surface de la peau. Définir cette valeur de position comme point zéro dans l'axe X comme l'illustre la figure 3B.</li>
		<li>Modifier toutes les autres valeurs de position en fonction du point zéro et de la taille d'étape connue de 2 m.</li>
		<li>Enlevez tous les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau en fonction de leur valeur de position.</li>
		<li>Importer le reste des données sur PLS-Toolbox pour créer un jeu de données et le renommer "RamanData.mat".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez les spectres aberrants avec l'effet de lumière de la pièce.<ol>
<li>Chargez le jeu de données spectre Raman (RamanData.mat) après l'élimination des spectres hors de peau et implémenter l'analyse PCA.</li>
		<li>Chargez le jeu de données dans le logiciel PLS-Toolbox sous la plate-forme MATLAB et cliquez à droite sur le jeu de données pour choisir Analyze. PCA.</li>
		<li>Sélectionnez Normaliser comme approche de prétraitement et choisissez None pour la validation croisée.</li>
		<li>Utiliser les trois composants pour l'analyse de décomposition de l'APC, comme le montre la figure 2 supplémentaire.</li>
		<li>Retirez le couvercle de la fenêtre de collecte de l'instrument Raman in vivo et collectez les spectres lumineux de la pièce dans la région à haute fréquence en utilisant les mêmes paramètres utilisés pour la collecte de données sur les matériaux de référence.</li>
		<li>Identifiez le facteur d'effet de lumière de la pièce par comparaison avec les spectres de fond lumineux de la pièce, comme le montre la figure supplémentaire 3.</li>
		<li>Supprimer les spectres avec une valeur de score correspondante significativement plus élevée que la normale (plus de 99,8% des valeurs de score de l'ensemble des données, soit 0,16 dans cette étude).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Sélection du nombre des composants dans l'analyse de décomposition MCR
<ol><li>Corriger la ligne de base des spectres Raman à l'aide de la même approche décrite ci-dessus (section 3.1.2).</li>
	<li>Effectuer l'analyse PCA sur le jeu de données prétraité tel que décrit ci-dessus (section 3.2) sauf pour sélectionner "PQN" - "Mean Center" plutôt que "Normaliser", et tracer les valeurs eigengiques à l'échelle logarithmique avec le nombre de composants (20) comme numéro par défaut dans l'analyse de décomposition en cliquant sur le bouton Sélectionner les composants et sélectionner le journal (eigenvalues) comme valeur Y. Choisissez trois à huit comme nombre de composants utilisés pour l'analyse MCR.</li>
	<li>Effectuer l'analyse MCR.<ol>
<li>Chargez le jeu de données dans le logiciel MCR-main20 via le bouton De sélection de données.</li>
		<li>Choisissez le nombre de composants (trois à huit) en cliquant sur la détermination du bouton nombre de composants.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton Pure sous l'onglet Estimation initiale, sélectionnez Concentration sous la direction de l'onglet sélection variable et cliquez sur le bouton Faire.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton OK, puis le bouton Continuer à la page suivante.</li>
		<li>Cliquez sur Continuer dans la page suivante, puis sélectionnez fnnls et 6 sous la mise en œuvre et Nr. des espèces avec des onglets de profils de non-négativité, respectivement. Cliquez sur le bouton Continuer.</li>
		<li>Choisissez les mêmes paramètres que la section 4.3.5 pour cette page et cliquez sur Continuer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+depth+-+scanning+confocal+Raman+microspectrometer+for+rapid+in+vivo+determination+of+water+concentration+profiles+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).</li>
<li>Crowther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+effects+of+topical+moisturizers+on+changes+in+stratum+corneum+thickness%2C+water+gradients+and+hydration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo.</a> British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).</li>
<li>Egawa, M., Tagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+depth+profiles+of+water+and+water-binding+substances+in+the+stratum+corneum+determined+in+vivo+by+Raman+spectroscopy+between+the+cheek+and+volar+forearm+skin%3A+effects+of+age%2C+seasonal+changes+and+artificial+forced+hydration%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration.</a> British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).</li>
<li>Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrowther%2C+JM+%22Changes+in+Stratum+Corneum+Thickness%2C+Water+Gradients+and+Hydration+by+Moisturizers%22">Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).</li>
<li>Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+confocal+Raman+study+of+the+delivery+of+trans+retinol+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin.</a> Applied Spectroscopy. 61 (8), 804(2007).</li>
<li>Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-in+vivo+correlation+in+skin+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro-in vivo correlation in skin permeation.</a> Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).</li>
<li>Hanlon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+in+vivo+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospects for in vivo Raman spectroscopy.</a> Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1(2000).</li>
<li>Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+niacinamide+containing+formulations+on+the+molecular+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum.</a> International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).</li>
<li>Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+stratum+corneum+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in stratum corneum barrier function.</a> Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).</li>
<li>Pezzotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+human+skin%3A+looking+for+a+quantitative+algorithm+to+reliably+estimate+human+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008(2015).</li>
<li>Mlitz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+filaggrin+mutations+on+Raman+spectra+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum+in+mild+to+moderate+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+European+Academy+of+Dermatology+and+Venereology%22%5BJournal%5D)">Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).</li>
<li>Janssens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+to+protein+ratio+plays+an+important+role+in+the+skin+barrier+function+in+patients+with+atopic+eczema%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema.</a> British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).</li>
<li>Faiman, R., Larsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+C+H+stretching+vibrational+frequencies+in+the+Raman+spectra+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).</li>
<li>Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+spectroscopic+deconvolution+procedure+for+complex+biological+systems%3A+vibrational+components+in+the+FT-Raman+spectra+of+ice-man+and+contemporary+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Faraday+Transactions%22%5BJournal%5D)">Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin.</a> Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).</li>
<li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+organization+and+stratum+corneum+thickness+determined+in+vivo+in+human+skin+analyzing+lipid-keratin+peak+%282820-3030+cm-+1%29+using+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).</li>
<li>Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+uptake+and+skin+occlusion+following+topical+application+of+oils+on+adult+and+infant+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin.</a> Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).</li>
<li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Raman+microscopy+for+investigating+the+penetration+of+various+oils+into+the+human+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. , (2015).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MCR+approach+revealing+protein%2C+water+and+lipid+depth+profile+in+atopic+dermatitis+patients%27+stratum+corneum+via+in+vivo+confocal+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. , (2019).</li>
<li>Caspers, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaspers%2C+PJ+%22In+vivo+Skin+Characterization+by+Confocal+Raman+Microspectroscopy%22">In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy</a>. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).</li>
<li>Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCR-ALS+GUI+2.0%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).</li>
<li>Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+normalization+method+in+in+vivo+stratum+corneum+analysis+using+confocal+Raman+microscopy+to+compensate+nonhomogeneous+distribution+of+keratin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).</li>
<li>Wise, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometrics+tutorial+for+PLS_Toolbox+and+Solo%5BTitle%5D)+AND+%22Eigenvector+Research%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo.</a> Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Au cours de la collecte de données, telle que décrite dans les sections 2 et 3 du protocole, chaque profil de profondeur a été recueilli dans une zone avec contact entre la fenêtre de l'instrument et la peau en trouvant les zones les plus sombres des images microscopiques mises en évidence dans les cercles rouges dans Figure 2C. Une fois que ces zones ont été localisées, il était essentiel de commencer le profil de profondeur au-dessus de la surface de la peau pour détermin...

Dans les études cliniques, la spectroscopie in vivo confocale de Raman a montré sa capacité unique pour déterminer l'épaisseur et la teneur en eau de corneum de strate1,2,3,4, et le suivi de la pénétration de matériaux actifs appliqués topiquement sur la peau5,6. Comme approche non invasive, la spectroscopie raman confocale détecte les signaux moléculaires basés sur les modes vibratoires. Ainsi, l'étiquetage n'est pas nécessaire7. La spectroscopie in vivo confocale de Raman fournit des informations chimiques avec une résolution de profondeur basée sur la nature confocale de la technique. Cette information de profondeur-dépendante est très utile en étudiant les effets des produits de soin de peau4,8, vieillissement9,10, changements saisonniers3, ainsi que les maladies de fonction de barrière de peau, comme la dermatite atopique11,12. Il y a beaucoup d'informations dans la région à haute fréquence de la spectroscopie raman confocale (2 500 à 4 000 cm-1), où l'eau produit des pics distincts dans la région entre 3 250 et 3 550 cm-1. Cependant, les pics Raman de protéines et de lipides, qui sont centrés entre environ 2 800 et 3 000 cm-1, se chevauchent parce que les signaux sont principalement produits à partir de méthylène (-CH2-) et de méthyle (-CH3) groupes13 . Cette information qui se chevauche présente un défi technique lors de l'obtention de quantités relatives d'espèces moléculaires individuelles. Le pic14,15 et la position de pointe sélective12,16 approches ont été utilisées pour résoudre ce défi. Cependant, il est difficile pour ces méthodes basées sur le pic unique d'extraire des informations sur les composants purs parce que plusieurs pics Raman à partir du même composant changent simultanément17. Dans notre publication récente18, une approche MCR a été proposée pour élucider l'information sur les composants purs. Grâce à cette approche, trois composants (eau, protéines et lipides) ont été extraits d'un grand ensemble de données spectroscopiques confocales de Raman in vivo.
L'exécution de grandes études cliniques peut être exigeante sur les individus recueillant des données spectroscopiques in vivo. Dans certains cas, l'acquisition spectrale peut nécessiter de l'équipement d'exploitation pendant de nombreuses heures dans une journée et l'étude peut s'étendre jusqu'à des semaines ou des mois. Dans ces conditions, les données spectroscopiques peuvent être générées par des opérateurs d'équipement qui n'ont pas l'expertise technique nécessaire pour identifier, exclure et corriger toutes les sources d'artefacts spectroscopiques. L'ensemble de données qui en résulte peut contenir une petite fraction des valeurs aberrantes spectroscopiques qui doivent être identifiées et exclues des données avant l'analyse. Cet article illustre en détail un processus d'analyse chimiométrique pour « nettoyer » un jeu de données clinique de Raman avant d'analyser les données avec MCR. Pour réussir à supprimer les valeurs aberrantes, les types de valeurs aberrantes et la cause potentielle de la génération des spectres aberrants doivent être identifiés. Ensuite, une approche spécifique peut être développée pour supprimer les valeurs aberrantes ciblées. Cela nécessite une connaissance préalable de l'ensemble de données, y compris une compréhension détaillée du processus de génération de données et de la conception de l'étude. Dans cet ensemble de données, la majorité des valeurs aberrantes sont des spectres de faible signal au bruit et proviennent principalement de 1) spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau (6 208 sur 30 862), et 2) une forte contribution au spectre de la lumière fluorescente de la pièce (67 sur 30 862). Les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau produisent une faible réponse Raman, car le point focal laser s'approche de la surface de la peau et se trouve principalement dans la fenêtre de l'instrument sous la peau. Spectra avec une forte contribution de la lumière de pièce fluorescente sont générés en raison de l'erreur de l'opérateur d'instrument ou le mouvement du sujet, ce qui produit une condition où la fenêtre de collecte raman confocale n'est pas entièrement couverte par le site du corps du sujet. Bien que ces types d'artefacts spectraux aient pu être identifiés et assainis lors de l'acquisition spectrale par un expert spectroscopique au moment de l'acquisition de données, les opérateurs d'instruments formés utilisés dans cette étude ont reçu l'instruction de recueillir toutes les données à moins qu'un une défaillance catastrophique a été observée. La tâche d'identifier et d'exclure les valeurs aberrantes est intégrée au protocole d'analyse des données. Le protocole présenté est élaboré pour résoudre ce défi. Pour s'attaquer aux spectres de faible signal au bruit au-dessus de la surface de la peau, l'emplacement de la surface de la peau doit d'abord être déterminé pour permettre l'élimination des spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau. L'emplacement de la surface de la peau est défini comme la profondeur où le point focal laser Raman est la moitié dans la peau et la moitié de la peau comme illustré dans la figure supplémentaire 1. Après avoir supprimé les spectres signal-bruit bas, une analyse principale des composants (PCA) est mise en œuvre pour extraire le facteur dominé par les pics fluorescents de lumière ambiante. Ces valeurs aberrantes sont supprimées en fonction de la valeur de score du facteur correspondant.
Ce protocole fournit des renseignements détaillés sur la façon dont six composantes principales sont déterminées dans le processus de RMC. Cela se fait au moyen d'une analyse PCA suivie d'une comparaison spectrale des formes entre les charges des modèles générés avec un nombre différent de composants principaux. Le processus expérimental de collecte de données de matériaux de référence ainsi que les sujets humains est également expliqué en détail.

<table><tbody><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td> Cholestérol Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol 3-sulfate sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Erythro-Dihydrosphingosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DI eau</td><td></td><td></td><td>purifiée au milipore (18.2M&Omega ;)</td></tr><tr><td>Analyseur de peau Gen2-SCA</td><td>River Diagnostics, Rotterdam, Pays-Bas</td><td>Gen2</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 2018b</td><td>Mathwork</td><td>2018b</td><td></td></tr><tr><td>N-behenoyl-D-erythro-sphingosine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lignoceroyl-D-érythro-sphinganine (céramide)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide palmitique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide palmitoléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS_Toolbox version 8.2</td><td>Eigenvector Research Inc.</td><td>8.2</td><td></td></tr><tr><td>RiverICon</td><td>River Diagnostics, Rotterdam, Pays-Bas</td><td>version 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Squalène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide stéarique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

résoudre l'eau, les protéines et les lipides d'in vivo confocal raman spectra de stratum corneum par une approche chimiométrique

Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Le développement de cette méthode spectroscopique in vivo confocale Raman permet la mesure directe de l'eau, des protéines et des lipides avec une résolution de profondeur chez les sujets humains. Cette information est très importante pour les maladies liées à la peau et la caractérisation des performances des produits de soins de la peau. Ce protocole illustre une méthode de collecte de spectres Raman confocalete et l'analyse ultérieure du jeu de données spectrale tirant parti de la chimiométrie. L'objectif de cette méthode est d'établir un protocole standard pour la collecte de données et de fournir des orientations générales pour l'analyse des données. Le prétraitement (p. ex., suppression des spectres aberrants) est une étape critique dans le traitement de grands ensembles de données provenant d'études cliniques. À titre d'exemple, nous fournissons des conseils basés sur la connaissance préalable d'un ensemble de données pour identifier les types d'valeurs aberrantes et élaborer des stratégies spécifiques pour les supprimer. Une analyse principale des composants est effectuée, et les spectres de chargement sont comparés aux spectres des matériaux de référence pour sélectionner le nombre de composants utilisés dans l'analyse finale de la résolution de la courbe multivariée (MCR). Cette approche est efficace pour extraire des informations significatives à partir d'un large jeu de données spectrales.

Dans cette étude clinique, les spectres confocals in vivo de Raman ont été rassemblés de 28 sujets de 4-18 ans. Un total de 30 862 spectres Raman ont été recueillis avec le protocole de collecte de données mentionné ci-dessus. Ce grand jeu de données spectrales contient 20% d'aberrations spectrales comme le montre la figure 4A. Les spectres aberrants signal-bruit bas ont été enlevés après avoir déterminé la surface de la peau, suivis par le PCA pour identifier les spectres avec des dispo...

Ici, nous présentons un protocole pour la collecte des spectres raman confocals des sujets humains dans les études cliniques combinées avec des approches chimiométriques pour l'ablation spectrale et l'extraction ultérieure des dispositifs principaux.

Résoudre l'eau, les protéines et les lipides d'In Vivo Confocal Raman Spectra de Stratum Corneum par une approche chimiométrique

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

La mesure directe de l’eau, des protéines et des lipides avec la résolution de profondeur dans les sujets humains est très importante pour des maladies peau-connexes, pour la caractérisation de la performance de produit de soin de peau. Cette méthode, ainsi que l’analyse subséquente, tire parti de la chimiométrie pour extraire des informations chimiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de recueillir l’ensemble de données cliniques Raman par des opérateurs d’instruments formés qui manquent d’expertise technique pour identifier, exclure et assainir toutes les sources d’artefacts spectroscopiques.L’ensemble de données qui en résulte peut ensuite être traité pour identifier les valeurs aberrantes qui doivent être exclues de la date précédant l’analyse. Au cours de l’analyse des données, l’un des principaux défis est la suppression des valeurs aberrantes et l’identification du nombre des éléments clés de l’ensemble de données. L’approche montre dans cette vidéo des leviers de connaissance préalable de l’ensemble de données cliniques et l’approche chimiométrique pour extraire avec succès l’eau, les protéines et les lipides avec la résolution de la profondeur.La démonstration de la procédure sera Li Yang, technicien de notre laboratoire de C&T. Pour commencer, que le sujet place un emplacement marqué du corps de lésion ou un site de contrôle en contact étroit avec la fenêtre d’imagerie de l’instrument in vivo confocal Raman. Assurez-vous qu’ils couvrent toute la fenêtre pour éviter l’impact de la lumière ambiante sur l’imagerie.Ensuite, ouvrez le logiciel et déplacez la mise au point jusqu’à ce qu’un spectre similaire à celui montré ici, est vu. Ensuite, déplacez la mise au point à 10 microns de la surface de la peau. Recueillir des données pendant 26 étapes avec une taille d’étape de deux microns dans la région de fréquence montrée ici, en utilisant un temps d’exposition d’une seconde.Mesurez huit répliques pour chaque zone, d’une durée totale pouvant aller jusqu’à 15 minutes. Tout d’abord, utilisez la fenêtre de commande et MATLAB pour modifier l’extension de fichier des données collectées de ric à mat. Chargez ensuite le fichier mat sur la plate-forme logicielle MATLAB, comme indiqué ici.Corrigez la ligne de base de l’ensemble de données à l’aide de la méthode automatique pondérée des moins carrés, en vous rendre à la fenêtre PLS_Workspace et en cliquant à droite sur l’ensemble de données importé, en faisant défiler pour analyser, en sélectionnant d’autres outils et en cliquant sur Prétraitement. Dans la fenêtre qui apparaît, cliquez sur Afficher. Ensuite, faites défiler la barre d’outils méthodes disponibles jusqu’au filtrage de ligne de base des carrés pondérés automatiques et sélectionnez Ajouter.Ensuite, cliquez sur Ok pour définir les options et appliquer le prétraitement aux données. Enregistrez ça comme Spectra_baseline. Ensuite, retournez à la fenêtre de commande et remplacez les données à l’aide du résultat corrigé de base.Maintenant, allez à l’éditeur de texte et exécutez le programme comme indiqué ici. Cela résumera les valeurs entre 2910 et 2965 centimètres inverses pour obtenir les valeurs d’intensité sous chaque spectre Raman à partir des 26 étapes consécutives de mesure, et les stocker dans un fichier Excel. Dans MATLAB, rendez-vous dans l’espace de travail et définissez le chemin d’accès aux données Depth_save, comme indiqué.Ensuite, utilisez le processus décrit ici pour interpoler la valeur offset de l’instrument de 26 à 260 en utilisant la fonction linspace dans MATLAB. Ce processus permettra d’interpoler la valeur d’intensité de 26 à 260 en utilisant la méthode spline, en tirant parti des 260 valeurs de position nouvellement générées. En outre, il utilisera les valeurs de position et d’intensité de 260 comme entrées x et y pour la fonction polyfit respectivement, fixant la valeur du degré à 20.Ensuite, il utilisera les coefficients de sortie et les 260 valeurs de position étendues comme entrée pour le polyval, pour obtenir les 260 valeurs d’intensité finales. Ensuite, il calculera l’intensité moyenne et trouvera le point dans la courbe qui est le plus proche de l’intensité moyenne. Il changera également la valeur de profondeur selon la surface de peau, dans la taille connue d’étape de deux microns.Maintenant, exécutez le programme. Chargez l’ensemble de données spectra Raman après l’enlèvement des spectres externes de la peau dans le logiciel PLS_Toolbox, sous la plate-forme MATLAB et cliquez à droite sur l’ensemble de données pour choisir Analyser puis sélectionner PCA. Ensuite, cliquez sur Choisir le prétraitement.Sélectionnez Normaliser comme approche de prétraitement. Ensuite, choisissez-en un pour la validation croisée. Ensuite, construisez le modèle à l’aide des trois composants pour l’analyse de décomposition pca.Maintenant, retirez le couvercle de la fenêtre de collecte d’instruments Ramen in vivo et recueillez les spectres lumineux de la pièce dans la région à haute fréquence en utilisant les mêmes paramètres utilisés pour la collecte de données du matériau de référence. Identifiez le facteur d’effet de lumière de pièce par comparaison avec le fond léger de pièce. Maintenant, passez en revue les scores et supprimez les spectres avec la valeur de score correspondante significativement plus élevée que la normale.Cela signifie supprimer les valeurs de score de plus de 99,8% de l’ensemble des données, qui est de 0,16 dans cette étude. Enregistrez les données d’étalonnage X-block qui en résultent. Enfin, allez au navigateur PLS_Workspace et modifiez le nouveau fichier.Sélectionnez les étiquettes de ligne et passez à Hard Delete Excluded pour supprimer définitivement les données exclues avant de ré-enregistrer le fichier. Commencez par corriger la ligne de base des spectres Raman à l’aide de la même ligne de base qui vient d’être affichée. Ensuite, effectuez l’analyse PCA sur l’ensemble de données prétraités.Tracez les eigenvalues dans l’échelle logarithmique avec le nombre de composants en cliquant sur le bouton Choisir le composant, et sélectionnez log (eigenvalues)comme valeur y. Pour effectuer l’analyse multivarié de résolution de courbe, utilisez d’abord le bouton de sélection de données pour charger l’ensemble de données dans MCR_main logiciel. Choisissez manuellement le nombre de composants et réglez le numéro de composant entre trois et huit.Ensuite, sous l’onglet Estimation initiale, cliquez sur le bouton Pure. Ensuite, sélectionnez Concentration et cliquez sur le bouton Faire. Une fois que l’écran se rafraîchit, cliquez sur le bouton Ok, puis continuer à passer à la page suivante.Maintenant, cliquez sur Continuer, et sous mise en œuvre, appliquer fnnls. Ensuite, sélectionnez six dans le menu drop-down pour le nombre d’espèces ayant des profils de non-négativité, et cliquez sur Continuer. Sur la page suivante, choisissez les mêmes paramètres et cliquez sur Continuer.Pour déterminer l’emplacement à la surface de la peau, la zone sous le pic Raman de la protéine a été intégrée pour obtenir le profil de profondeur du signal protéique. La surface de la peau a été définie comme l’endroit où la valeur d’intensité du profil de profondeur interpolé était la plus proche de l’intensité moyenne. L’emplacement exact de la surface de la peau n’a pas besoin de coïncider avec un point de données expérimental.Un total de 30 862 spectres Raman ont été recueillis avec le protocole de collecte de données décrit dans cette vidé o. Ce grand ensemble de données spectrales contient des valeurs aberrantes spectrales de 20 %. Il est important d’identifier et d’enlever les spectres aberrants pour parvenir à un ensemble de données approprié.Ici, on peut voir la contribution des lumières de pièce, superposées sur un spectre de référence de Roomlight. L’analyse des composants principaux a été effectuée sur l’ensemble de données confocal Raman prétraité, et l’eigenvalue, ainsi que le nombre de facteurs utilisés, sont tracés ici. Une diminution significative de l’eigenvalue a été observée pour le facteur neuf.Cette observation suggère d’étudier des modèles dont le nombre de composants principaux varie entre trois et huit facteurs à inclure dans le modèle multivarié de résolution de courbe. Lorsque vous essayez cette procédure, il est essentiel de commencer un profil de profondeur au-dessus de la surface de la peau, pour déterminer avec précision l’emplacement de la surface de la peau. Cette méthodologie permet d’enquête sur l’impact des produits de soins de la peau sur les principaux composants de la peau, y compris l’eau, les protéines et les lipides.

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Chimie

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