Name: Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à laide dune bibliothèque de peptides daffichage de phage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez le criblage de peptides ciblant FGFR2 par bibliothèque d'affichage sur phage. Cette méthode efficace permet d'identifier des modulateurs et d'évaluer leur affinité ainsi que leur effet sur la prolifération cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou (No. 2016201604030039).

1. Préparation de réactif
<ol><li>LB (bouillon de lysogénie) moyen : Dissoudre 1 g de tryptone, 0,5 g d'extrait de levure et 0,5 g de NaCl dans 100 ml de H2O. Autoclave et conserver à 4 oC.</li>
	<li>Stock de tétracycline : Préparer 20 mg/mL dans 1:1 éthanol:H2O. Magasin à -20 oC, et vortex avant d'utiliser.</li>
	<li>Solution IPTG/X-gal : Mélanger 0,5 g d'IPTG (isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside) et 0,4 g de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- D-galactoside) en 10 mL de DMF (dimethyl formamide). La solution peut être stockée à -20 oC pendant un an dans l'obscurité.</li>
	<li>Plaques DE tétracycline (Tet) : Dissove 1 g de bacto-tryptone, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de NaCl, et 1,5 g d'agar en 100 ml de H2O. Autoclave et frais à l'ilt; 70 oC. Ajouter 100 l de stock de tétracycline et verser les assiettes. Conserver les assiettes à 4 oC dans l'obscurité.</li>
	<li>PLAQUES D'IPTG/X-gal : Dissoudre 1 g de bacto-tryptone, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de NaCl et 1,5 g d'agar en 100 mL de H2O. Autoclave et refroidir jusqu'à 70 oC. Ajouter 100 l de la solution IPTG/X-gal et verser les plaques. Conserver les assiettes à 4 oC dans l'obscurité.</li>
	<li>Tampon glycine-HCI (0,2 M) : Dissoudre 1,5014 g de glycine et 100 mg de BSA (albumine de sérum bovin) dans 100 ml de H2O et ajuster le pH à 2,2 avec HCl. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker à 4 oC.</li>
	<li>Tampon Tris-HCl (1 M) : Dissoudre 12,11 g de Tris (tris (hydroxyméthyl)aminométhane) dans 100 ml de H2O et ajuster le pH à 9,1 avec HCl. Autoclave et stocker à 4 oC.</li>
	<li>Tampon de revêtement (0,1 M) : Dissoudre 1,68 g de NaHCO3 sur 200 ml de H2O et ajuster le pH à 8,6 avec NaOH. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et conserver à 4 oC.</li>
	<li>Tampon de blocage : Préparer 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) avec 5 mg/mL de BSA. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et conserver à 4 oC.</li>
	<li>TBS: Préparer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) avec 150 mM NaCl. Autoclave et conserver à température ambiante.</li>
	<li>0,05 %, 0,1 % ou 0,5 % TBST : Préparer le SCT avec 0,05 %, 0,1 % ou 0,5 % (v/v) Tween-20. Filtrer à l'aide d'un filtre de 0,22 m et conserver à température ambiante.</li>
	<li>PEG/NaCl: Préparer 20% (w/v) polyéthylène glycol-8000 avec 2,5 M NaCl. Autoclave et conserver à température ambiante.</li>
	<li>Solution TE : Mélanger 1 ml de 1 M Tris-HCl (pH8.0) et 2 ml de 50 mM EDTA (pH 8,0) et ajuster le volume à 100 ml avec H2O. Autoclave et le stocker à température ambiante.</li>
	<li>Tampon d'iodide : Dissoudre 30 g de NaI dans 50 ml de TE, pH 8,0. Conservez la solution à température ambiante dans l'obscurité.</li>
	<li>Agar supérieur : Dissoudre 1 g de tryptone, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de NaCl et 0,7 g d'agarin en 100 ml de H2O. Autoclave et distribuer en 15 ml d'aliquots. Conserver à température ambiante pour utilisation.</li>
</ol>2. Premier cycle de biopanning: Screening phage clones qui se lient au domaine extracellulaire de FGFR2
REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette résistantes aux aérosols et portez des gants pour tous les protocoles afin de minimiser la contamination par les bactériophages environnementaux.
<ol><li>Préparer une solution FGFR2 de 10 g/mL (Purity 'gt; 97%; voir Table of Materials)solution dans le tampon de revêtement. Ajouter 1 ml de la solution préparée à un plat de 35 cm2 et tourbillonner à plusieurs reprises jusqu'à ce que la surface soit complètement humide. Incuber toute la nuit à 4 oC en secouant. REMARQUE : Pour éviter la sélection des liants cibles de leurre, la protéine cible doit être fortement purifiée.</li>
	<li>Inoculer 5 ml de LB et tet medium avec Escherichia coli (E. coli) ER2738 pendant 5 à 10 heures à 37 oC avec secousses. Les cellules ER2738 amplifiées seront utilisées pour la titration à l'étape 3.3.</li>
	<li>Verser la solution de revêtement du plat (la solution excédentaire doit être enlevée) et ajouter la solution de blocage. Incuber à 4 oC pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Jetez la solution de blocage et lavez 6 fois rapidement avec tBST (TBS 0,05% (v/v) Tween-20). Évitez de sécher le plat.</li>
	<li>Reconstituer la bibliothèque de phage d'origine en 1 ml de TBST [concentration finale de 1011 unités de formation de plaque (PFU)], ajouter au plat enduit, et la roche doucement pendant 2 h sur un shaker à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le supernatant et laver le plat 10x avec TBST (TBS - 0,05% (v/v) Tween-20), tel qu'il est effectué à l'étape 2.4. REMARQUE : Les phages non liés doivent être éliminés complètement par un lavage vigoureux.</li>
	<li>Élirez le phage lié en ajoutant 1 ml de tampon glycine-HCl de 0,2 M (pH 2,2) au plat et en se balançant doucement pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer l'éluate dans un tube de microfuge stérilisé et le neutraliser avec 100 l de 1 M Tris-HCl, pH 9.1. REMARQUE : À l'étape 2.6, retirez le phage non lié autant que possible en lavant le plat 10 fois vigoureusement. Il s'agit d'une étape cruciale. Le phage éluté peut être stocké à 4 oC pendant une semaine. Cependant, il est préférable d'aller de l'avant à l'étape suivante dès que possible.</li>
</ol>3. Détermination de titer des phages élupés
<ol><li>Plaques pré-chaudes LB et IPTG/X-gal pendant au moins 1 h à 37 oC avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 100 L de dilutions en série 10 fois (c.-à-d. 101, 102, 103 et 104) de l'éluate de l'étape 2.8 en LB. Utilisez des conseils avec des cartouches de filtre pour éviter la contamination.</li>
	<li>Laissez la culture de l'étape 2.2 atteindre la phase médiane du journal (OD600 - 0,5). Distribuer 200 l de la culture dans des tubes de microfuge stérilisés, un pour chaque dilution d'éluate.</li>
	<li>Pour initier l'infection, ajouter 10 L de chaque dilution de l'étape 3.2 aux tubes de microfuge individuels contenant la culture E. coli ER2738 à partir de l'étape 3.3. Vortex rapidement et incuber à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Enrober 90 'L du mélange à partir de l'étape 3.4 dans les plaques LB 'IPTG/X-gal avec des bâtonnets de revêtement.</li>
	<li>En option, faire fondre l'agar supérieur au micro-ondes, distribuer 3 ml dans des tubes de culture stériles, un pour chaque dilution d'éluate, et maintenir les tubes à 45 oC. Transférer le mélange de l'étape 3.4 aux tubes de culture contenant une gélose supérieure de 45 oC. Mélanger rapidement et verser immédiatement la culture sur une plaque LB/IPTG/X-gal préréchauffée. Inclinez doucement et faites pivoter la plaque pour répartir uniformément l'agar supérieure.</li>
	<li>Après 5 min, inverser et incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Compter les plaques sur des plaques avec environ 100 plaques. Multipliez chaque nombre par le facteur de dilution pour cette plaque pour obtenir le téter phage dans PFU par 10 L.</li>
	<li>Inoculer un autre 5 ml de LB - Tet medium avec E. coli ER2738 à 37 oC pendant la nuit avec des secousses pour l'amplification de phage. REMARQUE : Utilisez la culture de l'ER2738 en phase médiane (OD600 - 0,5) pour le téter phage. Si la plupart des plaques sont blanches sur les plaques X-gal/IPTG, cela signifie que la piscine de phage a été contaminée par des bactériophages sauvages. En cas de contamination, il est nécessaire de recommencer avec les étapes panoramiques de la solution de stock de phage non contaminée.</li>
</ol>4. Amplification de phage
<ol><li>Diluer (1:100) la culture de nuit à partir de l'étape 3.8 dans 20 mL de LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Ajouter l'éluate non amplifiée et incuber en secouant vigoureusement pendant 4,5 h à 37 oC.</li>
	<li>Transférer la culture dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse pendant 10 min à 12 000 x g à 4 oC. Transférer le supernatant dans un tube frais, centrifugeuse à nouveau, et jeter la boulette.</li>
	<li>Transférer le haut 80% du supernatant à un tube frais et ajouter à elle 1/6 volume de 20% PEG/2.5 M NaCl. Laisser le phage se précipiter à 4 oC pendant la nuit. REMARQUE: Mélanger le supernatant de la culture avec PEG/2.5 M NaCl bien.</li>
	<li>Centrifuger le phage précipité à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Jeter le supernatant, centrifugeuse à nouveau, et retirer le supernatant résiduel avec une pipette.</li>
	<li>Resuspendre la pastille dans 1 ml de SCT et transférer le supernatant dans un tube de microfuge. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un tube de microfuge frais et précipiter à nouveau en ajoutant 1/6 volume de 20% PEG/2.5 M NaCl. Incuber sur glace de 15 à 60 min. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Jeter le supernatant, re-tourner, et retirer le supernatant résiduel avec une pipette.</li>
	<li>Resuspendre le granule dans 200 L de TBS et centrifugeuse pendant une minute supplémentaire pour éliminer les impuretés. Transférer le supernatant dans un tube microfuge frais pour obtenir l'éluate amplifiée.</li>
	<li>Titer le phage amplifié tel que décrit à la section 3. REMARQUE : La dilution de l'éluate amplifiée est plus élevée par rapport à l'éluate non amplifiée ; des dilutions en série de 108à 1011 sont généralement suggérées.</li>
</ol>5. Deuxième tour de biopanning
<ol><li>Répétez les sections 2 à 4.</li>
	<li>Titer le deuxième tour de l'éluate amplifiée sur lb - IPTG / X-gal plaques telles que décrites dans la section 3. REMARQUE : Réduire la concentration de la protéine FGFR2 à 5 g/mL. Utilisez le phage amplifié de l'étape 4.7 comme entrée et gardez le titre le même que dans le premier tour (1011 PFU). Réduire le temps d'incubation du phage et du plat enduit de FGFR2 à 1 h et augmenter la concentration d'entre-deux à 0,1 % (v/v) dans les étapes de lavage.</li>
</ol>6. Troisième tour de biopanning
<ol><li>Répétez les étapes 2.1-2.6.</li>
	<li>Élirez le phage lié en ajoutant 1 ml de 20 m bFGF solution (un ligand pour FGFR2) au plat et en se balançant doucement pendant 60 min à température ambiante.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.1-3.7. REMARQUE : Réduire la concentration de revêtement de la protéine FGFR2 à 2,5 g/mL. Utilisez la deuxième série de phage amplifié de la section 5 comme entrée et gardez le titre le même que dans le premier tour (1011 PFU). Réduire le temps d'incubation du phage et du plat enduit de FGFR2 à 30 min et augmenter la concentration d'entre-deux à 0,5 % (v/v) dans les étapes de lavage.</li>
</ol>7. Acquisition de l'ADN de plaque pour le séquençage
<ol><li>Amplification de plaque<ol>
<li>Diluer (1:100) une culture de nuit d'ER2738 en LB. Dispenser 1 mL de culture diluée dans un tube de 2 ml, un pour chaque clone à caractériser.</li>
		<li>Utilisez une pointe de pipette pour choisir une plaque bleue bien séparée d'une plaque de tisière de la section 6 et transférez-la dans le tube contenant la culture diluée. Choisissez un total de 15 plaques. REMARQUE : Les assiettes doivent être âgées de 1 à 3 jours, entreposées à 4 oC, et avoir 100 plaques.</li>
		<li>Incuber les tubes avec des secousses vigoureuses pendant 4,5 h à 37 oC.</li>
		<li>Transférer les cultures dans des tubes de centrifugeuse et une centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Transférer à nouveau le supernatant dans un tube frais et une centrifugeuse.</li>
		<li>À l'aide d'une pipette, transférer les 80 % supérieurs du supernatant dans un tube frais. Étiquetez ceci comme le stock de phage amplifié. REMARQUE : Diluer le phage amplifié avec un volume égal de glycérol stérile à 100 % et conserver à -80 oC pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraction de l'ADN de plaque<ol>
<li>Transférer 500 l de phage amplifié dans un tube de microfuge frais et ajouter un volume de 1/6 de 20% PEG/2.5 M NaCl. Inverser pour mélanger et laisser reposer pendant 10 à 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC, puis verser le supernatant. REMARQUE : Les granulés de phage peuvent ne pas être visibles.</li>
		<li>Centrifugeuse encore. Retirez soigneusement tout supernatant restant.</li>
		<li>Resuspendre complètement la pastille dans 100 l de la mémoire tampon d'iodure en tapant vigoureusement sur le tube.</li>
		<li>Ajouter 250 l d'éthanol à 100 % et couver pendant 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC et retirer le supernatant. Laver la pastille avec 0,5 ml d'éthanol à 70 %, rapidement centrifuger à nouveau, retirer le supernatant et sécher brièvement le granule.</li>
		<li>Resuspendre la pastille dans 30 l de tampon TE et l'utiliser pour le séquençage. REMARQUE : Pré-refroidir l'éthanol à 70 % à -20 oC avant l'étape 7.2.6. Le granule de phage doit être complètement resuspendu dans le tampon d'iodure avant l'ajout d'éthanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Identification de la séquence peptidique
<ol><li>Utilisez l'amorce de séquençage -96 gIII (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG '3') pour le séquençage.</li>
	<li>Analyser les séquences de peptides affichées sur le phage en fonction des résultats du séquençage de l'ADN.</li>
	<li>Synthétiser les petits peptides et analyser par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse pour confirmer leur pureté (98 %).</li>
</ol>9. Détection de l'affinité du petit peptide obtenu et de la protéine extracellulaire de FGFR2 par ITC
<ol><li>Eau stérile de dégaz à l'aide d'un instrument à ultrasons. Dissoudre le petit peptide et la protéine extracellulaire FGFR2 dans l'eau stérile. Centrifuger ces échantillons pour éliminer le précipité résiduel.</li>
	<li>Effectuer les expériences de titration ITC à 25 oC. Titrate 40 m de petit peptide dans la cellule avec 1,5 M de protéines FGFR2 de la seringue, avec une vitesse d'agitation de 750 tr/min. Ajouter la protéine FGFR2 dans 2 aliquots ll (pour un total de 19 injections) à intervalles de 5 min.</li>
	<li>Analyser les données de l'ITC à l'aide d'un modèle de liaison à site unique. REMARQUE : L'eau stérile doit être dégazée, et tous les échantillons doivent être centrifuges pour éliminer les bulles d'air et les impuretés résiduelles. L'expérience doit être menée à une température constante de 25 oC.</li>
</ol>10. Vérification de l'activité biologique du petit peptide obtenu à l'aide d'un résultat de prolifération cellulaire
<ol><li>Cellules BALB/c 3T3 de semences (3,0 à 103 cellules/puits, 100 oL) dans une plaque de 96 puits avec le médium d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
	<li>Remplacez le supernatant par du DMEM frais par 0,5 % de FBS et affaissez les cellules pendant 12 h.</li>
	<li>Faire des dilutions en série du petit peptide (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 et 100 M) avec dMEM frais complété s'ajouter à 0,5% FBS (6 puits en double / concentration). Retirer le supernatant de la plaque de 96 puits et ajouter 100 l de la petite solution peptide par puits. Incuber pendant 48 h à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
	<li>Remplacer le supernatant par du DMEM frais contenant 10% de kit de comptage cellulaire (CCK)-8 solution et couver pendant 2 h.</li>
	<li>Mesurer l'absorption de chaque puits à 450 nm avec un lecteur de microplaques et analyser la viabilité cellulaire.</li>
</ol>

<ol><li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li>
<li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signaling%3A+from+development+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li>
<li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93(2010).</li>
<li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li>
<li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li>
<li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FIIa+study+evaluating+the+safety%2C+efficacy%2C+pharmacokinetics%2C+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li>
<li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713(2012).</li>
<li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li>
<li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li>
<li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li>
<li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8(2016).</li>
<li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li>
<li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+M13+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li>
<li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li>
<li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li>
<li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li>
<li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li>
<li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29-mediated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li>
<li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li>
<li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85(2008).</li>
<li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478(2014).</li>
<li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vasculature+address+book%3A+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li>
<li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts financiers.

Une bibliothèque de phages combinatoire est un outil puissant et efficace pour le dépistage à haut débit de nouveaux peptides qui peuvent lier les molécules cibles et réguler leur fonction13. À l'heure actuelle, les bibliothèques de peptides d'affichage de phage ont un large éventail d'applications. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour sélectionner les peptides bioactifs liés aux protéines réceptrices23, les cibles non protéiques24,...

Les récepteurs du facteur de croissance du fibroblaste (FGFRs) jouent un rôle clé dans la prolifération cellulaire, la cicatrisation des plaies et l'angiogenèse in vivo1. L'activation aberrante de la signalisation de FGFR observée dans une série de tumeurs2,3,4,5 inclut l'amplification de gène, les mutations de gène, les aberrations chromosomiques, et la sécrétion excessive de ligand6 . De nombreux inhibiteurs ciblant les FGFR ont montré des effets thérapeutiques prometteurs dans les essais cliniques et sont principalement classés en trois types : (1) les inhibiteurs de la kinase à petites molécules, qui se lient au domaine intracellulaire du FGFR, (2) antagonistes ciblant le segment extracellulaire, et (3) pièges fGF ligand6. Bien que plusieurs des inhibiteurs de kinase petite molécule ont de bons effets thérapeutiques à la fois in vitro et in vivo7, la plupart d'entre eux ont une faible spécificité cible et montrent des effets indésirables tels que l'hypertension8. La majorité des antagonistes sont des anticorps monoclonaux9,10 et des polypeptides11. Les peptides ont des avantages par rapport aux petites molécules en raison de leur spécificité et des effets secondaires inférieurs. Ils conservent également la perméabilité cellulaire et ne s'accumulent pas dans des organes spécifiques par rapport aux médicaments protéiques12. Par conséquent, les petits peptides ciblés sont à la fois des agents thérapeutiques efficaces et potentiels.
La technologie d'affichage de phage est un outil facile mais puissant pour identifier de petits peptides qui peuvent se lier à une molécule donnée13,14,15. Nous avons utilisé une bibliothèque de peptides d'affichage de phage qui est basée sur un phage simple m13 avec plus de 109 séquences de peptides différentes affichées à la queue pour se lier à la molécule cible (voir tableau des matériaux)16. En raison de la forte affinité des phages vers la molécule donnée, les phages non liés peuvent être lavés, et seuls les phages étroitement liés avec les peptides courts désirés sont conservés. Les cibles moléculaires données peuvent être des protéines immobilisées17,18, glucides, cellules cultivées, ou même des matériaux inorganiques19,20. Un cas passionnant a été rapporté où les peptides d'organe-spécifiques ont été choisis in vivo utilisant la technologie d'affichage de phage21. Les avantages de la technologie d'affichage de phage incluent le haut débit, la facilité d'opération, le coût bas et un large éventail d'applications22.
Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé de criblage de petits peptides se liant à la protéine immobilisée (FGFR2) utilisant une bibliothèque d'affichage de phage. L'efficacité de la technologie est également examinée en mesurant l'affinité du peptide obtenu vers FGFR2 par la calorimétrie de titration isothermale (ITC), et l'activité biologique par un essai de prolifération de cellules. La méthode peut être étendue pour le dépistage de petits peptides qui se lient aux glucides, aux cellules cultivées ou même aux matériaux inorganiques.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu ; m Filtre</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGP002A1</td><td></td></tr><tr><td>35 cm2 Petite parabole</td><td>Thermo</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>70 % Éthanol</td><td>Usine de réactifs chimiques de Guangzhou</td><td>64-17-5-96</td><td></td></tr> <tr><td>Amorce de séquençage gIII Synthèse</td><td></td><td></td><td>de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Nest</td><td>701001-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Beyotime</td><td>ST004D</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>L0037</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 3T3 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-&shy ; 6587</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA Biodragon</td><td>BD-M10110</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8</td><td>kit DOJINDO</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>sh30243.01</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Newprobe</td><td>PB10247</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 Protein</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10014-HNAE</td><td>Pureté >95 %</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Beyotime</td><td>ST097</td><td></td></tr><tr><td>ITC200 système</td><td>MicroCal Omega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Guangzhou usine de réactifs chimiques</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>NaI</td><td>Bidepharm</td><td></td><td></td>BD40879</tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou usine de réactifs chimiques</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PEG&ndash ; 8000</td><td>Sigma</td><td>P2139-250</td><td></td></tr><tr><td>Ph.D.-7 kit de bibliothèque de peptides d’affichage de phages</td><td>New England BioLabs</td><td>E8100S</td><td>Contenant la bibliothèque de phages Ph.D.-7, la souche hôte E. coli la souche hôte ER2738 et le phage de contrôle M13KE</td></tr><tr><td>Protéines de domaine extracellulaire recombinant FGFR2</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10824-H08H</td><td>Pureté > 97 %</td></tr><tr><td>Synthèse de petits peptides</td><td></td><td></td><td>de GL Biochem Ltd. (Shanghai, Chine)</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>S-SHS-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>SLF-T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Beyotime</td><td>ST912</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td> (en anglais</tr></tbody></table>)

dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

La famille humaine des récepteurs du facteur de croissance du fibroblaste (FGFR) comprend quatre membres, à savoir FGFR1, FGFR2, FGFR3 et FGFR4, qui sont impliqués dans diverses activités biologiques, y compris la prolifération cellulaire, la survie, la migration et la différenciation. Plusieurs aberrations dans la voie de signalisation FGFR, en raison de mutations ou d'événements d'amplification des gènes, ont été identifiées dans divers types de cancers. Par conséquent, des recherches récentes ont porté sur l'élaboration de stratégies impliquant le ciblage thérapeutique des FGFR. Les inhibiteurs actuels du FGFR à divers stades du développement préclinique et clinique comprennent soit de petits inhibiteurs moléculaires de kinases tyrosines, soit monoclonal, avec seulement quelques inhibiteurs à base de peptides dans le pipeline. Ici, nous fournissons un protocole utilisant la technologie d'affichage de phage pour filtrer de petits peptides comme antagonistes de FGFR2. En bref, une bibliothèque de peptides phage-affichés a été incubée dans une plaque recouverte de FGFR2. Par la suite, le phage non lié a été lavé par tBST (TBS - 0,1 % [v/v] Tween-20), et le phage lié a été évuré avec un tampon de 0,2 M de glycine-HCl (pH 2,2). Le phage éluné a été amplifié et utilisé comme entrée pour la prochaine série de biopanning. Après trois séries de biopanning, les séquences peptidiques des clones individuels de phage ont été identifiées par séquençage d'ADN. Enfin, les peptides examinés ont été synthétisés et analysés pour l'affinité et l'activité biologique.

Obtention d'une grande affinité petit peptide ciblant FGFR2.
Pour dépister les phages ciblant FGFR2, une bibliothèque de doctorat-7 a été utilisée dans cette étude. Une représentation schématique du flux de travail est indiquée à la figure 1. Dans ce processus, le nombre d'apports de phage (PFU) est resté inchangé, tandis que la concentration de revêtement de la protéine FGFR2 a été réduite progressivement. Les résultats du téter phage suggèrent q...

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour le dépistage des petits peptides qui se lient à FGFR2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage. Nous analysons en outre l'affinité des peptides sélectionnés vers FGFR2 in vitro et sa capacité à supprimer la prolifération cellulaire.

Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Comparé à d’autres méthodes, ce protocole est plus facile à trouver de nouveaux antagonistes, agonisteres, et modulateurs allosteric quantitativement et qualitativement sans connaître la structure d’hydro-dilution et la formation de la protéine cible. Ce protocole est très efficace, facile à manipuler, économique et disponible dans le commerce. Combinez cette méthode de criblage à haut débit avec l’analyse ITC, les petits peptides fonctionnels peuvent être obtenus quantitativement et qualitativement.Ying Zhao et Qiang Wang, étudiants diplômés de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez une solution de FGFR2 dans le tampon de revêtement à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Ajouter un millilitre de la solution à un plat de 35 centimètres carrés et tourbillonner à plusieurs reprises jusqu’à ce que la surface soit complètement mouillée.Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec des secousses. Le lendemain, versez la solution de revêtement et ajoutez la solution de blocage préparée. Incuber à quatre degrés Celsius pendant au moins une heure, puis jeter la solution de blocage et laver rapidement la plaque six fois avec tbst tout en s’assurant que le plat ne se dessèche pas.Reconstituer la bibliothèque de phages d’origine en un millilitre de TBST et l’ajouter au plat enduit. Faire basculer doucement la plaque sur un shaker à température ambiante pendant deux heures. Après cela, jeter le surnatant et laver le plat 10 fois avec tbst.Elute le phage lié en ajoutant un millilitre de 0,2 molaire glycine HCL au plat et en berçant doucement à température ambiante pendant 10 minutes. Transférer l’élitiste dans un tube de microcentrifugeuse stérilisé et le neutraliser avec 100 microlitres d’une molaire Tris-HCL au pH 9.1. Tout d’abord, préchaupez les plaques LB et IPTG X-Gal préparées à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant utilisation.À l’aide de pointes de pipette avec des cartouches de filtre, préparer 100 microlitres de dilutions décuplées de l’élitiste dans LB. Une fois que la culture préparée d’E.coli a atteint la phase médiane, distribuez 200 microlitres de la culture dans des tubes de microcentrifugeuse stérilisés un pour chaque dilution élitente. Pour déclencher l’infection, ajouter 50 microlitres de chaque dilution aux tubes contenant la culture e.coli. Vortex rapidement et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Utilisez ensuite des bâtonnets de revêtement pour enrober les plaques LB et IPTG X-GAL de 90 microlitres de ce mélange. Après cinq minutes, inverser les plaques et les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Comptez les plaques lorsqu’elles apparaissent.Pour commencer, diluer la culture nocturne en 20 millilitres de LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres. Ajouter l’élixent non amplifié et incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses vigoureuses pendant 4-1/2 heures. Ensuite, centrifuger la culture à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Transférer le surnatant dans un tube frais. Centrifugeuse à nouveau en utilisant les mêmes conditions et jeter la pastille. Transférer les 80 % supérieurs du supernatant dans un tube frais et l’ajouter au 1/6e volume de 20 % de polyéthylène glycol et de 2,5 chlorure de sodium molaire.Laissez le phage se précipiter pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifugeuse le phage précipité à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez à nouveau le supernatant et la centrifugeuse dans les mêmes conditions.Utilisez une pipette pour enlever le supernatant résiduel. Resuspendez la pastille en un millilitre de SCT et transférez le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifugeuse à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse frais et précipiter à nouveau en ajoutant 1/6e volume de 20% de polyéthylène glycol et 2,5 chlorure de sodium molaire. Incuber sur la glace pendant 15 à 60 minutes. Ensuite, centrifugeuse à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Jetez à nouveau le supernatant et la centrifugeuse dans les mêmes conditions. Utilisez une pipette pour enlever le supernatant résiduel. Resuspendez la pastille dans 200 microlitres de SCT et de centrifugeuse pendant une minute supplémentaire pour éliminer les impuretés.Ensuite, transférez le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse frais pour obtenir l’élitiste amplifié. Dans cette étude, le nombre d’entrées de phages est maintenu inchangé tandis que la concentration de revêtement de la protéine FGFR2 est progressivement réduite. Les résultats du titer de phage suggèrent que le nombre de phages récupérés augmente graduellement et qu’après trois tours, il y a une augmentation de 65 fois par rapport à celle du premier tour.Une expérience ITC est ensuite menée pour mesurer l’affinité du petit peptide avec FGFR2. Les résultats indiquent que le peptide SP1 a une forte affinité avec FGFR2. Ces données démontrent l’efficacité du protocole de dépistage.Pour étudier l’activité biologique du peptide SP1, un essai de prolifération de fibroblaste est effectué à l’aide d’un kit CCK-8. Balb/C3T3 sont incubés avec le peptide SP1 à différentes concentrations. Les résultats suggèrent que le peptide SP1 supprime la croissance des cellules.La contamination par des phages de type sauvage doit être évitée ici. Assurez-vous d’utiliser des pointes de pipette résistantes aux aérosols. Alors que la croissance en obtenant l’amplification des phages.Cette procédure peut également être utilisée dans le criblage de petits peptides qui se lient aux glucides, aux cellules de culture et aux tissus. Ces peptides peuvent être encore amplifiés par rapport au diagnostic et ciblés

screening-identification-small-peptides-targeting-fibroblast-growth

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Une bibliothèque d'affichage de phages a été utilisé pour identifier les séquences peptidiques qui os cible. L'objectif était d'étudier l'effet de ces peptides sur la différenciation des cellules mésenchymateuses et de déterminer leur effet sur la régénération osseuse.

Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l&#39;expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l&#39;ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

Une méthode est décrite avec accompagnement visuel pour mener évolutives, des sélections à haut débit à partir de banques d'anticorps combinatoires synthétiques de phages contre des centaines d'antigènes simultanément. En utilisant cette approche parallèle, nous avons isolé des fragments d'anticorps qui présentent une affinité et une spécificité pour divers antigènes qui sont fonctionnelles dans des dosages immunologiques standard.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

Le criblage de peptides est un test à haut débit permettant d’identifier les sites d’interaction protéine-protéine. Cela permet de cartographier plusieurs interactions d’une protéine cible et peut servir de méthode pour identifier les sites d’inhibiteurs qui ciblent une protéine. Nous décrivons ici un protocole de criblage et d’analyse des réseaux de peptides.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Nous proposons une méthode permettant de cribler simultanément une bibliothèque de fragments d’anticorps pour l’affinité de liaison et la solubilité cytoplasmique en utilisant la voie de translocation jumelle-arginine d’Escherichia coli, qui a un mécanisme de contrôle de qualité inhérent pour le repliement des protéines intracellulaires, pour afficher les fragments d’anticorps sur la membrane interne.

Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d&#39;une bibliothèque de fragments d&#39;anticorps

Protéines bactériennes affichage bibliothèques est une technique éprouvée pour la découverte des réactifs de peptide d’affinité, une alternative robuste aux anticorps. La méthode de tri semi-automatisée ci-après a rationalisé les protéines pour diminuer l’apparition de faux positifs. Nous illustrons ici le processus de pensée et des techniques appliquées à l’évaluation des candidats et en minimisant l’analyse en aval.

Semi-automatique de criblage de bibliothèques d’affichage bactérienne pour Peptide affinité réactif découverte et l’analyse d’isolats qui en résulte

Nous présentons ici un protocole à l’écran une protéine extracellulaire microarrays pour l’identification des interactions ligand-récepteur roman en haut débit. On décrit également une méthode pour améliorer la détection des interactions protéine-protéine transitoires en utilisant des complexes protéine-faisant.

Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Ici, nous présentons une méthode pour sélectionner pour de nouvelles variantes de la bitine-protéine E. coli ligase BirA qui biotinylates un peptide cible spécifique. Le protocole décrit la construction d'un plasmide pour l'affichage bactérien du peptide cible, la génération d'une bibliothèque BirA, la sélection et la caractérisation des variantes de BirA.

Affichage bactérien de Peptide pour la sélection des enzymes de biotinylating de roman

Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d'un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d'une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l'annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.

Stratégie d&apos;analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

Les techniques de génération d’une bibliothèque de peptides courts pouvant activer les mastocytes via le récepteur MRGPRX2 sont décrites. Les techniques associées sont faciles, peu coûteuses et peuvent être étendues à d’autres récepteurs cellulaires.

Criblage des peptides qui activent MRGPRX2 à l’aide de cellules HEK modifiées

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle critique de la protéine, dont le dérèglement a été impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Ce protocole détaille comment l’affichage des phages peut être utilisé pour isoler de nouvelles variantes d’ubiquitine qui peuvent lier et moduler l’activité des ligas E3 qui contrôlent la spécificité, l’efficacité et les modèles d’ubiquitination.

Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

Découvrez le criblage de peptides ciblant FGFR2 par bibliothèque d'affichage sur phage. Cette méthode efficace permet d'identifier des modulateurs et d'évaluer leur affinité ainsi que leur effet sur la prolifération cellulaire.

Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à laide dune bibliothèque de peptides daffichage de phage (Vidéo) | JoVE Journal

Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage

Explorer plus de vidéos