Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

Ce protocole permet la modulation simultanée de nombreux ARN micro dans les cellules eucaryotes et est basé sur une méthode très simple et flexible qui minimise les étapes de clonage moléculaire. Cette technique a des implications pour l’étude des interactions fonctionnelles de micro ARN in vitro, mais plus important encore, elle fournit une plate-forme pour une utilisation plus efficace des ARN micro en thérapie. Nous l’avons principalement développé et utilisé dans le contexte du cancer du cerveau, mais il s’applique à toutes les maladies où de multiples altérations de l’expression des gènes sont impliquées.

Nous avons testé nos gènes trans artificiels dans d’autres modèles tels que les lignées de cancer du sein et de la thyroïde montrant la reproductibilité de cette technique. Les connaissances de base en bioinformatique et en biologie micro ARN sont utiles pour ce protocole, mais pas indispensables. Une approche bioinformatique est importante pour définir les combinaisons pertinentes de micro ARN et le TRK-11, tandis que la familiarité avec le traitement de micro ARN de façon mesurable est importante pour comprendre comment ces différents micro ARN peuvent être assemblés en grappes artificielles d’ADN qui peuvent être traitées avec succès une fois stables aux cellules spécifiques.

Pour enrober le plat, dissoudre d’abord la poly-D-lysine dans l’eau à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Verser la solution dans le plat à la quantité d’un millilitre de solution par surface de 25 centimètres carrés. Faites tourbillonner le plat pour vous assurer de la couverture de l’ensemble du plat.

Après six heures aspirer la solution poly-D-lysine et rincer deux fois avec PBS. Plaques de cellules souches neurales humaines dans la quantité de 100 000 cellules par cinq millilitres du milieu, soit dans le milieu des cellules souches, milieu de différenciation astrocytique ou milieu de différenciation neuronale. Après le placage cellulaire, placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant une semaine et procéder à l’analyse de l’expression micro ARN selon le manuscrit.

Pour la culture gbm-34 glioblastoma cellules souches comme, commencer par une fois dix à la cinquième cellule et cinq millilitres de milieu neurobasal dans un flacon de fixation de 25 centimètres carrés bas. Placez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. 48 heures après le placage, ajouter des concentrations de doublement de l’adn alkylating agent temozolomide tous les sept jours.

Commencez par l’ajout de cinq micromolaires TMZ complétés en cinq millilitres moyens pendant cinq jours. Après cinq jours, retirer le milieu et remplacer par un milieu frais sans témozolomide pour permettre aux cellules survivantes de récupérer. Après 48 heures, ajouter 10 temozolomide micromolaire et incuber pendant encore cinq jours.

Répétez le traitement par témozolomide jusqu’à ce que la concentration d’au moins 100 micromolaires soit atteinte et que les cellules deviennent résistantes au médicament. Après l’induction de la résistance, les cellules se trouvent à l’aide de 1 millilitre de réageni de lyse. Extraire l’ARN total et analyser l’expression des micro ARN spécifiques selon le manuscrit.

Pour obtenir le targetome prévu de chaque micro ARN précédemment défini, utilisez des outils de prévision de ciblage micro ARN. À partir de la première page de TargetScan, sélectionnez le micro ARN d’intérêt dans le menu décrocheurs pré-rempli. Cliquez sur le bouton soumettre.

Téléchargez la liste des cibles qui en résulte en tant que feuille de calcul à l’aide du lien de table de téléchargement. Pour réduire les risques de prédictions faussement positives, n’incluez que les cibles dans la colonne des sites conservés et l’analyse en aval. D’autres programmes de prédiction de micro ARN obtiennent une plus grande rigueur et n’incluent que des cibles communes à tous les algorithmes.

Ensuite, ouvrez la suite ToppGene 20. Pour évaluer l’enrichissement des voies communes à chaque micro ARN, coller la liste des cibles obtenues dans la fenêtre des ensembles de gènes d’entraînement. Cliquez sur HGNC Symbol comme type d’entrée.

Cliquez sur soumettre et commencer. Le programme fournit un tableau de sortie montrant les catégories GO les plus importantes pour la liste des gènes entrés. Pour enfin établir la contribution de chaque micro ARN à la régulation d’une voie commune ou d’un processus cellulaire, ouvrez la fonction de diagramme de venn fournie dans le site Web bioinformatique et génomique évolutionnaire.

Vérifiez chaque targetome obtenu par rapport à la liste complète des gènes impliqués dans le processus cellulaire spécifique. Si les ARN messagers cibles pour chaque micro ARN d’intérêt se trouvent dans les fenêtres respectives, téléchargez la liste. Nommez chaque liste avec un identificateur unique.

Cliquez sur soumettre. Le programme fournit une sortie visuelle d’un diagramme de venn avec un nombre de gènes dans chaque secteur ainsi qu’une liste complète des ARN messagers pour chaque sous-ensemble et combinaisons d’intersections. Pour regrouper les micro ARN sélectionnés en un gène trans fonctionnel, obtenir un échafaudage transgénique basé sur le locus miR-17-92.

Obtenez la séquence nucléotide à partir du navigateur du génome ensembleé. Sélectionnez la séquence centrale d’environ 800 paires de base englobant les six épingles à cheveux micro ARN codées du locus et au moins 200 séquences de flanc de nucléotide en amont et en aval de la séquence centrale. Coller la séquence dans n’importe quel programme d’édition de mots.

Définissez la séquence de chacune des six épingles à cheveux indigènes en les récupérant dans la base miR. Marquez chacune de ces séquences dans le cadre d’une séquence de base précédemment identifiée. Toutes les séquences entre chaque épingle à cheveux représentent des séquences d’espaceurs.

Ensuite, obtenez les séquences d’épingle à cheveux de micro ARN destinés à être surex exprimés dans le gène trans à partir de la base miR. Notez soigneusement les nucléotides spécifiques qui se trouvent sur les sites de clivage micro processeur. Supprimer les séquences d’épingle à cheveux indigènes de la séquence centrale à l’exception de trois à cinq nucléotides aux extrémités cinq et vous de chaque épingle à cheveux qui servira d’accepteur pour les nouvelles épingles à cheveux.

Coller les séquences en épingle à cheveux des micro ARN désirés pour remplacer les épingles à cheveux précédemment supprimées. Ajoutez les séquences de restriction souhaitées aux deux régions flanquées du gène trans pour faciliter le sous-clonage dans les vecteurs de livraison de choix. Vérifiez que les séquences de restriction choisies ne sont pas présentes dans la séquence elle-même.

Pour vérifier la structure bidimensionnelle du gène trans, copiez la séquence transgénique complète dans le logiciel de prédiction de la structure de l’ARN RNA Webfold. Sélectionnez les paramètres standard du programme et cliquez sur procéder. Analyser la sortie graphique, en particulier pour la présence d’épingles à cheveux bien définies en présence de structures de tige à double brin qui sont au moins 11 nucléotides proximaux au site de clivage micro processeur.

Aussi, recherchez l’absence de points de ramification dans les séquences d’épingle à cheveux. À ce stade, le gène trans est prêt à être produit par synthèse génétique et cloné dans les vecteurs de livraison souhaités. Cette méthode a permis la caractérisation d’un module de trois micro ARN qui sont constamment vers le bas réglés dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimés spécifiquement pendant la différenciation neuronale.

Des modèles de co-expression des modules de micro ARN pendant le stress génotoxique ont été confirmés et ont suggéré une activité synergique forte parmi ces trois ARN micro. Le gène trans conçu pourrait simultanément récapituler l’expression des trois micro ARN dans les cellules de glioblastoma, in vitro et in vivo, avec l’interférence significative dans la biologie de tumeur et l’applicabilité translationnelle prometteuse. En outre, le faisceau transgénique était également fonctionnel dans un modèle de cancer du sein.

Les exigences cruciales de ce protocole sont le maintien de la taille originale du clivage du processeur dans le gène trans. Et assurez-vous que la structure en boucle de tige des épingles à cheveux chimériques micro ARN est préservée. Avec cette méthode, nous pouvons concentrer plusieurs gènes micro ARN biologiquement actifs en séquences d’ADN très courtes qui peuvent littéralement être insérées dans n’importe quel vecteur de livraison pour une utilisation génique.

Cette méthode est idéale pour étudier l’interaction fonctionnelle entre les différents micro ARN et pour interférer avec les voies cellulaires multifactorielles complexes qui nécessiteront autrement de multiples combinaisons de médicaments.