Name: Protocole facétoien visant à isoler lARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Découvrez une méthode de tri FACS pour isoler les cellules secondaires des glandes accessoires mâles de Drosophila. Cette technique permet l'analyse transcriptomique de ces populations cellulaires rares essentielles au succès reproducteur.

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Nous remercions les membres du laboratoire Karch, la forme de plaque de génomique iGE3, le centre de Cytométrie Flow de l'Université de Genève et le Dr Jean-Pierre Aubry-Lachainaye qui a établi le protocole pour les FACS. Nous remercions Luca Stickley pour son aide dans la visualisation des lectures sur IGV. Nous nous remercions de la permission douce de réutiliser les chiffres, et les éditeurs pour nous inciter à être créatifs avec l'écriture.
Cette recherche a été financée par l'Etat de Genève (CI, RKM, FK), le Fonds national suisse pour la recherche (www.snf.ch) (FK et RKM) et les dons de la Fondation Claraz (FK).

1. Lignes drosophila utilisées et collection d'hommes
<ol><li>Pour ce protocole, utilisez des mâles exprimant le GFP dans les SC et non dans les cellules principales. Ici, un pilote AbdB-GAL4 (décrit en référence18), recombiné avec UAS-GFP (sur le chromosome 2) est utilisé. D'autres pilotes appropriés peuvent également être utilisés. Pour l'isolement des SC dans différentes conditions mutantes, traversez la mutation en lignes contenant la ligne GFP spécifique au SC.</li>
	<li>Recueillir deux lots d'environ 25 mâles vierges sains pour chaque génotype et les vieillir à 25 oC pendant 3-4 jours en flacons avec des aliments Drosophila fraîchement préparés. REMARQUE: À mesure que l'âge, l'état d'accouplement, la nutrition et l'environnement social affectent chacun la biologie de la reproduction, des protocoles stricts doivent être suivis pour contrôler ces paramètres. Les mâles vierges sont âgés de 3 à 4 jours après l'éclosion pupal à 25 oC avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h, sur la nourriture standard de farine de maïs-agar-levure, en groupes de 20-25 mâles par flacon.</li>
</ol>2. Solutions et préparation des matériaux
<ol><li>
Préparer les solutions suivantes.
	<ol>
<li>Préparer le sérum moyen complété (SSM) : Le milieu de Drosophila de Schneider complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine.</li>
		<li>Préparer les aliquots de l'enzyme 1x trypsine (p. ex., TrypLE Express Enzyme) et les conserver à température ambiante.</li>
		<li>Préparer les aliquots de papaïne [50 U/mL] (stockés à -20 oC et décongelés une seule fois).</li>
		<li>Préparer 1x tampon de phosphate salin (PBS, stocké à température ambiante).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer plusieurs pointes de pipet arrondies par les flammes pour la dissociation physique des glandes accessoires. REMARQUE : Utilisez des conseils de faible rétention pour manipuler les glandes accessoires, car elles ont tendance à adhérer au plastique non traité. Le processus d'arrondi des flammes réduit l'ouverture de la pointe et lisse les bords de la pointe. Cela assure une dissociation efficace après la digestion peptidase sans tonte des membranes cellulaires.<ol>
<li>Couper une pointe de 200 l avec une lame pointue et la passer doucement sur une flamme pour arrondir sa pointe de sorte que l'ouverture soit plus large mais lisse pour la manipulation pendant l'étape 3.7.</li>
		<li>Réduisez l'ouverture de plusieurs bouts de 1 000 l en passant la pointe s'ouvrant près d'une flamme pendant moins d'une seconde. Faites pivoter légèrement la pointe pour éviter la surfusion ou l'engorgement. Trier les bouts faits de plus étroit à plus large. Cela peut être fait en chronométrant la vitesse de l'aspiration. Essayez de dissocier un échantillon à petite échelle d'AG pour tester l'efficacité des pointes les plus étroites. REMARQUE: Ces pointes sont essentielles à l'agitation mécanique (étapes 5.2 et 5.3). Des pointes de pipet de qualité arrondies par les flammes permettent une dissociation complète tout en préservant la viabilité des cellules. En tant que tel, ces pointes sont lavées à fond avec de l'eau à la fin de la procédure de réutilisation. Cela permet une dissociation reproductible au jour le jour.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissection des glands accessoires
<ol><li>Mettre 20 à 25 Drosophila mâles dans un plat en verre sur la glace.</li>
	<li>Disséquer 1 mâle dans SSM. Enlevez son appareil reproducteur et effacez la paire accessoire de glande de tous les autres tissus en dehors du conduit éjaculatoire. REMARQUE: Enlever les testicules parce que le sperme libéré peut créer des amas et perturber le processus de dissociation. Retirez l'ampoule éjaculatoire, ce qui rend la manipulation difficile lorsqu'elle flotte.</li>
	<li>Avec les forceps, transférer les glandes accessoires sur une plaque de verre remplie de SSM à température ambiante. Répétez les étapes 3.2-3.3 20 fois pour obtenir un lot de 20 paires de glandes dans SSM. REMARQUE: Ces étapes seront réalisées en 15 à 20 min. Les AG devraient avoir l'air en bonne santé, et les mouvements péristaltiques de la couche musculaire autour des glandes devraient être visibles. Le GFP peut être surveillé à l'aide d'un microscope fluorescent.</li>
	<li>Transférer les glandes accessoires à 1x PBS pour un lavage de 1-2 min à température ambiante. REMARQUE: Pour une meilleure dissociation, il est impératif de rincer les glandes avec PBS. La durée de cette étape, cependant, devrait être limitée car les cellules montrent des signes de stress dans PBS ; cellules secondaires dissociées dans PBS rapidement gonfler et mourir.</li>
	<li>Diluer 20 'L papain [50 U/mL] en 180 'L d'enzyme 1x trypsine pour obtenir la solution de dissociation (pour monter ou descendre garder 9 'L d'enzyme de trypsine et 1 'L de papaïne pour chaque mâle). Avec des forceps, transférer les glandes accessoires à cette solution.</li>
	<li>Isoler la pointe des glandes accessoires (contenant des cellules secondaires) de la partie proximale. Utilisez des pincements fins pour pincer fermement le milieu d'un lobe glandulaire et couper avec la pointe pointue d'un deuxième forceps. Enlever la partie proximale des glandes accessoires et le conduit éjaculatoire pour améliorer la dissociation et réduire le temps de tri cellulaire. REMARQUE: La disséquer la partie distale de 20 paires de glandes prendra 15 à 20 min et la digestion par des peptidases commencera ainsi à température ambiante.</li>
	<li>Après que toutes les extrémités de glande aient été disséquées, les transférer dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pointe spéciale de 200 l de pipet préparée à l'étape 2.2.1. Il doit être large, arrondi et humide avant de manipuler les glandes. REMARQUE: Pour pipet tissu de glande accessoire, les pointes doivent toujours être pré-humide avec la solution appropriée (enzyme de trypsine ou SSM, garder un tube de chacun à cet effet). Rincer soigneusement les pointes entre les échantillons pour éviter la contamination.</li>
</ol>4. Digestion des tissus
<ol><li>Placer le microtube dans un shaker de 37 oC pendant 60 min, en se balançant à 1 000 tr/min. REMARQUE: L'agitation et le temps de digestion sont essentiels pour une dissociation réussie. Une digestion plus courte ou immobile donnera une mauvaise dissociation, probablement parce que la couche musculaire externe et le liquide séminal visqueuse intérieur protègent les cellules accessoires de la glande contre les peptidases.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de SSM à température ambiante pour arrêter la digestion et procéder immédiatement à l'étape 5.</li>
</ol>5. Dissociation mécanique des cellules
<ol><li>À l'aide d'une large pointe arrondie de 1 000 l, préhumide avec le SSM, transférer l'échantillon dans une plaque de 24 puits. Surveillez la fluorescence du GFP sous le microscope : la plupart des extrémités des glandes devraient sembler intactes et quelques SC devraient être détachés.</li>
	<li>À l'aide d'une pointe arrondie et étroite générée à l'étape 2.2.2, le tuyau et le tuyau de 3 à 5 fois pour perturber le tissu de glande accessoire. REMARQUE: Surveillez la fluorescence pour vous assurer que les gros trafiques de tissus ont été brisés. Répétez l'étape 5.2 si ce n'est pas le cas.</li>
	<li>À l'aide d'une pointe de pipet arrondie très étroite (générée à l'étape 2.2.2), la tuyauterie monte et descend 1-2 fois. REMARQUE: Seules les cellules individuelles doivent être visibles après l'étape 5.3. L'utilisation de plaques de 24 puits est recommandée parce qu'elles permettent une surveillance facile du processus. Lorsque quelques échantillons ont été traités et ont donné un résultat satisfaisant (cellules secondaires à la recherche saine parfaitement dissocié), les étapes de pipetage seront effectuées dans le microtube.</li>
	<li>Attendez au moins 15 min pour laisser les cellules se déposer au fond du puits et enlever l'excès de SSM pour réduire le temps de tri. REMARQUE: Laisser les cellules s'installer s'est avéré supérieur à d'autres méthodes comme la centrifugation, et permet une dernière inspection visuelle des cellules juste avant LE CAS.</li>
	<li>Pipet les cellules dans un tube propre 1,5 ml et la piscine des échantillons identiques (deux lots de 20 mâles pour chaque condition). Rincer les puits avec SSM pour récupérer les dernières cellules, et les épilerons dans le tube (utiliser un petit volume).</li>
	<li>Dans 1,5 ml de microtubes, ajouter 300 l de solution de lysis cellulaire et 1 l de Proteinase K [50 g/L] (solutions fournies dans le kit de purification de l'ARN, voir étape 7). Préparer deux tubes pour chaque échantillon (un pour les MC et un pour les SC).</li>
</ol>6. FACS (Tri cellulaire activé par fluorescence)
<ol><li>Ajouter un marqueur de viabilité à chaque échantillon à trier quelques minutes avant le tri (0,3 mM Draq7). MISE EN GARDE: Draq7 doit être traité avec prudence.</li>
	<li>
Trier une population homogène de cellules secondaires vivantes (cellules gFP-positives, Draq7-négatives). Dans un autre microtube, trier une population de cellules principales (plus petites, GFP-négatives, Draq7-négatives cellules). Utilisez la stratégie de gating FACS suivante : REMARQUE : Réglez la pression du trieur cellulaire à 25 PSI et passez les cellules à travers une buse de 100 m. Le taux de tri est d'environ 2 000 cellules/s.<ol>
<li>Exclure les débris et sélectionner les cellules totales en fonction du FSC-SSC (figure 2E) afin d'exclure les débris.</li>
		<li>Exclure les cellules mortes. Excitez Draq7 avec un laser de 640 nm et collectez la fluorescence émise avec un filtre à bande 795/70. Gate Draq7-positifs cellules(Figure 2F).</li>
		<li>Supprimer les doublettes à l'aide d'un double gating sur SSC-H vs SSC-W et FSC-A vs FSC-H (Figure 2H). REMARQUE: Exclure rigoureusement les doublets cellulaires à l'aide d'un double gating, afin de réduire la contamination des cellules principales.</li>
		<li>Trier les cellules positives de 550 GFP dans un microtube de 1,5 ml avec le tampon Lysis et la protéase K. Cette population est considérée comme des cellules secondaires (SC, figure 2G). Excitez GFP à 488 nm et collectez la fluorescence émise avec un filtre 526/52 bande-pass.</li>
		<li>Trier 1 000 cellules GFP-négatives, homogènes et de petite taille, dans un microtube de 1,5 ml avec tampon Lysis et Proteinase K. Cette population est considérée comme des cellules principales (MC, figure 2G).</li>
		<li>Vortex tous les échantillons. REMARQUE: De 40 mâles (40 x 80 SC et 3 200 cellules secondaires), 600 à 800 cellules secondaires vivantes de singlet sont obtenues (environ 20-25% de récupération). Arrêtez de trier environ 550 SC et 1 000 MC pour normaliser les échantillons.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Extraction d'ARN
REMARQUE: Nous avons utilisé Epicentre MasterPure ARN Purification Kit pour l'extraction de l'ARN, avec les adaptations suivantes. D'autres kits peuvent être utilisés tant que le rendement est assez élevé pour préparer une bibliothèque pour le séquençage à partir de 500 cellules (2 ng ARN a été utilisé ici).
<ol><li>Chauffer les échantillons à 65 oC pendant 15 min et le vortex toutes les 5 minutes pour compléter la lyse cellulaire.</li>
	<li>Placer des échantillons sur la glace pendant 5 min. Suivez les recommandations du fabricant concernant les précipitations d'acides nucléiques (parties « Précipitations d'acides nucléiques totaux » et « Élimination de l'ADN contaminant des préparations totales d'acide nucléique »).</li>
	<li>Suspendre le granule d'ARN dans 10 l de tampon TE sans RNase.</li>
	<li>Ajouter l'inhibiteur de la RNase (facultatif).</li>
	<li>Entreposer les échantillons à -80 oC.</li>
</ol>8. Contrôle de la qualité de la quantité, de la qualité et de la spécificité de l'ARN
<ol><li>Estimer la qualité et la concentration de l'ARN. En raison du petit volume et de la concentration, utilisez l'ARN 6000 pico chips ici. L'ARN de bonne qualité est défini comme non dégradé, visible comme une ligne de base faible avec des pics aigus correspondant aux ARR.</li>
	<li>
RT-qPCR pour contrôler l'identité des cellules triées
	<ol>
<li>Effectuer la transcription inverse avec 2 ng de ARN totaux en utilisant des hexamers aléatoires comme amorces. Effectuer la RT sur l'ARN cellulaire secondaire et l'ARN des cellules principales. REMARQUE : Les CDNA peuvent être dilués, aliquoted, et conservés congelés pour une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Effectuer en temps réel quantitative PCR en utilisant des paires d'apprêt appropriés pour quantifier les gènes d'entretien ménager (alpha-Tubulin, 18S rRNA), gènes spécifiques à des cellules secondaires (MSA, Rab19, Abd-B) et gène spécifique à la cellule principale (Peptide sexe).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Séquençage (préparation de la bibliothèque de l'ADNc, séquençage et analyse des données)
<ol><li>Utilisez 2 ng d'ARN totaux pour synthétiser les CDNA avec des amorces polydT. Utilisez la technologie SMARTer pour les amplifier pour l'amplification.</li>
	<li>Utilisez un kit Nextera XT pour préparer la bibliothèque.</li>
	<li>Séquence utilisant multiplexé, 100 nucléotides simples lit le séquençage (même si 50 nucléotides lit sont appropriés pour la plupart des fins) pour produire environ 30 millions de lectures pour chaque échantillon.</li>
</ol>10. Analyse des données
<ol><li>Exécuter FastQC.</li>
	<li>Utilisez l'aligneur STAR pour cartographier les lectures sur le génome de référence Drosophila d'UCSC dm6 et générer des fichiers .bam. Utilisez Integrative Genomics Viewer (IGV) pour visualiser les lectures sur le navigateur du génome.</li>
	<li>Utilisez HTSeq pour effectuer des comptages génétiques.</li>
	<li>Utilisez la méthode Trimmed Mean of M-values (TMM) pour normaliser le nombre de gènes22. Utilisez edgeR pour effectuer une analyse statistique de l'expression différentielle, des parcelles MA et de l'APC.</li>
	<li>Pour l'analyse de l'expression génique et les statistiques, utilisez le modèle linéaire général, le test F de quasi-probabilité avec le taux de détection des fausses (FDR) et la correction de Benjamini et Hochberg (BH).</li>
</ol>

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<li>Leiblich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-+and+mating-dependent+secretory+cell+growth+and+migration+in+the+Drosophila+accessory+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).</li>
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<li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont aucune divulgation.

Les méthodes de dissociation cellulaire du tissu Drosophila comme les disques imaginaires sont déjà décrites23. Nos tentatives d'utiliser simplement ces procédures sur les glandes accessoires ont échoué, nous encourageant à développer ce nouveau protocole. La digestion de la protéase et la trituration mécanique ont été des étapes critiques que nous avons dépannées pour le succès de la procédure, et nous avons donc placé de nombreuses notes dans les sections 2 à 5 pour aider les expériment...

Les organes sont constitués de plusieurs types de cellules, chacun e avec des fonctions discrètes et exprimant parfois des ensembles très différents de gènes. Pour obtenir une compréhension précise du fonctionnement d'un organe, il est souvent essentiel d'étudier chaque type de cellule distinct qui constitue cet organe. L'une des principales méthodes utilisées pour explorer la fonction possible est l'analyse de transcriptome. Cette méthode puissante fournit un instantané de l'expression du gène dans une cellule, pour révéler les processus actifs et les voies. Cependant, ce type d'analyse est souvent difficile pour les populations de cellules rares qui doivent être purifiées à partir de cellules voisines beaucoup plus abondantes. Par exemple, la glande accessoire mâle Drosophila est un organe composé principalement de deux types de cellules sécrétrices. Comme le plus rare des deux types de cellules ne comprend que 4% des cellules de cette glande, l'utilisation d'une analyse de transcriptome spécifique de type cellulaire n'avait pas été utilisée pour aider à déterminer la fonction de ces cellules.
Les glandes accessoires (AG) sont des organes de l'appareil reproducteur masculin chez les insectes. Ils sont responsables de la production de la plupart des protéines du liquide séminal (protéines de liquide séminal (SFP) et protéines accessoires de glande (ACPs)). Certains de ces SFP sont connus pour induire les réponses physiologiques et comportementales chez les femelles accouplées, communément appelée la réponse post-accouplement (PMR). Parmi les RPM, mentionnons : une augmentation du taux d'ovulation et de ponte, le stockage et la libération de spermatozoïdes, un changement de l'alimentation des femmes et une diminution de la réceptivité des femmes aux mâles qui courtisent secondairement1,2. Comme les insectes ont un impact sur de nombreux problèmes sociétaux majeurs, de la santé humaine (vecteurs de maladies mortelles) à l'agriculture (les insectes peuvent être des ravageurs, mais sont essentiels à la pollinisation et à la qualité du sol), la compréhension de la reproduction des insectes est un domaine de recherche important. L'étude des AG et des ACP a été avancée de manière significative avec l'organisme modèle Drosophila melanogaster. Ces études ont mis en évidence le rôle des AG et certaines des protéines individuelles qu'ils produisent dans la création de la PMR, impactant le travail dans d'autres espèces comme le vecteur de la maladie Aedes aegypti3,4, et d'autres insectes1 ,5. En outre, comme les AG sécrètent les constituants du fluide séminal1,6 ils sont souvent considérés comme l'analogue fonctionnel de la prostate des mammifères et la vésicule séminale. Cette similitude de fonction combinée avec des similitudes moléculaires entre les deux tissus-types, ont fait les AGs un modèle pour la prostate chez les mouches7.
Chez le mâle Drosophila, il y a deux lobes de glandes accessoires. Chaque lobe peut être considéré comme une structure en forme de sac composée d'une monocouche de cellules sécrétrices entourant un lumen central, et enveloppée par des muscles lisses. Comme mentionné ci-dessus, il existe deux types de cellules sécrétrices morphologiquement, développementale et fonctionnellement distinctes qui composent cette glande : les cellules principales en forme de polygonale (qui représentent environ 96 % des cellules) et les cellules secondaires plus grandes et rondes (SC) (qui composent le 4 % restants des cellules, soit environ 40 cellules par lobe). Il a été démontré que les deux types de cellules produisent des ensembles distincts d'ACP pour induire et maintenir le PMR. La plupart des données obtenues à ce jour mettent en évidence le rôle d'une seule protéine dans le déclenchement de la plupart des comportements caractéristiques de la PMR. Cette protéine, le peptide sexuel, est un petit peptide d'acide aminé de 36 qui est sécrété par les cellules principales8,9,10. Bien que le peptide sexuel semble jouer un rôle majeur dans le PMR, d'autres ACP, produits par les cellules principales et secondaires, ont également été montrés pour affecter divers aspects de la PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Par exemple, d'après nos connaissances actuelles, les SC, par l'intermédiaire des protéines qu'ils produisent, semblent être nécessaires pour la perpétuation de la signalisation SP après le premier jour18.
Étant donné la rareté des SC (seulement 80 cellules par mâle), toutes nos connaissances sur ces cellules et les protéines qu'ils produisent proviennent de la génétique et des approches candidates. Jusqu'à présent, seule une liste relativement petite de gènes s'est avérée spécifique à SC. Cette liste comprend la protéine homéodomaine defectiveré proventriculus (Dve)19, l'ARNlM MSA20, Rab6, 7, 11 et 1921, CG1656 et CG1757511, 15,21 et le facteur de transcription homéobox Abdominal-B (Abd-B)18. Précédemment, nous avons montré qu'un mutant déficient pour l'expression d'Abd-B et de l'ARNlAR MSA dans les cellules secondaires(iab-6cocuD1 mutant) raccourcit la durée de la PMR de 10 jours à un seul jour12 , 18 ans, états-unis qui , 20. Ce phénotype semble être causé par le stockage incorrect de SP dans l'appareil reproducteur féminin12,18,20. Au niveau cellulaire, les cellules secondaires de ce mutant montrent une morphologie anormale, perdant leurs structures caractéristiques de type vacuole18,20,21. En utilisant cette ligne mutante, nous avons précédemment essayé d'identifier les gènes impliqués dans la fonction SC en comparant les profils transcriptionnels des AG entiers de type sauvage ou de glandes accessoires mutantes12. En outre, d'autres laboratoires ont montré que le nombre de SC, la morphologie et la teneur en vacuolateur dépendent de l'alimentation masculine, le statut d'accouplement et l'âge21,25,26.
Bien que des progrès positifs aient été réalisés à l'aide de ces approches, un transcriptome complet de SC était loin d'être atteint. La rareté de ces cellules dans cet organe a rendu difficile de progresser plus loin, même à partir de cellules de type sauvage. Pour tester l'expression des gènes, les changements dans ces cellules après des stimuli environnementaux particuliers seraient encore plus difficiles. Ainsi, une méthode pour isoler et purifier l'ARN SC qui était assez rapide et simple pour fonctionner dans différents milieux génétiques et conditions environnementales était nécessaire.
Les gènes Abd-B et MSA nécessitent un exhausteur spécifique de 1,1 kb du complexe Bithorax Drosophila (appelé l'améliorateur D1) pour leur expression dans les SC1,20. Cet exhausteur a déjà été utilisé pour créer un pilote GAL4 qui, lorsqu'il est associé à un UAS-GFP, est capable de conduire l'expression GFP forte spécifiquement dans les SC. Ainsi, nous avons utilisé cette ligne comme base pour un protocole FACS pour isoler ces cellules de type sauvage et iab-6cocuD1 AGs). Comme les SC mutants iab-6cocuD1 présentent une morphologie cellulaire différente, nous montrons que ce protocole peut être utilisé pour isoler les cellules pour la détermination de leur transcriptome de ce type de cellule rare dans des conditions très différentes.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 24 puits</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>Microscope binoculaire pour la dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jumelles avec source lumineuse pour GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Draq7 0,3 mM</td><td>BioStatus</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes en plastique 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td></td></tr><tr>Pince <td></td><td></td><td></td>à<td>dissection fine</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>inactivé par la chaleur avant utilisation</td></tr><tr><td>Boîtes en verre pour la dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seau</td><td></td><td></td><td></td>à glace</tr><tr><td>ImProm-II Système de transcription inverse</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification d’ARN MasterPure</td><td>Epicentre</td><td>MCR85102</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT kit</td><td>illumina</td><td></td><td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td></td><td></td><td>50U/mL stock</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>fait maison</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td></td><td></td><td></td>PolydT</tr><tr><td>Amorces hexamères aléatoires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARN 6000 Pico kit</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Gibco</td><td>21720-001</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer kit de synthèse d’ADNc</td><td>Takara</td><td></td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td></tr><tr><td>SYBR select Master mix for CFX</td><td>appliqué biosystèmes</td><td>4472942</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Hangzhou Allsheng intruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 1250 &mu ; Pointe graduée en L</td><td>Starlab</td><td>S1161-1820</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 200 &mu ; L pointe biseautée</td><td>Starlab</td><td>S1161-1800</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocole facétoien visant à isoler l'arn des cellules secondaires des glandes accessoires mâles drosophila

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Pour comprendre la fonction d'un organe, il est souvent utile de comprendre le rôle de ses populations cellulaires constituantes. Malheureusement, la rareté des populations cellulaires individuelles rend souvent difficile l'obtention de suffisamment de matériel pour les études moléculaires. Par exemple, la glande accessoire du système reproducteur mâle Drosophila contient deux types distincts de cellules sécrétrices. Les cellules principales représentent 96% des cellules sécrétrices de la glande, tandis que les cellules secondaires (SC) constituent les 4% restants des cellules (environ 80 cellules par mâle). Bien que les deux types de cellules produisent des composants importants du liquide séminal, seuls quelques gènes sont connus pour être spécifiques aux SCs. La rareté des SC a, jusqu'ici, entravé l'étude transcriptomic d'analyse de ce type important de cellules. Ici, une méthode est présentée qui permet la purification des SC pour l'extraction et le séquençage de l'ARN. Le protocole consiste d'abord à disséquer les glandes de mouches exprimant un journaliste SC-spécifique GFP, puis soumettre ces glandes à la digestion de la protéase et la dissociation mécanique pour obtenir des cellules individuelles. Après ces étapes, les cellules individuelles, vivantes, marquées gFP sont triées à l'aide d'un trieur de cellules activés fluorescentes (FACS) pour la purification de l'ARN. Cette procédure donne des ARN spécifiques à SC à partir de 40 mâles par condition pour le séquençage EN aval de RT-qPCR et/ou d'ARN au cours d'une journée. La rapidité et la simplicité de la procédure permet de déterminer les transcriptomes de nombreuses mouches différentes, de différents génotypes ou conditions environnementales, dans un court laps de temps.

Le protocole présenté ici permet à un expérimentateur d'isoler les cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila et d'extraire leur ARN au cours d'une seule journée (Figure 1).
Nous utilisons la construction Abd-B-GAL4 18 pour étiqueter les cellules secondaires (SC) mais pas les cellules principales (MC) avec GFP (Figure ...

Ici, nous présentons un protocole pour dissocier et trier une population cellulaire spécifique des glandes accessoires mâles de Drosophila (cellules secondaires) pour le séquençage d'ARN et RT-qPCR. L'isolement cellulaire est accompli par la purification FACS des cellules secondaires GFP-exprimant après un processus multiétape-dissociation exigeant la dissection, la digestion de protéases et la dispersion mécanique.

Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Cette méthode permet une analyse transcriptomique d’une population cellulaire rare de la glande accessoire mâle Drosophila, appelée cellules secondaires, et elle découvre les gènes qui les rendent critiques pour le succès reproducteur. Au cours d’une journée, cette technique permet le tri des cellules secondaires de différents génotypes et l’extraction de l’ARN total pour le séquençage qPCR ou ARN ultérieur. Parfois, les projets sont limités par la rareté du matériel de démarrage.Cette méthode peut fournir la base pour d’autres groupes confrontés au défi de travailler avec une population de cellules rares. Parce que la procédure doit accumuler 40 glandes, il est important de pratiquer les dissections. La préparation des pointes de pipette maison est également importante, et ainsi vous devriez le visualiser sur la vidéo comment le faire et préparer à l’avance.Avant de commencer la procédure, coupez et flambez autour, larges, 200 microlitres conseils pour manipuler les glandes, et passer l’ouverture de pointe de multiples pointes de 1000 microlitres près d’une flamme pendant moins d’une seconde pour rétrécir les ouvertures. Ensuite, trier les pointes modifiées de plus étroite à plus large en fonction de leur vitesse d’aspiration. Pour la dissection des glandes accessoires, placez 20 à 25 drosophiles mâles dans un plat en verre sur la glace, et utilisez des forceps et un microscope à dissection pour enlever l’appareil reproducteur d’une mouche mâle.Effacer la paire de glandes accessoires de tous les autres tissus, y compris les testicules et l’ampoule éjaculatoire, et transférer les glandes accessoires à une plaque de verre contenant du sérum complété milieu à température ambiante. Lorsque 20 paires de glandes accessoires ont été recueillies, laver les glandes dans un plat de PBS pendant une à deux minutes à température ambiante. À la fin du lavage, transférer les glandes à la solution de dissociation fraîchement préparée, et utiliser des forceps pointus sous un microscope disséquant pour pincer fermement le milieu d’un lobe glandulaire.À l’aide d’une deuxième paire de forceps, couper le tissu avec la pointe pointue pour séparer la région proximale de la glande accessoire et le conduit éjaculatoire de la partie de la glande contenant des cellules secondaires. Coupez les glandes de sorte que les peptidases puissent atteindre les cellules qui sont autrement protégées par la couche musculaire externe et par le fluide séminal visqueux dans le lumen de la glande. Ensuite, utilisez une pointe de pipette pré-humide, arrondie par la flamme, large et de 200 microlitres pour transférer les glandes dans un tube de 1,5 millilitre.Pour la digestion des tissus, placez le tube dans un shaker de 37 degrés Celsius pendant 60 minutes à 1000 rotations par minute. À la fin de l’incubation, arrêter la digestion avec un millilitre de milieu complété par sérum, et utiliser une pointe de pipette pré-humide, arrondie par la flamme, large, 1000 microlitres pour transférer les échantillons dans une assiette de 24 puits. Vérifiez l’expression de leur GFP par les cellules au microscope fluorescent.La plupart des extrémités de glande devraient sembler intactes, et quelques cellules secondaires devraient être détachées. Utilisez une pointe de pipette arrondie, étroite, de 1000 microlitres pour triturer doucement les cellules trois à cinq fois pour perturber le tissu accessoire de la glande. Ensuite, utilisez une pipette très étroite, arrondie, de 1000 microlitres pointe une à deux fois pour individualiser les cellules.Laisser les cellules se contenter de 15 minutes. Confirmez que les cellules semblent saines au microscope et retirez l’excès de milieu. Ensuite, transférez les cellules dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et rincez les puits avec un milieu frais pour récupérer les cellules restantes.La construction Abd-B-GAL4 peut être utilisée dans ces expériences pour étiqueter les cellules secondaires mais non principales avec GFP. Dans cette étude, les deux types de cellules ont été triés à partir de type sauvage et iab-6cocuD1 glandes accessoires mutantes. Ce mutant D1 n’a pas l’expression des transcriptions Abd-B et MSA, qui affectent le développement des cellules secondaires, la morphologie et la fonction.Après la dissociation cellulaire, facs est utilisé pour sélectionner les cellules vivantes basées sur DRAQ7, et le niveau de fluorescence GFP est utilisé pour isoler les cellules secondaires et les cellules principales. L’ARN est extrait de chaque population cellulaire et ajusté à deux nanogrammes par échantillon pour le RT-qPCR et le séquençage ultérieurs. La quantification de l’expression de gènes spécifiques par PCR quantitatif en temps réel sur des extraits de cellules principales et secondaires de type sauvage révèle que les gènes des cellules secondaires Rab19 et MSA ne sont détectés qu’à partir d’extraits cellulaires secondaires, tandis que le peptide sexuel du gène cellulaire principal n’est détecté qu’à partir d’échantillons de cellules principales.L’analyse principale des composants sur les données de séquençage de l’ARN de trois types sauvages et de trois répliques mutantes révèle que le type sauvage reproduit à la fois l’amas près l’un de l’autre et loin des échantillons mutants. La visualisation des lues alignées sur des gènes particuliers montre que les gènes d’entretien ménager tels que l’actine 5C et les gènes secondaires spécifiques aux cellules Rab19 et Dve sont exprimés dans les deux génotypes. Pour msa, cependant, la forte expression du gène observé chez les mouches de type sauvage est perdue dans les souches mutantes.L’obtention de suffisamment de cellules secondaires dissociées vivantes est importante pour une procédure réussie. Ainsi, vérifiez le protocole de dissection et de dissociation dans l’expérience à petite échelle. Cette méthode permet le tri des deux cellules type de glande accessoire à partir d’un petit nombre de mouches, permettant l’étude de la façon dont ces cellules réagissent transcriptionnellement à de multiples conditions génétiques ou environnementales.Le succès reproducteur masculin est connu pour être affecté par beaucoup de choses, y compris le génotype, l’âge, et le statut d’accouplement. La facilité de cette méthode devrait nous permettre d’étudier comment ces facteurs affectent la transcription des glandes accessoires.

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L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation

Méthodes pour isoler et préparer Drosophila testicules échantillons (vivre et fixe) pour l'imagerie par contraste de phase et microscopie de fluorescence sont décrits ici.

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Découvrez une méthode de tri FACS pour isoler les cellules secondaires des glandes accessoires mâles de Drosophila. Cette technique permet l'analyse transcriptomique de ces populations cellulaires rares essentielles au succès reproducteur.

Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila

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