Name: Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez une méthode de bioinformatique pour moduler simultanément plusieurs micro-ARN dans des cellules eucaryotes et concevoir des grappes artificielles. Cette technique avance la recherche sur les interactions fonctionnelles des micro-ARN et leurs applications thérapeutiques en oncologie.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de neuro-oncologie Harvey Cushing pour leur soutien et leurs critiques constructives. Ce travail a été soutenu par les subventions NINDS K12NS80223 et K08NS101091 à P. P.

1. Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le glioblastome
<ol><li>Analyse de l'expression de miRNA différentiel large dans le glioblastoma contre le cerveau
	<ol>
<li>Tout d'abord, déterminer les miARN les plus significativement déréglementés dans la tumeur. Cela peut être réalisé en utilisant au moins trois méthodes différentes:<ol>
<li>Mine the Cancer Genome Atlas, trouvé à https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, pour le séquençage des données11.</li>
			<li>Effectuer l'analyse de microarray à partir d'un spécimen opératoire frais12.</li>
			<li>Utilisez des ensembles de données publiés précédemment13. REMARQUE: Quelle que soit la méthode choisie, la sortie fournit un ensemble en vrac de miARN dont l'expression est statistiquement corrélée (directement ou inversement) avec la biologie tumorale. Ce groupe initial constitue le pool de miRNAs qui sont analysés plus en détail pour l'identification d'un sous-ensemble de miRNAs affichant l'association fonctionnelle la plus rigoureuse en effectuant une analyse plus dynamique des changements d'expression, comme discuté ci-dessous.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de l'expression miRNA spécifique à la condition
	<ol>
<li>Induction de la différenciation cellulaire :<ol>
<li>Utilisez des plats en plastique pré-enduits de poly-D-lysine (PDL) pour favoriser la formation d'une culture monocouche. Pour le revêtement plat, dissoudre le PDL dans l'eau à une concentration de 100 g/mL. Utiliser 1 ml de solution par surface de 25 cm2. Rincer 2x avec PBS 6 h après l'application de la solution PDL.</li>
			<li>Plaquer les cellules souches neurales humaines en quantités égales (100 000 cellules/5 mL) soit dans le milieu des cellules souches (milieu neurobasal - supplément B27 - 20 ng/mL EGF/FGF), le milieu de différenciation astrocytique (DMEM à 10 % FBS), soit dans le milieu de différenciation neuronale (milieu neurobasal et B27), le milieu de différenciation astrocytique (DMEM à 10 % FBS), ou le milieu de différenciation neuronale (milieu neurobasal et B27) supplément, 2 M acide rétinoïque)14. Le protocole pour la différenciation d'oligodendrocyte exige l'addition de l'IGF-1 (200 ng/mL) après l'enlèvement d'EGF/FGF14,15.</li>
			<li>Après le placage cellulaire, placer dans l'incubateur pendant 1 semaine à 37 oC, 5 % DE CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Extraction d'ARN:<ol>
<li>Après 7 jours, retirer les cellules de l'incubateur et retirer le milieu.</li>
			<li>Laver les cellules avec du PBS (5 ml). Ensuite, ajouter 1 ml de réactif de lyse (voir Tableau des matériaux)pour lyser les cellules et gratter les cellules en tube microfuge de 1,5 ml à l'aide d'un grattoir cellulaire. Gardez les tubes contenant les cellules lysées à température ambiante (RT) pendant 5 min.</li>
			<li>Procéder à l'isolement total de l'ARN en suivant les instructions du fabricant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>analyse de l'expression miRNA:<ol>
<li>Quantifier l'expression différentielle des miARN spécifiques identifiés à l'étape 1.1 parmi les trois modèles de différenciation par PCR en temps réel, en utilisant les sondes TaqMan et en suivant les protocoles du fabricant pour la transcription inversée et l'amplification du PCR ( Figure 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Validation des clusters miRNA par des défis spécifiques au stress
	<ol>
<li>Culture G34 glioblastoma cellules souches dans le milieu neurobasal - Supplément B27 20 ng/mL EGF/FGF. Commencez avec 1 x 106 cellules dans 5 ml dans un flacon d'attachement bas de 25 cm2.</li>
		<li>À partir de 48 h après le placage, ajoutez des concentrations de doublement de l'agent alkylating de l'ADN témozolomide (TMZ) tous les 5 jours, comme suit :<ol>
<li>Commencez par 5 M pendant 5 jours. Après 5 jours, retirer le milieu et remplacer par un milieu frais sans témozolomide, pour permettre aux cellules survivantes de récupérer. Après 48 h, ajouter 10 M TMZ et couver pendant encore 5 jours.</li>
			<li>Répétez l'étape 1.3.2.1, doublant la concentration de TMZ à chaque fois, jusqu'à ce qu'une concentration d'au moins 100 M soit atteinte et que les cellules deviennent résistantes au médicament10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dans une expérience parallèle, irradier les cellules G34 comme suit :<ol>
<li>À partir de 48 h après le placage 1 x 106 cellules dans 5 ml dans un flacon d'attachement faible de 25 cm2, irradier les cellules avec 2 Gy d'énergie (tout irradiateur fournissant l'émission de photon est acceptable). Remettre les cellules à l'incubateur et ne pas déranger. Après 48 h, irradier à nouveau les cellules avec 2 Gy supplémentaires d'énergie.</li>
			<li>Répétez l'étape 1.3.3.1 4x jusqu'à ce qu'un total de 10 Gy d'énergie soit administré.</li>
			<li>Remettre les cellules à l'incubateur et les laisser récupérer dans un milieu frais pendant au moins 5 jours avant l'analyse en aval.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Après l'induction de la résistance, lysez les cellules à l'aide d'un réactif de lyse et extrayez l'ARN total selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Analyser l'expression des miARN spécifiques identifiés dans les sections 1.1-1.2 telles que décrites à l'étape 1.2.1 (figure 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Caractérisation de la convergence fonctionnelle des miARN groupés
	<ol>
<li>Obtenir le targetome prévu de chaque miARN défini dans les sections 1.2-1.3 obtenues à l'aide d'outils de prévision de ciblage miRNA. REMARQUE: Nous avons généralement recours à TargetScan, comme son algorithme est périodiquement mis à jour16. D'autres outils de prédiction sont miRanda17, miRDB18, et DIANA-miRPath19. Tous ces programmes sont des applications gratuites sur le Web.<ol>
<li>À partir de la première page de Targetscan, sélectionnez le miRNA d'intérêt dans le menu déroulant pré-peuplé. Cliquez sur le bouton Soumettre.</li>
			<li>Téléchargez la liste des cibles qui en résultent sous forme de feuille de calcul à l'aide du lien de table De téléchargement ( Figure supplémentaire1).</li>
			<li>Pour réduire les risques de fausses prédictions positives, n'incluez que des cibles dans la colonne des sites conservés dans les analyses en aval. En outre, une plus grande rigueur peut être obtenue en utilisant des programmes de prédiction miRNA supplémentaires (voir ci-dessus) et en incluant uniquement des cibles communes à tous les algorithmes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Classez les targetomes résultants selon les catégories d'Ontologie Gene à l'aide de la suiteToppGene 20 pour évaluer l'enrichissement des voies communes à chaque miRNA.<ol>
<li>Collez la liste des cibles obtenues à partir de l'étape 1.4.1 dans la fenêtre « Ensemble de gènes de formation », en utilisant le symbole HGNC comme type d'entrée. Cliquez sur Soumettre 'gt; Démarrer. Le programme fournira un tableau de sortie montrant les catégories de « Go » les plus importantes pour la liste des gènes saisies(figure supplémentaire 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour établir enfin la contribution de chaque miRNA à la régulation d'une voie commune ou d'un processus cellulaire (dans ce cas, régulation de la chromatine), vérifiez chaque targetome obtenu à l'étape 1.4.1 par rapport à la liste complète des gènes impliqués dans le processus cellulaire spécifique ( c.-à-d., régulation de la chromatine), en utilisant la fonction de diagramme de Venn fournie dans le site Web de bioinformatique et de génomique évolutive http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. REMARQUE: Ce programme permet l'intersection de plusieurs groupes en même temps (figure 3). Les cibles uniques spécifiques fournies par chaque miRNA sont ensuite annotées et sélectionnées pour des expériences fonctionnelles en aval.<ol>
<li>Dans la première page du programme, téléchargez ou copiez/collez la liste si les ARN cibles pour chaque miRNA ou l'intérêt pour les fenêtres respectives. Nommez chaque liste avec un identifiant unique.</li>
			<li>Cliquez sur Soumettre. Le programme fournira une sortie visuelle d'un diagramme de Venn avec un nombre de gènes dans chaque secteur, ainsi qu'une liste complète des ARNM pour chaque sous-ensemble et combinaisons d'intersections.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Assemblage de modules miRNA dans un cluster transgénique polycistronique
<ol><li>
Préparation de l'échafaudage transgénique à base de locus de cluster miR-17-92
	<ol>
<li>Obtenir la séquence de nucléotide du cluster miR-17-92 à partir du navigateur du génome Ensembl21. Sélectionnez la séquence « noyau » de la paire de base de 800 englobant les six épingles à cheveux miRNA codées du locus et au moins 200 nucléotides en amont (5') et en aval (3') de la séquence centrale.</li>
		<li>Collez la séquence ci-dessus dans n'importe quel programme d'édition de mots.</li>
		<li>Définissez la séquence de chacune des six épingles à cheveux indigènes en les récupérant dans miRBase22. Marquez chacune de ces séquences dans la durée de la séquence « de base » précédemment identifiée. Toutes les séquences entre chaque épingle à cheveux représentent des séquences d'espaceur, qui sont importantes pour le traitement correct du transgène.</li>
		<li>Retirez les séquences d'épingles à cheveux indigènes de la séquence « de base », à l'exception des 3-5 nucléotides aux extrémités de 5' et 3' de chaque épingle à cheveux, qui serviront d'accepteur pour les nouvelles épingles à cheveux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construire un nouveau transgène codant plusieurs miARN de choix
	<ol>
<li>Obtenir des séquences en épingle à cheveux de miRNAs destinés à être surexprimés dans le transgène de miRBase. Notez soigneusement les nucléotides spécifiques qui sont les sites de clivage microprocesseur.</li>
		<li>Remplacer les épingles à cheveux enlevées (étape 2.1.4) par les séquences en épingle à cheveux des miARN désirés obtenues à l'étape 2.2.1.</li>
		<li>Ajouter les séquences de restriction souhaitées dans les deux régions de flanc du transgène pour faciliter la subclonage dans les vecteurs de livraison de choix. Vérifier que les séquences de restriction choisies ne sont pas présentes dans la séquence elle-même.</li>
		<li>Pour les contrôles négatifs, utilisez des séquences brouillées de 20 nucléotides pour remplacer la séquence naturelle de 20 nucléotides de chaque miRNA mature. Générez ces séquences brouillées à l'aide d'un outil en ligne tel que https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vérification de la structure bidimensionnelle du transgène
	<ol>
<li>Copiez la séquence transgénique complète dans le logiciel de prédiction de la structure de l'ARN RNAweb Fold23.</li>
		<li>En utilisant les paramètres de programme standard, cliquez sur Procéder.</li>
		<li>Analyser la sortie graphique, en particulier pour la présence d'épingles à cheveux bien définies et la présence de structures de tige à double brin au moins 11 nucléotides proximal au site de clivage microprocesseur. Aussi, recherchez l'absence de points de ramification dans les séquences d'épingle à cheveux (Figure 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Obtenir des Transgènes par synthèse d'ADN
<ol><li>Après la conception et la validation en silico du cluster miRNA chimérique, obtenir la séquence de travail en utilisant la synthèse de l'ADN des fournisseurs commerciaux24 et procéder au clonage en aval dans les vecteurs et la livraison de transgènes. Nous avons utilisé des vecteurs lentiviraux pour l'accouchement in vitro10 et des virus adéno-associés (AAV) pour la livraison intracrânienne in vivo25.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne signalent aucun conflit d'intérêts.

Ce protocole est basé sur l'idée que plutôt que de fonctionner isolément, les miARN sont biologiquement pertinents en travaillant en groupes, et ces groupes sont transcriptionnellement déterminés par des contextes cellulaires spécifiques26. Pour justifier cette approche d'un point de vue translationnel, un protocole de suivi qui permet de recréper ce modèle multi-miRNA dans les cellules/tissus est introduit. Ceci est possible en profitant de la biogenèse relativement simple des miRNAs, par qui la ...

miRNAs offrent une occasion inégalée pour le développement d'une approche de thérapie génique large à de nombreuses maladies1,2,3, y compris le cancer4,5. Ceci est basé sur plusieurs caractéristiques uniques de ces molécules biologiques, y compris leur petite taille6, biogenèse simple7, et la tendance naturelle à fonctionner en association8. Beaucoup de maladies sont caractérisées par des modèles spécifiques d'expression miRNA, qui convergent souvent vers la régulation des fonctions biologiques complexes9. Le but de cette méthode est d'abord de définir une stratégie pour identifier les groupes de miARN qui sont synergiquement pertinents pour des fonctions cellulaires spécifiques. Par conséquent, il fournit une stratégie pour le rétablissement de ces combinaisons miRNA dans les études et les applications en aval.
Cette méthode permet l'analyse fonctionnelle de plusieurs miARN à la fois, en s'appuyant sur leur ciblage simultané d'un grand nombre de MARN, récapitulant ainsi les paysages complexes des maladies. Cette approche a été récemment employée pour définir un groupe de trois miRNAs que 1) sont simultanément downregulated dans le cancer du cerveau et 2) montrent un modèle fort de co-expression pendant la différenciation neurale aussi bien qu'en réponse au stress génotoxique par rayonnement ou un Agent alkylating d'ADN. La réexpression combinatoire de ce module de trois miARN par la méthode de regroupement décrite ci-dessous entraîne une interférence profonde avec la biologie des cellules cancéreuses et peut être facilement utilisée comme stratégie de thérapie génique pour les études précliniques10. Ce protocole peut être particulièrement intéressant pour ceux qui participent à la recherche miRNA et à ses applications translationnelles.

<table><tbody><tr><td>0,4 % d’agarose à basse température de fusion&nbsp ;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0,45 et micro ; Unité de filtration stérile M</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tube microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6 puits&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Souris athymiques (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Grattoir cellulaire, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Irradiateur au césium 137&nbsp ;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Core Facility (Harvard Medical School)</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hyperglycémie, pyruvate&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>solution d’éosine Y&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formol</td><td>Supplément Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches de gliome primaire humain (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Fourni par le Dr E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Cellules souches de gliome primaire humain (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Fourni par le Dr Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Vecteur lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>modèle n° 5424 R, réf. 5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Tubes à centrifuger à fond rond en polycarbonate haute vitesse&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Cellules progénitrices neurales (NPC)</td><td></td><td></td><td>Fourni par le Dr Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Système de microscope fluorescent motorisé Nikon eclipse Ti</td><td>Nikon, Japon</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>tubes PCR&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122 Boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>Petri 94/16&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&nbsp ;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant&nbsp ;</td><td>PeproTech&nbsp ;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF humain recombinant de base&nbsp ;</td><td>PeproTech&nbsp ;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>RNA Miniprep Kit</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Thermocycleur&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>micro-irradiateur guidé par l’image pour petits animaux&nbsp ;</td><td>Xstrahal Life Sciences, UK</td><td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Sorvall WX+&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>système de PCR en temps réel StepOne</td><td>Applied Biosystems&nbsp ;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>Enceinte de biosécurité SterilGARD</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td> American <td>Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek température de coupe optimale&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>réactif TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>réactif de lyse</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp ;</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower Lentivector Système d’expression&nbsp ;</td><td>Eau Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>, grade HPLC</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Xylène&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des miarn fonctionnellement associés dans le glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

La pertinence biologique des microARN (miARN) dans la santé et la maladie repose de manière significative sur des combinaisons spécifiques de nombreux miARN simultanément déréglementés plutôt que l'action d'un seul miRNA. La caractérisation de ces modules miRNAs spécifiques est une étape fondamentale dans la maximisation de leur utilisation en thérapie. Ceci est extrêmement pertinent parce que leurs attributs combinatoires peuvent être pratiquement exploités. Décrit ici est une méthode pour définir une signature spécifique de miRNA pertinente au contrôle des répresseurs oncogènes de chromatine dans le glioblastoma. L'approche définit d'abord un groupe général de miARN qui sont déréglementés dans les tumeurs par rapport au tissu normal. L'analyse est encore affinée par des conditions de culture différentielles, soulignant un sous-groupe de miARN qui sont co-exprimés simultanément au cours d'états cellulaires spécifiques. Enfin, les miARN qui satisfont ces filtres sont combinés en un transgène polycistronique artificiel, qui est basé sur un échafaudage de gènes de grappes de miARN naturellement existants, puis utilisés pour la surexpression de ces modules miRNA dans les cellules réceptrices.

Cette méthode a permis la caractérisation d'un module de trois miRNAs qui sont uniformément downregulated dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimées spécifiquement pendant la différenciation neuronale (figure 1) et impliquées dans la réponse de survie de tumeur après thérapie (Figure 2). Ceci est accompli en régulant une voie répressive oncogène complexe de chromatine. Ce modèle de coexpression suggérait une forte activit...

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Ce protocole permet la modulation simultanée de nombreux ARN micro dans les cellules eucaryotes et est basé sur une méthode très simple et flexible qui minimise les étapes de clonage moléculaire. Cette technique a des implications pour l’étude des interactions fonctionnelles de micro ARN in vitro, mais plus important encore, elle fournit une plate-forme pour une utilisation plus efficace des ARN micro en thérapie. Nous l’avons principalement développé et utilisé dans le contexte du cancer du cerveau, mais il s’applique à toutes les maladies où de multiples altérations de l’expression des gènes sont impliquées.Nous avons testé nos gènes trans artificiels dans d’autres modèles tels que les lignées de cancer du sein et de la thyroïde montrant la reproductibilité de cette technique. Les connaissances de base en bioinformatique et en biologie micro ARN sont utiles pour ce protocole, mais pas indispensables. Une approche bioinformatique est importante pour définir les combinaisons pertinentes de micro ARN et le TRK-11, tandis que la familiarité avec le traitement de micro ARN de façon mesurable est importante pour comprendre comment ces différents micro ARN peuvent être assemblés en grappes artificielles d’ADN qui peuvent être traitées avec succès une fois stables aux cellules spécifiques.Pour enrober le plat, dissoudre d’abord la poly-D-lysine dans l’eau à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Verser la solution dans le plat à la quantité d’un millilitre de solution par surface de 25 centimètres carrés. Faites tourbillonner le plat pour vous assurer de la couverture de l’ensemble du plat.Après six heures aspirer la solution poly-D-lysine et rincer deux fois avec PBS. Plaques de cellules souches neurales humaines dans la quantité de 100 000 cellules par cinq millilitres du milieu, soit dans le milieu des cellules souches, milieu de différenciation astrocytique ou milieu de différenciation neuronale. Après le placage cellulaire, placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant une semaine et procéder à l’analyse de l’expression micro ARN selon le manuscrit.Pour la culture gbm-34 glioblastoma cellules souches comme, commencer par une fois dix à la cinquième cellule et cinq millilitres de milieu neurobasal dans un flacon de fixation de 25 centimètres carrés bas. Placez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. 48 heures après le placage, ajouter des concentrations de doublement de l’adn alkylating agent temozolomide tous les sept jours.Commencez par l’ajout de cinq micromolaires TMZ complétés en cinq millilitres moyens pendant cinq jours. Après cinq jours, retirer le milieu et remplacer par un milieu frais sans témozolomide pour permettre aux cellules survivantes de récupérer. Après 48 heures, ajouter 10 temozolomide micromolaire et incuber pendant encore cinq jours.Répétez le traitement par témozolomide jusqu’à ce que la concentration d’au moins 100 micromolaires soit atteinte et que les cellules deviennent résistantes au médicament. Après l’induction de la résistance, les cellules se trouvent à l’aide de 1 millilitre de réageni de lyse. Extraire l’ARN total et analyser l’expression des micro ARN spécifiques selon le manuscrit.Pour obtenir le targetome prévu de chaque micro ARN précédemment défini, utilisez des outils de prévision de ciblage micro ARN. À partir de la première page de TargetScan, sélectionnez le micro ARN d’intérêt dans le menu décrocheurs pré-rempli. Cliquez sur le bouton soumettre.Téléchargez la liste des cibles qui en résulte en tant que feuille de calcul à l’aide du lien de table de téléchargement. Pour réduire les risques de prédictions faussement positives, n’incluez que les cibles dans la colonne des sites conservés et l’analyse en aval. D’autres programmes de prédiction de micro ARN obtiennent une plus grande rigueur et n’incluent que des cibles communes à tous les algorithmes.Ensuite, ouvrez la suite ToppGene 20. Pour évaluer l’enrichissement des voies communes à chaque micro ARN, coller la liste des cibles obtenues dans la fenêtre des ensembles de gènes d’entraînement. Cliquez sur HGNC Symbol comme type d’entrée.Cliquez sur soumettre et commencer. Le programme fournit un tableau de sortie montrant les catégories GO les plus importantes pour la liste des gènes entrés. Pour enfin établir la contribution de chaque micro ARN à la régulation d’une voie commune ou d’un processus cellulaire, ouvrez la fonction de diagramme de venn fournie dans le site Web bioinformatique et génomique évolutionnaire.Vérifiez chaque targetome obtenu par rapport à la liste complète des gènes impliqués dans le processus cellulaire spécifique. Si les ARN messagers cibles pour chaque micro ARN d’intérêt se trouvent dans les fenêtres respectives, téléchargez la liste. Nommez chaque liste avec un identificateur unique.Cliquez sur soumettre. Le programme fournit une sortie visuelle d’un diagramme de venn avec un nombre de gènes dans chaque secteur ainsi qu’une liste complète des ARN messagers pour chaque sous-ensemble et combinaisons d’intersections. Pour regrouper les micro ARN sélectionnés en un gène trans fonctionnel, obtenir un échafaudage transgénique basé sur le locus miR-17-92.Obtenez la séquence nucléotide à partir du navigateur du génome ensembleé. Sélectionnez la séquence centrale d’environ 800 paires de base englobant les six épingles à cheveux micro ARN codées du locus et au moins 200 séquences de flanc de nucléotide en amont et en aval de la séquence centrale. Coller la séquence dans n’importe quel programme d’édition de mots.Définissez la séquence de chacune des six épingles à cheveux indigènes en les récupérant dans la base miR. Marquez chacune de ces séquences dans le cadre d’une séquence de base précédemment identifiée. Toutes les séquences entre chaque épingle à cheveux représentent des séquences d’espaceurs.Ensuite, obtenez les séquences d’épingle à cheveux de micro ARN destinés à être surex exprimés dans le gène trans à partir de la base miR. Notez soigneusement les nucléotides spécifiques qui se trouvent sur les sites de clivage micro processeur. Supprimer les séquences d’épingle à cheveux indigènes de la séquence centrale à l’exception de trois à cinq nucléotides aux extrémités cinq et vous de chaque épingle à cheveux qui servira d’accepteur pour les nouvelles épingles à cheveux.Coller les séquences en épingle à cheveux des micro ARN désirés pour remplacer les épingles à cheveux précédemment supprimées. Ajoutez les séquences de restriction souhaitées aux deux régions flanquées du gène trans pour faciliter le sous-clonage dans les vecteurs de livraison de choix. Vérifiez que les séquences de restriction choisies ne sont pas présentes dans la séquence elle-même.Pour vérifier la structure bidimensionnelle du gène trans, copiez la séquence transgénique complète dans le logiciel de prédiction de la structure de l’ARN RNA Webfold. Sélectionnez les paramètres standard du programme et cliquez sur procéder. Analyser la sortie graphique, en particulier pour la présence d’épingles à cheveux bien définies en présence de structures de tige à double brin qui sont au moins 11 nucléotides proximaux au site de clivage micro processeur.Aussi, recherchez l’absence de points de ramification dans les séquences d’épingle à cheveux. À ce stade, le gène trans est prêt à être produit par synthèse génétique et cloné dans les vecteurs de livraison souhaités. Cette méthode a permis la caractérisation d’un module de trois micro ARN qui sont constamment vers le bas réglés dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimés spécifiquement pendant la différenciation neuronale.Des modèles de co-expression des modules de micro ARN pendant le stress génotoxique ont été confirmés et ont suggéré une activité synergique forte parmi ces trois ARN micro. Le gène trans conçu pourrait simultanément récapituler l’expression des trois micro ARN dans les cellules de glioblastoma, in vitro et in vivo, avec l’interférence significative dans la biologie de tumeur et l’applicabilité translationnelle prometteuse. En outre, le faisceau transgénique était également fonctionnel dans un modèle de cancer du sein.Les exigences cruciales de ce protocole sont le maintien de la taille originale du clivage du processeur dans le gène trans. Et assurez-vous que la structure en boucle de tige des épingles à cheveux chimériques micro ARN est préservée. Avec cette méthode, nous pouvons concentrer plusieurs gènes micro ARN biologiquement actifs en séquences d’ADN très courtes qui peuvent littéralement être insérées dans n’importe quel vecteur de livraison pour une utilisation génique.Cette méthode est idéale pour étudier l’interaction fonctionnelle entre les différents micro ARN et pour interférer avec les voies cellulaires multifactorielles complexes qui nécessiteront autrement de multiples combinaisons de médicaments.

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Génétique

Nous décrivons ici un protocole efficace et polyvalent pour induire, surveiller et analyser de nouveaux glioblastomes (GBM) à l’aide d’ADN transposon injecté dans les ventricules de souris néonatales. Les cellules de la zone sous-ventriculaire, qui absorbent le plasmide, se transforment, prolifèrent et génèrent des tumeurs présentant des caractéristiques histopathologiques du GBM humain.

Transposon Mediated intégration du plasmide ADN dans le zone sous-ventriculaire de souris néonatale pour générer des modèles nouveaux de glioblastome

Les microARN jouent un rôle crucial dans le cerveau et sont des cibles potentielles pour la modélisation de la neurodégénérescence. Cependant, il est difficile de perturber les niveaux de miARN en raison de la courte longueur des miARN et de l’inaccessibilité du tissu cérébral. Cette vidéo présente une méthode de conception d’antagomir et d’administration spécifique au cerveau à l’aide d’un neuropeptide chez la souris.

Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

La dysrégulation protéomique joue un rôle important dans la propagation des gliomes infiltrant de manière diffuse, mais plusieurs protéines pertinentes restent non identifiées. Le traitement spatial numérique (DSP) offre une approche efficace et à haut débit pour caractériser l’expression différentielle des protéines candidates qui peuvent contribuer à l’invasion et à la migration des gliomes infiltrants.

Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

La barrière hémato-encéphalique est un obstacle important à l’administration de traitements pour le glioblastome, une maladie pour laquelle il n’existe aucun remède. Ici, nous rapportons une nanoplateforme thérapeutique d’oxyde de fer guidée par l’image in vivo qui peut contourner cette barrière physiologique en raison de sa taille et s’accumuler dans la tumeur.

Livraison de nanoparticules d’une charge utile d’oligonucléotide dans un modèle animal de glioblastome multiforme

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Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

Découvrez une méthode de bioinformatique pour moduler simultanément plusieurs micro-ARN dans des cellules eucaryotes et concevoir des grappes artificielles. Cette technique avance la recherche sur les interactions fonctionnelles des micro-ARN et leurs applications thérapeutiques en oncologie.

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique (Vidéo) | JoVE Journal

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

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