Name: Obtention de vésicules hybrides Unilamellar géantes par électroformation et mesure de leurs propriétés mécaniques par Micropipette Aspiration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez la mesure des propriétés mécaniques membranaires de vésicules géantes unilamellaires par aspiration micropipette. Cette technique évalue la flexibilité et la stabilité des membranes lipidiques et polymères synthétiques.

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Les auteurs remercient l'ANR pour son soutien financier (ANR Sysa).

1. Fabrication de micropipettes
REMARQUE : Ici, des micropipettes d'un diamètre intérieur allant de 6 à 12 m et d'une longueur de cône d'environ 3 à 4 mm sont nécessaires. Une méthode détaillée de fabrication de micropipette est décrite dans ce qui suit.
<ol><li>Placez le capillaire en verre borosilicate dans la barre de tirage du tire-lamans et fixez l'une des extrémités en resserrant le bouton.</li>
	<li>Faites glisser soigneusement le verre à travers les trous sur le côté de la chambre chauffante.</li>
	<li>Resserrez le bouton de serrage à l'autre extrémité.</li>
	<li>Contrôlez la taille de la pointe et la longueur du cône pour atteindre les spécifications souhaitées. Pour cela, optimiser les paramètres techniques tels que la température de chauffage, la traction, la vitesse, le retard et la pression. Voici un exemple d'un programme utilisé : Chaleur : 550 oC Tirer: 10 (Gamme de la machine: 0-255 dans les unités arbitraires) Vitesse: 30 (Range: 0-255 dans les unités arbitraires) Retard: 1 (Range: 0-255 dans les unités arbitraires) Pression: 500 (Range: 0-999 dans les unités arbitraires)</li>
	<li>Cliquez sur PULL pour exécuter les événements définis par le programme. Le capillaire est ensuite séparé en deux micropipettes, dont les dimensions doivent être ajustées à l'aide d'une microforge.</li>
	<li>Insérer la micropipette dans le porte-pipette métallique de la microforge (voir Figure 1). En utilisant l'objectif 10x, ajuster l'étape du microscope et le manipulateur de pipette (mouvement vertical et horizontal) jusqu'à ce que la pointe de pipette soit proche de la surface de perle de verre.</li>
	<li>Appuyez sur l'interrupteur pour faire fondre la perle de verre. Abaissez la pointe et mettez-la en contact avec la perle de verre fondu. Le verre fondu s'écoulera dans la pipette par action capillaire. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que le niveau du verre fondu atteigne une certaine hauteur comme le montre l'insert de la figure 1.</li>
	<li>Arrêtez le chauffage en supprimant la pression sur l'interrupteur du pied, et tirez rapidement la pointe loin en utilisant le manipulateur de pipette verticale pour causer une rupture nette.</li>
	<li>Répétez les étapes 1,7 et 1,8 jusqu'à ce que le diamètre désiré soit obtenu (6 à 12 m). REMARQUE: Pour améliorer la précision de la mesure du diamètre, au cours de la dernière étape, utilisez un objectif 32x équipé d'un réticule.</li>
</ol>2. Conseils de pipette de revêtement avec BSA (albumin de sérum bovin)
<ol><li>Préparer une solution de 0,1 M de glucose contenant 1% de BSA dans de l'eau pure.<ol>
<li>Peser 180 mg de poudre de glucose, placer dans un tube conique en polypropylène de 15 ml et avec 10 ml d'eau pure.</li>
		<li>Ajouter 0,1 g de poudre de BSA et secouer doucement à l'aide d'un mélangeur rotatif de tube à essai jusqu'à dissolution complète (environ 4 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prenez la solution avec une seringue Luer jetable de 10 ml ml minée d'une aiguille. Une fois remplie, retirez l'aiguille et installez un filtre à cellulose d'acétate de 0,22 m. Remplir plusieurs tubes de microcentrifugeuse en polypropylène (1,5 ml) qui seront utilisés pour immerger la pointe.</li>
	<li>Placez les capillaires verticalement dans les supports. Abaissez le support et plongez la pointe dans la solution glucose/BSA pendant la nuit. La solution devrait monter d'environ 1 cm de haut par action capillaire.</li>
	<li>Retirez la pointe de pipette de la solution glucose/BSA. Préparer 5 ml de solution de glucose de 0,1 M (diluer 90 mg de poudre de glucose dans 5 ml d'eau pure) et filtrer à travers un filtre à cellulose d'acétate de 0,22 m.</li>
	<li>Remplissez la pipette avec la solution de glucose à l'aide d'une seringue en verre de 500 l équipée d'un capillaire de silice fusionné flexible. Ensuite, retirez toute la solution de glucose en la suçant en arrière etjetez-la (figure 2). Répétez cette étape plusieurs fois pour supprimer le BSA illimité.</li>
</ol>3. Formation de VGU et de VJO par électroformation
REMARQUE: Electroformation est un technique couramment utilisé développé par Angelova9. Les procédures pour obtenir une chambre d'électroformation, déposer un film lipidique ou polymère (ou les deux pour les VJO (Giant Hybrid Unilamellar Vesicles)) et hydrater le film sous un champ électrique alternatif sont décrites dans ce qui suit. La procédure de collecte du GUV obtenue est également décrite.
<ol><li>Préparation des solutions d'amphiphile, de saccharose et de glucose<ol>
<li>Préparer une solution amphiphile à une concentration de 1 mg/ml. Peser 10 mg d'amphiphile et dissoudre dans 10 ml de chloroforme. Gardez la solution dans des flacons scellés pour éviter l'évaporation des solvants.</li>
		<li>Préparer une solution de stock de 1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (DOPE-Rhod) à 1 mg/mL en chloroforme.</li>
		<li>Ajoutez 10 L de solution lipidique fluorescente à la solution amphiphile. Gardez les solutions dans des flacons scellés pour éviter l'évaporation des solvants.</li>
		<li>Préparer des solutions de saccharose et de glucose à une concentration de 0,1 M. Peser 342 mg et 180 mg de saccharose et de glucose, respectivement, et les dissoudre dans 10 ml d'eau pure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la chambre d'électroformation REMARQUE : Différents matériaux conducteurs peuvent être utilisés pour fabriquer un dispositif d'électroformation (p. ex., fils de platine10, aiguilles en acier inoxydable11). La chambre d'électroformation est composée de deux diapositives ITO séparées par un espaceur en caoutchouc O-anneau qui a été coupé sur un côté pour créer une ouverture. Les glissières sont reliées à un générateur de tension par deux fils électriques(figure 3 et figure 4A).<ol>
<li>Nettoyez les glissières ITO avec du solvant organique (p. ex. chloroforme). Identifiez la surface conductrice à l'aide d'un ohmmeter.</li>
		<li>Fixez les fils électriques du côté conducteur à l'aide de ruban adhésif.</li>
		<li>Dépôt de solution amphiphile<ol>
<li>Trempez un capillaire dans la solution jusqu'à ce que le niveau augmente par action capillaire et de recueillir environ 5 L de la solution.</li>
			<li>Mettez le capillaire en contact avec le centre de la plaque de verre ITO et étalez doucement la solution. Attendez 10 secondes pour assurer l'évaporation complète du solvant (Figure 4A).</li>
			<li>Répétez cette procédure 3 fois pour chaque côté.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ajouter une couche de graisse sans silicium des deux côtés de l'espaceur O-anneau ouvert. Mettez-le autour de la zone de dépôt. Placez la face conductrice de la deuxième plaque de verre ITO sur le dessus de l'espaceur.</li>
		<li>Placer la chambre d'électroformation sous vide pendant 3 heures pour enlever toute trace de solvant organique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procédure d'électroformation<ol>
<li>Branchez les fils électriques sur le générateur.</li>
		<li>Utilisez les paramètres suivants pour le générateur : Tension sinusoïdale alternative Fréquence: 10 Hz Amplitude: 2 Vde pointe en pointe REMARQUE : La fréquence et la durée optimales de tension doivent être trouvées pour chaque système.</li>
		<li>Assurez-vous que la tension est appliquée avant l'injection de la solution dans la chambre.</li>
		<li>Injecter 1 ml de solution à l'aide d'une seringue avec une aiguille de diamètre intérieur de 0,8 mm pour remplir la chambre. Enlevez les bulles éventuelles.</li>
		<li>Laissez la chambre sous la tension/fréquence appliquée pendant 75 min (figure 4B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>GuVs récolte<ol>
<li>Éteignez le généra teur.</li>
		<li>À l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille de diamètre intérieur de 0,8 mm, aspirer une petite partie de la solution afin de produire une bulle d'air à l'intérieur de la chambre. Inclinez légèrement la chambre afin de faire bouger cette bulle à l'intérieur de la chambre. Cela peut aider les VGU à se détacher de la surface de l'OIT (figure 4C).</li>
		<li>Sucer toute la solution et la transférer dans un tube en plastique de 1 ml.</li>
		<li>Retirez les fils et nettoyez les glissières ITO avec des solvants organiques (toluène puis chloroforme).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Micromanipulation mise en place
REMARQUE: Le principe de l'aspiration micropipette est de sucer une seule vésicule à travers une micropipette en verre en appliquant une dépression. La longueur de la langue à l'intérieur de la pipette est mesurée en fonction de la pression d'aspiration. Le revêtement de pipette avec BSA, décrit précédemment, est essentiel pour empêcher ou réduire au minimum toute adhérence entre les membranes vésicules et la pipette.
Le protocole est illustré ci-dessous.
<ol><li>Pipette et connexion de réservoir remplie d'eau REMARQUE : Le réservoir rempli d'eau et le micromètre sont fixés à une plaque coulissante. Un compteur numérique avec une tête de micromètre permet un déplacement vertical de l'appareil dans une plage de 0 à 2,5 cm et une précision de 1 m. Le déplacement le long d'un rail optique en aluminium est possible jusqu'à 1 mètre de longueur. Un tube de silicium relie le réservoir et le support capillaire (Figure 5A).<ol>
<li>Remplissez le réservoir d'eau pure. Connectez une seringue jetable de 5 ml au support métallique capillaire par l'intermédiaire d'un tube en silicone et aspirez pour créer un flux d'eau du réservoir au support.</li>
		<li>Touchez légèrement le tube pour éliminer les bulles d'air. Simultanément, soulevez le réservoir d'eau pour créer une pression positive. La seringue de 5 ml est toujours fixée au support.</li>
		<li>Après le revêtement et les étapes de nettoyage décrites précédemment (voir l'étape 2), remplissez un capillaire avec une solution de glucose jusqu'à ce qu'une goutte se forme à la fin. Retirez le tube de seringue du support métallique pour créer un léger débit d'eau à son extrémité.</li>
		<li>Tournez le capillaire à l'envers et connectez la goutte de glucose avec le flux d'eau du support. Fixer le capillaire et le support en les vissant ensemble.</li>
	</ol></li>
	<li>Positionner une pipette REMARQUE : Pendant cette opération, le réservoir d'eau est toujours positionné sur le rail en aluminium pour maintenir une pression positive.<ol>
<li>Prenez l'étape en aluminium maison équipée de deux lames en verre (préalablement nettoyées avec de l'éthanol) et collez-les avec de la graisse sous vide de chaque côté. Installez-le au microscope et formez un ménisque entre les deux diapositives à l'aide d'une seringue de 1 ml contenant 0,1 M de glucose, comme le montre la figure 5B,C.</li>
		<li>Placez la pipette et son support sur l'unité motrice du micromanipulateur et serrez le bouton de serrage.</li>
		<li>Utilisez le joystick du panneau de commande en mode grossier pour abaisser la micropipette près du ménisque de glucose. Ajuster la position de la pointe au centre du ménisque en utilisant le mode fin.</li>
		<li>Maintenez la pointe immergée dans le glucose pendant quelques minutes pour nettoyer sa surface extérieure et intérieure (comme une pression positive est maintenue, le flux d'eau rincera la surface intérieure de la pipette pour enlever BSA non couché).</li>
		<li>Conservez la position de la pointe sur le clavier du micromanipulateur et retirez-la du ménisque.</li>
		<li>Retirez le ménisque du glucose et remplacez-le par un ménisque frais. Suck 2 L de VGU dans un saccharose de 0,1 M à l'aide d'une micropipette de 20 L et la mettre dans le ménisque de glucose frais. Observez en mode DIC (contraste d'interférence différentielle) les GUV situés en bas en raison de la différence de densité entre le saccharose (principalement à l'intérieur des GUV) et le glucose (principalement en dehors des GUV).</li>
		<li>Lorsque les vésicules sont légèrement dégonflées, réinsérer la pipette d'aspiration et se concentrer sur la pointe. Définir la hauteur H0 du réservoir d'eau pour lequel la pression est presque 0. Pour cela, profitez de petites vésicules ou particules qui sont naturellement présentes en solution et ajustez la hauteur du réservoir d'eau jusqu'à ce que le mouvement de ces particules soit arrêté.</li>
		<li>À ce stade, entourez le ménisque d'huile minérale pour empêcher l'évaporation de l'eau, voir Figure 5D. REMARQUE : La température ambiante doit être contrôlée entre 20 et 22 oC en utilisant la climatisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Expérience d'aspiration de Micropipette<ol>
<li>Abaissez l'extrémité de la pipette (6-12 m de diamètre) et créez une petite aspiration (-1 cm) pour aspirer une vésicule (15-30 m de diamètre). La membrane de la vésicule sélectionnée doit légèrement fluctuer et ne doit présenter aucun défaut visible (pas de bourgeon ou de filament) (figure 6).</li>
		<li>Élever la pipette à un niveau plus élevé pour isoler la vésicule aspirée des autres vésicules, en utilisant le micromanipulateur et garder cette position pendant toute l'expérience.</li>
		<li>Pré-stresser la vésicule en abaissant le réservoir rempli d'eau à environ -10 cm, puis diminuer la pression pour revenir à sa valeur initiale (-1 cm). Répétez cette étape plusieurs fois pour enlever l'excès de membrane et les petits défauts de la membrane.</li>
		<li>D'une hauteur de -0,5 cm définie par la position du réservoir d'eau, diminuer lentement la pression d'aspiration avec le micromètre pour atteindre un régime dans lequel la membrane fluctue. Ensuite, augmentez la pression pour visualiser clairement une langue dans la pointe avec une longueur de projection significative (quelques microns). REMARQUE : La pression appliquée la plus basse (P0) qui permet d'aspirer la plus petite longueur de projection de membrane (L0) définira le point de référence0 (Figure 7A). Tous les points de la courbe seront mesurés en fonction de cette référence (L 'L'L 0 et 'P ' P0).</li>
		<li>Augmenter la pression d'aspiration avec le micromètre dans le sens des étapes jusqu'à ce qu'elle atteigne 0,5 à 0,8 mN/m. À chaque étape, attendez 5 s et prenez un instantané de la langue. Cette procédure à basse tension permet la détermination du modulus de flexion.</li>
		<li>Continuez d'augmenter la pression d'aspiration de 0,5 mN/m à la tension de rupture en ajustant la hauteur de l'eau remplie de glissement sur le rail (allant de -2 à -50 cm) (Figure 7B-D). À partir de cette expérience à haut régime de tension, le modulus de compressibilité de zone, la tension de lyse et la souche de lyse seront mesurés.</li>
		<li>Étirez environ 15-20 vésicules pour acquérir des statistiques significatives. Chaque expérience d'aspiration de micropipette prend entre 7 et 10 minutes. Effectuez l'analyse d'image à l'aide du logiciel LASAF pour mesurer la longueur de projection de la langue, le diamètre des vésicules et le rayon du capillaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesure du modulus de flexion, modulus de compressibilité de secteur, tension de lyse et souche de lyse<ol>
<li>Pour accéder à ces paramètres, utilisez le formalisme établi par E. Evans12. Calculer la pression d'aspiration appliquée sur la membrane à partir de l'équation 1 : P'wg (h'h0) (1) où g est l'accélération gravitationnelle (9,8 m's 2),w est la densité de l'eau (1 g 'cm3), h est la position du réservoir d'eau et h0 est la position initiale où la pression est égale à zéro.</li>
		<li>Calculez la tension membranaire de l'équation De Laplace : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg">(2) où la pression d'aspiration sur la micropipette, Rp et Rv sont respectivement la micropipette et le vésicule radii (en dehors de la micropipette). La souche de surface de la membrane est définie comme : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg">(3) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg">étant la zone membranaire de la vésicule à la pression d'aspiration inférieure.</li>
		<li>Calculer l'augmentation de la longueur de projection de la vésicule à l'intérieur de la pointe capillaire selon l'équation 412: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg">(4)</li>
		<li>Sous un régime de tension très faible, le lissage des ondulations thermiques domine l'expansion apparente. Terrain ln () vs. À des valeurs basses (généralement 0,001 à 0,0,5 mN.m113),cela donne une ligne droite dont la pente est liée au modulus de flexion, Kb (premier terme de l'équation 5)14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg">(5) REMARQUE : Sous haute tension (0,5 mN.m-1), les ondulations membranaires sont complètement supprimées et la surface de la membrane augmente en raison de l'espacement accru entre les molécules. Dans ce régime, le deuxième terme de l'équation 5 domine et donne accès au modulus de compressibilité de zone Ka (Figure 8 et Figure 9).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le revêtement de la micropipette est l'un des points clés pour obtenir des mesures fiables. L'adhérence de la vésicule à la micropipette doit être évitée, et un revêtement est couramment utilisé dans la littérature17,18,19,20,21, avec BSA, '-caséine ou surfasil. Les détails de la procédure de revêtement sont rarement mentionnés.
La ...

Les vésicules géantes obtenues à partir de phospholipides (liposomes) ont été largement utilisés depuis les années 1970 comme modèle de membrane cellulaire de base1. À la fin des années 1990, les morphologies vésiculaires obtenues à partir de l'auto-assemblage de copolymères, nommés polymères en référence à leurs analogues lipidiques2,3, sont rapidement apparus comme une alternative intéressante aux liposomes qui possèdent une faible stabilité mécanique et une faible fonctionnalité chimique modulaire. Cependant, leur caractère biomimétique cellulaire est plutôt limité par rapport aux liposomes puisque ces derniers sont composés de phospholipides, la principale composante de la membrane cellulaire. En outre, leur perméabilité à faible membrane peut être un problème dans certaines applications comme la livraison de médicaments où la diffusion contrôlée des espèces à travers la membrane est nécessaire. Récemment, l'association des phospholipides avec des copolymères de bloc pour concevoir les vésicules et membranes hybrides polymères-lipidiques a fait l'objet d'un nombre croissant d'études4,5. L'idée principale est de concevoir des entités qui combinent en synergie les avantages de chaque composant (biofonctionnalité et perméabilité des bicouches lipidiques avec la stabilité mécanique et la polyvalence chimique des membranes polymères), qui peuvent être exploitées dans différentes applications : livraison contrôlée et ciblée de médicaments, reconnaissance biomoléculaire au sein des biocapteurs pour le diagnostic, membranes fonctionnelles pour les cellules artificielles, développement de micro-réacteurs bio-inspirés.
Aujourd'hui, différentes communautés scientifiques (biochimistes, chimistes, biophysiciens, physico-chimistes, biologistes) s'intéressent de plus en plus au développement d'un modèle de membrane cellulaire plus avancé. Ici, notre objectif est de présenter, aussi détaillées que possible, des méthodologies existantes (électroformation, aspiration micropipette) pour obtenir et caractériser les propriétés mécaniques des vésicules géantes et les récents modèles de membrane cellulaire " avancé " qui sont des vésicules géantes hybrides de lipides polymères4,5.
Le but de ces méthodes est d'obtenir une mesure fiable de la compressibilité de la zone et la flexion moduli de la membrane ainsi que leur stress de lyse et de la souche. Une des techniques les plus courantes existantes pour mesurer la rigidité de flexion d'une vésicule géante est l'analyse de fluctuation6,7, basée sur l'observation vidéo directe de microscope ; mais cela nécessite une grande fluctuation visible de la membrane, et n'est pas systématiquement obtenu sur des membranes épaisses (par exemple polymères). Le modulus de compressibilité de zone peut être expérimentalement déterminé utilisant la technique de Langmuir Blodgett mais le plus souvent sur un monolayer8. La technique d'aspiration de micropipette permet la mesure des deux moduli sur une bicouche formant la vésicule unilamellar géante (GUV) dans une expérience.
La méthode suivante est appropriée pour toutes les molécules amphiphiles ou macromolécules capables de former des bicouches et, par conséquent, des vésicules par électroformation. Cela nécessite un caractère fluide de la bicouche à la température de l'électroformation.

<table><tbody><tr><td>Équipement et matériaux nécessaires à la conception de micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>diamètre externe et intérieur de 1 mm et 0,58 mm respectivement.</td></tr><tr><td>Filament installé Sutter</td><td>Instrument Co.</td><td>FB255B</td><td>2.5mm*2.5mm Box Filament</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modèle P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>équipé de deux objectifs (10x et 32x)</td></tr><tr><td>Matériaux pour le revêtement des pointes de pipette avec BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable 10 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable 5 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulosique acétate jetable</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>Taille des pores : 0,22 & micro ; m, diamètre : 25mm</td></tr><tr><td>Flexible Fused Silica Capillary Tubing</td><td>Polymicro Technologies.</td><td>TSP530660</td><td>Diamètre intérieur 536&micro ; m, diamètre extérieur 660 & micro ; m,Glucose</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 500 &micro ; L luer Lock GASTIGHT</td><td>Hamilton Seringe Company</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur rotatoire pour tubes à essai</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulation Set</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rail optique en aluminium, longueur 1000 mm, filetages M4, série X48</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table optique amortie</td><td>Newport</td><td></td><td>Utilisé comme support de microscope pour éviter les vibrations externes.</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>L’unité modulaire (unité motrice pour le mouvement X, Y et Z) est montée sur le microscope inversé à l’aide d’un adaptateur.</td></tr><tr><td>Micromètre</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>Digimatic LCD Tête micrométrique 25,4 mm Portée 0,001 mm</td></tr><tr><td>Réservoir d’eau en plexiglas (100 ml)</td><td></td>Microscope confocal inversé (DMI6000) TCS SP5 fait <td></td><td></td>maison</tr><tr><td>équipé d’un scanner résonant et d’un objectif à immersion dans l’eau (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>Porte-rail <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 de 80 mm de longueur, avec filetage 1/4-20, 8-32 et 4-40</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matériaux pour la préparation de solutions de saccharose et d’amphiphiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611 » target="_blank"> 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha ;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>Rhodamine étiquetée lipide</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Electroformation Configuration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro ; L capuchons capillaires en verre</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable de 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H Graisse</td><td>Apiezon</td><td>Apiezon H Graisse</td><td>sans silicone</td></tr><tr><td>Lames de verre revêtues d’oxyde d’étain d’indium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0,8 x 38 mm</td></tr><tr><td>Ohmmètre (Multimètre)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>Générateur de tension</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

obtention de vésicules hybrides unilamellar géantes par électroformation et mesure de leurs propriétés mécaniques par micropipette aspiration

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Les vésicules géantes obtenues à partir de phospholipides et de copolymères peuvent être exploitées dans différentes applications : livraison contrôlée et ciblée de médicaments, reconnaissance biomoléculaire au sein des biocapteurs pour le diagnostic, membranes fonctionnelles pour les cellules artificielles et développement de micro/nanoréacteurs bioinspirés. Dans toutes ces applications, la caractérisation de leurs propriétés membranaires est d'une importance fondamentale. Parmi les techniques de caractérisation existantes, l'aspiration micropipette, lancée par E. Evans, permet de mesurer les propriétés mécaniques de la membrane telles que le modulus de compressibilité de zone, le modulus de flexion et le stress et la contrainte de lyse. Ici, nous présentons toutes les méthodologies et procédures détaillées pour obtenir des vésicules géantes à partir de la fine pellicule d'un lipide ou d'un copolymère (ou les deux), la fabrication et le traitement de surface des micropipettes, et la procédure d'aspiration menant à la mesure de tous les paramètres mentionnés précédemment.

With the protocol aforementioned, we have studied different synthetic giant unilamellar vesicle (GUV), obtained from a phospholipid: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), a triblock copolymer: Poly(ethyleneoxide)-b-Poly(dimethylsiloxane)-b-Poly(ethyleneoxide) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) synthesized in a previous study13, and a diblock copolymer Poly(dimethylsiloxane)-b...

L'objectif du protocole est de mesurer de façon fiable les propriétés mécaniques membranaires des vésicules géantes par aspiration micropipette.

Obtention de vésicules hybrides Unilamellar géantes par électroformation et mesure de leurs propriétés mécaniques par Micropipette Aspiration

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Ce protocole facilite une mesure fiable des propriétés mécaniques membranaires de la vésicule lipidique synthétique et réelle en polymère à l’aide d’une technique d’aspiration de micropipette. C’est la seule technique qui permet d’étirer la flexibilité et l’instabilité de la membrane pour être évaluées dans le cas d’expériences simples. Ce protocole implique une série de procédures de la préparation vésicule à l’évaluation mécanique.Il est très important d’être patient et de résoudre tous les problèmes techniques au fur et à mesure qu’ils surviennent. La visualisation de ces techniques est essentielle pour comprendre comment traiter correctement la surface capillaire et comment effectuer l’étape obligatoire de préstress. Montrant la vésicule sans défauts.Martin Fauquignon, doctorant au laboratoire travaillant sur le développement de vésicules lipidiques polymères hybrides, fera la démonstration. Avant de commencer la procédure placer les capillaires de micropipette en verre froid verticalement dans les supports. Et baisser les supports jusqu’à ce que les pointes soient immergées dans la solution fraîchement préparée d’albumine de sérum bovin de glucose pendant la nuit.Le lendemain matin, la solution aurait dû s’élèver d’environ un centimètre dans les pointes par l’action capillaire. À l’aide d’une seringue en verre de 500 microlitres, équipée d’un capillaire flexible en silice fondue, remplissez chaque pipette de la solution de glucose. Ensuite, aspirez la solution de chaque pipette, avant de remplir les pipettes avec une solution de glucose frais plusieurs fois jusqu’à ce que tout le sérum tel qu’il a été enlevé.Pour préparer une chambre d’électroformation, nettoyez d’abord les glissières ITO avec un solvant organique approprié et identifiez la surface conductrice à l’aide d’un Ohmeter. Fixez les fils électriques sur le côté conductrice de chaque glissière avec du ruban adhésif. Tremper un capillaire dans la solution ampiviale jusqu’à ce qu’environ 5 microlitres de la solution aient été collectés par action capillaire.Placez le capillaire chargé en contact avec le centre d’une plaque ITO en verre et étalez doucement la solution sur la glissière. Lorsque le solvant s’est complètement évaporé, appliquez la solution deux fois de plus comme il vient de le démontrer. avant d’ajouter une couche de graisse sans silicium des deux côtés de l’espaceur ouvert o-anneau autour de la zone de dépôt.Ensuite, placez la face conductrice d’une deuxième plaque de verre ITO sur le dessus de l’espaceur, et placez la chambre d’électroformation sous vide pendant 3 heures pour éliminer toute trace de solvant organique. Pour l’électroformation des vésicules unilamellar géantes, branchez les fils électriques dans le générateur. Réglez la fréquence du générateur à 10 Hertz, et l’amplitude à 2 Volts, pic à pic.Lorsque la tension a été réglée, utilisez une seringue munie d’une aiguille de diamètre intérieur de 0,8 millimètre pour injecter une millilitre de solution de saccharose molaire de 0,1 molaire dans la chambre, et laissez la chambre sous la tension et la fréquence appliquées pendant 75 minutes. À la fin de l’électroformation, éteignez le générateur. Et utilisez la seringue d’un millilitre pour aspirer un petit volume de solution jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit produite à l’intérieur de la chambre.Inclinez légèrement la chambre pour déplacer la bulle dans la chambre et pour aider les vésicules à se détacher de la surface de la glissière. Et aspirer tout le volume de solution dans la seringue. Ensuite, transférez la solution vésicule dans un tube en plastique d’un millilitre.Pour mettre en place les matériaux pour la micromanipulation, aspirez à créer un flux d’eau, un réservoir d’eau pure, à un seul support. Et appuyez légèrement tout en soulevant le réservoir pour éliminer les bulles d’air, et pour créer une pression positive. Remplir un capillaire enduit de sérum avec une solution de glucose frais jusqu’à ce qu’une goutte se forme à la pointe.Retirez le tube de seringue du support métallique pour créer un léger débit d’eau à l’extrémité du support, et tournez le capillaire à l’envers pour relier la goutte de glucose au débit d’eau. Ensuite, vissez le capillaire et le support ensemble. Pour positionner la pipette, collez deux glissières en verre à partir d’une scène en aluminium sur mesure ainsi que de la graisse sous vide.Et installez les diapositives sur une scène de microscope. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, former un ménisque entre les deux toboggans avec un glucose molaire de 0,1. Placez la pipette et son support sur l’unité motrice du micromanipulateur.Serrez le bouton de serrage et utilisez le joystick du panneau de commande en mode grossier. Abaissez la micropipette près du ménisque de glucose. Utilisez le mode fin pour ajuster la position de la pointe au centre du ménisque.Immerger la pointe dans le glucose pour nettoyer ses surfaces extérieures et intérieures. Après quelques minutes, retirer le capillaire du ménisque et remplacer le glucose par un ménisque frais. Aspirez deux microlitres de vésicules unilamellar géantes dans le saccharose molaire de 0,1, dans une pointe de micropipette de 20 millilitres.Introduire les vésicules dans le ménisque. Utilisez le microscope pour observer les vésicules au bas de la chambre de diapositives. Lorsque les vésicules sont légèrement dégonflées, réinsérer la pipette d’aspiration et se concentrer sur le bout de la pipette.Réglez ensuite la hauteur de base du réservoir d’eau à la pression à laquelle le mouvement des particules est arrêté. Entourez le ménisque d’huile minérale pour éviter l’évaporation. Pour effectuer une expérience d’aspiration de micropipette, abaissez la pointe de pipette dans le ménisque.Créer une petite quantité de pression d’aspiration pour aspirer une vésicule. La membrane de la vésicule sélectionnée doit légèrement fluctuer et ne doit présenter aucun défaut visible. Utilisez le micromanipulateur pour élever la pipette à un niveau plus élevé pour isoler la vésicule aspirée d’autres vésicules.Abaissez le réservoir d’eau à environ 10 centimètres pour préstresser la vésicule avant de soulever le réservoir pour retourner la pression à la valeur initiale. D’une hauteur de 0,5 centimètre, diminuez lentement la pression d’aspiration jusqu’à ce qu’une pression à laquelle la membrane fluctue soit atteinte. Ensuite, augmenter la pression pour visualiser clairement une langue dans la pointe, la longueur de projection de quelques microns.Pour déterminer le module de flexion, augmenter la pression d’aspiration, un micromètre à la fois dans le sens inverse. Jusqu’à 0,5 à 0,8 milliNewtons par mètre est atteint. Attendre cinq secondes, et prendre un instantané de la langue après chaque étape.Pour déterminer la zone de comprimabilité modulus, et la tension de lyse et la souche continuent d’augmenter la pression d’aspiration de 0,5 milliNewtons par mètre jusqu’à ce que la tension de rupture est atteinte. Dans cette expérience représentative, la contrainte de modulus de compressibilité de secteur et de lyse pour POPC étaient en parfait accord avec cela attendu de la littérature. Dans ce tableau, des valeurs typiques pour les polymères obtenus peuvent être observées.Notez que la dureté de la membrane obtenue à partir de copolymères diblock est beaucoup plus grande que celles obtenues à partir de copolymère tribloc. Fait intéressant, en utilisant le copolymer diblock, il est possible d’obtenir un géant hybride unilamilar lipide polymère vésicules qui démontrent une dureté plus robuste que celle mesurée pour les liposomes. Ce protocole peut être utile pour mesurer la vésicule à l’aide d’une pipette, par exemple, pour mesurer la perméabilité de la membrane par choc asmatique.Assurez-vous de compléter chaque étape avec rigueur et précision, en particulier lors de la mise en place de la connexion tribune. Cette technique a été exploitée pour comprendre l’origine physique de la fission membranaire, par la mesure de la tension de la ligne aux limites principales dans les vésicules modifiées.

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Chimie

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Obtention de vésicules hybrides Unilamellar géantes par électroformation et mesure de leurs propriétés mécaniques par Micropipette Aspiration (Vidéo) | JoVE Journal

Obtention de vésicules hybrides Unilamellar géantes par électroformation et mesure de leurs propriétés mécaniques par Micropipette Aspiration

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