Analyse de la fonction des cellules satellitaires pendant la régénération musculaire squelettique par des lésions cardiotoxines et l'injection de siRNA In Vivo

Cette technique permet la combinaison de l’injection intramusculaire de la cardiotoxine venin de serpent, l’injection intramusculaire de siRNA auto-livrable, permettant ainsi l’analyse de la régénération du muscle squelettique. L’application d’auto-livraison de siRNA est un moyen élégant d’étudier la perte fonctionnelle de gènes simples pendant la régénération musculaire, évitant ainsi les animaux transgéniques. Après avoir confirmé un manque de réponse à la pincement des pieds, raser la zone d’injection de la jambe inférieure crânienne du genou à la patte, et enlever les cheveux lâches.

Placez la souris dans l’état de supination sur un coussin de cap recouvert d’un tissu chirurgical stérile, et utilisez 70% d’éthanol pour désinfecter la zone d’injection de la jambe inférieure crânienne. Ensuite, chargez une seringue à insuline équipée d’une aiguille de calibre 29, avec 50 microlitres de 20 cardiotoxine micromolaire et percez complètement la peau dans le muscle, juste distal au genou. Lorsque l’aiguille est en place, injecter la cardiotoxine sur une période de livraison de 10 à 20 secondes le long de toute la longueur du muscle, tout en déplaçant l’aiguille d’avant en arrière, pour permettre une distribution uniforme de la cardiotoxine, blessant ainsi l’ensemble du muscle antérieur tibialis.

Ensuite, retournez la souris dans sa cage sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Trois jours après la chirurgie, désinfectez la zone d’injection comme nous venons de le démontrer. Injectez jusqu’à 50 microlitres de siRNA dirigés contre le gène cible d’intérêt dans le muscle antérieur tibialis de la souris anesthésiée, comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, retournez la souris dans sa cage, avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit pleine. Avant de recueillir le tissu musculaire blessé, envelopper le papier d’aluminium autour d’un crayon et sceller le crayon avec du ruban adhésif, de sorte que le fond du moule fournit une surface même et fermée. Lorsque le moule est prêt, désinfecter l’animal entier avec 70% d’éthanol, et utiliser des ciseaux extra pointus pour enlever la peau à la cheville.

Avant de récolter le muscle, utilisez des forceps fins pour pincer les forceps fermés à travers le fascia à côté de l’os tibia à la cheville de la jambe blessée, et déplacer les forceps vers le genou pour déchirer le fascia, exposant le muscle antérieur tibialis. Pour isoler le muscle antérieur tibialis, exposer le tendon distal, et saisir le tendon avec des forceps fins. Utilisez des ciseaux à ressort pour couper le tendon, et saisir le muscle au tendon pour tirer le muscle vers le genou.

Pour permettre l’analyse de la région du ventre moyen, utilisez des ciseaux droits pour couper le muscle antérieur tibialis à la région du ventre en deux moitiés de taille égale, et remplir le moule crayon à mi-chemin avec la solution de congélation. Insérez les deux moitiés du muscle antérieur tibialis dans le moule de congélation en position verticale, avec la région de la ceinture médiane face au fond du moule. Utilisez des forceps pour transférer le moule de congélation à mi-chemin dans de l’azote liquide.

Lorsque le milieu de congélation change de transparent à blanc et devient solide, transférer le moule de congélation à un congélateur de 80 degrés Celsius, ou à la glace sèche pour un traitement futur. Dans les muscles témoins, l’architecture du tissu reste intacte, comme l’observe la localisation des noyaux dans la périphérie des myofibers, et le manque d’accumulation de cellules mononucléées dans l’espace interstitiel. Sept jours après des dommages médiés par cardiotoxine, de nouveaux myofibers sont formés comme marqués par les noyaux centralement localisés, et une accumulation des cellules mononucléées se composant principalement des cellules satellites, mais également des cellules nonmyogenic comme des cellules immunisées.

Dans des conditions de repos, les cellules satellites marquées par la coloration pax7 en rouge, sont situées sous le lamina basal, montré en vert ici. Trois jours après la blessure, le nombre de cellules satellites augmente, et les cellules satellites ne sont plus situées sous le lamina basal. Au jour 10 après les blessures, le nombre de satellites est toujours augmenté.

Pour analyser davantage le processus de régénération, les myofibers nouvellement formés peuvent être tachés avec des anticorps dirigés contre la myosine développementale. Deux jours après l’injection de siRNA, les cellules satellites peuvent être analysées pour la présence du siRNA étiqueté fluorescent. Dans cette expérience représentative, environ 75% des cellules satellites dans le muscle régénérant étaient positives pour le siRNA fluorescent étiqueté.

En outre, environ 74% de tous les myofibers régénérants étaient également positifs pour le siRNA fluorescent, suggérant que soit 74% des myofibers régénérants ont pris le siRNA, que les cellules satellites siRNA-positives avaient fusionné ensemble pour former de nouveaux myofibers, ou que la fusion avec les myofibers régénérants déjà existants s’était produite. L’étape la plus critique est d’atteindre une blessure complète du muscle antérieur tibialis. En plus de l’analyse histologique, des paramètres tels que la force générée peuvent être enregistrés pour analyser la régénération du muscle squelettique d’une manière fonctionnelle.