Un protocole de cryo-pulvérisation pour le traitement des pattes de souris pour évaluer les voies moléculaires de l'inflammation des tissus dans un modèle d'arthrite induite par le collagène

L’évaluation des profils moléculaires dans les tissus locaux est une étape cruciale pour comprendre le mécanisme d’action des produits pharmaceutiques actifs tels qu’ils sont évalués dans des modèles précliniques pertinents à la maladie. Dans le domaine de la recherche sur l’arthrite, l’environnement tissulaire local d’intérêt est les petites articulations portant le poids qui sont composées d’un mélange complexe d’os, de cartilage, de muscle et de cellules immunitaires. Ici nous décrivons une méthode robuste fiable pour la perturbation mécanique et/ou la pulvérisation de cet environnement complexe de tissu dans un environnement cryogéniquement commandé.

Cette méthode peut ensuite être utilisée pour générer des efforts de profilage protéomique et transcriptionnel en aval pour établir des signatures moléculaires de la maladie à partir d’une seule source d’échantillon uniforme. Cette méthode génère une poudre homogène contrairement à beaucoup d’autres anciennes techniques. En outre, l’ancienne procédure d’isolation de la température permet l’isolement de l’ARN de haute qualité.

Cette méthode peut ensuite être utilisée pour générer un profilage protéomique et transcriptionnel en aval permettant la caractérisation moléculaire des voies d’intérêt pertinentes de la maladie. Cette méthode peut fournir un aperçu de n’importe quel domaine de recherche qui tire des signatures moléculaires des tissus. La méthode pourrait être étendue à tout système tissulaire complexe qui a des constituants denses et difficiles à dissocier.

Bien que nous n’avons pas évalué à ce point, nous pourrions voir l’application potentielle aux tissus denses de cartilage comme des oreilles ou des os. La nature critique du temps du transfert de la poudre dans des tubes pour pesage est quelque chose qui prend la pratique. Si trop de temps est pris, la poudre commencera à décongeler et à devenir amorphe.

Il est important de limiter le nombre d’échantillons à 10 à 15 jusqu’à ce que vous êtes à l’aise avec la procédure. Le jour du traitement des tissus, préchill tous les instruments nécessaires sur la glace sèche pendant au moins 10 minutes. Portez des gants thermiques pour éviter d’être blessé par le froid extrême.

Ensuite, transférez chacune de la patte de souris préparée dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,5 millilitre et enclenchez immédiatement le gel dans l’azote liquide. Conserver les pattes gelées à 80 degrés Celsius négatifs. Lorsqu’il est prêt à continuer, remplir un moulin à congélateur d’azote liquide et laisser équilibrer pendant au moins 10 minutes.

Placez l’échantillon non transformé sur de la glace sèche et gardez-le là pour éviter les cycles de gel/dégel. Ensuite, transférez une patte arrière dans un grand flacon de broyage en polycarbonate pré-réfrigéré avec un bouchon en acier inférieur. Insérez l’impacteur en acier pré-réfrigéré et fermez le flacon de broyage en polycarbonate avec la prise en acier supérieure pré-refroidie.

Transférer les gros flacons de broyage en polycarbonate avec les échantillons dans le moulin à congélateur précalté et fermer le couvercle avec le fermoir en caoutchouc trouvé à l’avant de l’instrument. Laisser refroidir les échantillons dans l’azote liquide pendant une minute. Ensuite, réglez l’usine de congélation au programme d’une minute avec 10 cycles par seconde.

Appuyez sur le bouton de course et attendez que le moulin à congélateur termine son cycle. Après cela, ouvrez le couvercle du moulin à congélateur et sortez le grand flacon de broyage en polycarbonate. Placez le flacon de broyage dans un extracteur et retirez le bouchon d’acier supérieur en plaçant une pression vers le bas sur la poignée noire jusqu’à ce que le bouchon d’acier glisse hors du tube de polycarbonate.

Transférer le flacon de broyage ouvert sur la glace sèche et utiliser des forceps pré-réfrigérés pour enlever l’impacteur d’acier. Transférer la poudre congelée dans un tube conique pré-refroidi de 50 millilitres. Peser entre 30 et 50 milligrammes de poudre congelée dans un tube de microcentrifugeuse à plusieurs niveaux de 1,5 millilitre pour l’extraction de l’ARN et entre 100 et 200 milligrammes pour l’extraction des protéines.

Conservez les échantillons pulvérisés à un taux négatif de 80 degrés Celsius et procédez à l’isolement de l’ARN et des protéines dans les 24 heures. Tout d’abord, ajouter 10 microlitres de bêta-mercaptoéthanol pour chaque millilitre de tampon RLT. Calculez le volume de tampon RLT correspondant à un rapport de 23,3 millilitres par milligramme de tissu et ajoutez le volume approprié de tampon RLT avec du bêta-mercaptoéthanol au tube avec de la poudre congelée.

Vortex l’échantillon à 3000 RPM pendant 10 secondes. Utilisez un pipetter d’un millilitre pour monter et descendre vigoureusement 10 fois et vortex l’échantillon à nouveau à 3000 RPM pendant 20 secondes. Centrifugeuse à 13 000 g pendant deux minutes et transfert de 700 microlitres du supernatant dans un tube frais.

Ajouter 700 microlitres de 70 % d’éthanol à ce tube et charger 700 microlitres de l’échantillon sur une colonne de purification de l’ARN. Centrifuger le tube à une vitesse d’au moins 10 000 fois g pendant 30 secondes. Jetez le flow-through et chargez la partie restante de l’échantillon sur la colonne RNeasy et centrifugez le tube à nouveau à une vitesse d’au moins 10 000 fois g pendant 30 secondes.

Jetez le flow-through et lavez la colonne en ajoutant 700 microlitres de tampon RW1 et en centrifugant au moins la vitesse de 10 000 fois g pendant 30 secondes. Si vous effectuez l’option Digestion DNAse, 350 microlitres de RW1 sont ajoutés avant le traitement DNAse. Et après le traitement DNAse, 350 microlitres supplémentaires de RW1 sont ajoutés.

Ensuite, lavez la colonne deux fois en ajoutant 500 microlitres de tampon RPE et centrifugeuse à une vitesse d’au moins 10 000 fois g pendant 30 secondes en vous assurant de jeter le flux à chaque fois. Après cela, séchez la colonne en la centrifugant à une vitesse d’au moins 10 000 fois g pendant deux minutes. Élitez l’ARN en ajoutant 50 microlitres d’eau et en centrifugant à une vitesse d’au moins 10 000 fois g pendant deux minutes.

Collectez le flow-through et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Déterminer la quantité d’ARN à l’aide de la méthode de choix du chercheur et la stocker à 80 degrés Celsius négatifs avant une analyse plus approfondie. Diluer la solution de stock de lyse cellulaire 10X à la solution de stock de lyse cellulaire 1X avec de l’eau de qualité de culture cellulaire.

Reconstituer le cocktail inhibiteur de la protéase en place un avec un millilitre d’eau pour faire un stock inhibiteur de protéase 100X. Ajouter 100 millilitres d’inhibiteur de la protéase à 9,9 millilitres de tampon de lyse cellulaire 1X pour obtenir une solution de stock final 1X. Ajouter quatre microlitres de tampon de lyse de cellules froides glacées pour chaque milligramme de poudre de tissu et ajouter une perle en acier inoxydable de cinq millimètres au tube.

Vortex le tube à 3000 RPM pendant 60 secondes. Transférer le tube dans la glace mouillée et continuer jusqu’à l’échantillon suivant. En outre, les chercheurs peuvent constater que placer la boîte verticale peut faciliter un meilleur mélange avec la perle.

Après une heure, centrifuger les tubes à 10 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer les supernatants dans un tube frais en s’assurant d’éviter la couche de graisse sur le dessus. Déterminer la concentration totale de protéines.

Aliquot chaque échantillon en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et les stocker à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer une analyse plus approfondie. Dans cette étude, une méthode cryogénique de pulvérisation est utilisée pour traiter les pattes de murine afin d’améliorer le rendement et la qualité de l’ARN ou de la protéine extraite des tissus et de permettre l’analyse des profils moléculaires associés aux réponses inflammatoires. Une visualisation représentative d’image de gel montre l’ARN extrait des pattes avant des souris de CIA.

Le rRNA 28S et les bandes rRNA 18S indiquent que tous les échantillons ont une quantité suffisante d’ARN intact. Une parcelle de dispersion représentative des concentrations totales de protéines basées sur l’analyse des protéines BCA est montrée ici. Les concentrations totales de protéines provenant de souris naïves, de souris cia ou de souris CIA sous divers traitements sont comparables d’un groupe à l’autre.

Des analyses luminex sont ensuite menées pour déterminer les concentrations de cytokines inflammatoires et de chimiokines dans l’extrait protéique. Une parcelle représentative de dispersion des concentrations de cytokines et de chimiokines normalisées révèle que par rapport aux souris naïves, plusieurs cytokines sont élevées chez les souris cia et le traitement par anticorps anti-IL17A inhibe significativement la production de plusieurs cytokines. L’analyse de microarray est exécutée pour évaluer des changements transcriptome dans CIA et effets traitement-connexes.

Une carte thermique représentative des gènes a considérablement augmenté chez les souris de la CIA par rapport aux souris naïves est montré ici. Lors de l’exécution de cette procédure, il est essentiel pour les chercheurs de minimiser le temps pendant que le tube et la poudre sont maintenus hors de la glace sèche. Cela permet d’éviter le dégel de la poudre et les problèmes ultérieurs à l’ARN dégradé et les protéines.

La haute qualité des signatures moléculaires générées par cette technique permet aux chercheurs d’interroger le profil unique qu’une thérapeutique donnera et permet en outre la différenciation des mécanismes qui peuvent être utilisés pour traiter les conditions arthritiques. Cette technique pourrait être utilisée pour extraire un certain nombre de tissus denses comme les oreilles et les os pour évaluer davantage les signatures moléculaires dans ces tissus d’intérêt. Comprendre comment les thérapeutiques modulent les signatures moléculaires de la maladie nous permet de mieux évaluer quelles voies de signalisation spécifiques sont modulées.

Et peut-être plus important encore, quelles voies ne sont pas réglementées avec le mécanisme thérapeutique en cours d’évaluation. Lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide et de la glace sèche, il est impératif d’utiliser de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants bien notés et des boucliers pour le visage. L’exposition de la peau pendant plus de quelques secondes peut causer de graves brûlures.

Lorsque vous travaillez avec de grandes quantités de glace sèche, il est important de travailler dans une zone bien ventilée à mesure que la glace sèche libère du dioxyde de carbone.