Name: Analyse de lintégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez l'analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique chez Drosophila melanogaster par injection de colorants et microscopie confocale. Cette méthode permet d'évaluer la fonction barrière sur tissus vivants.

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Les auteurs remercient le Dr F. Bryan Pickett et le Dr Rodney Dale pour l'utilisation de l'équipement pour l'injection. Ces travaux ont été financés par le financement de la recherche de l'Université Loyola de Chicago à M.D., D.T., et J.J.

1. Collecte d'échantillons
<ol><li>Collection d'embryons
	<ol><li>Dans chaque cage de collecte d'embryons, utiliser un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles pour les collections. Incuber ces mouches dans une bouteille avec de la semoule de maïs-agar nourriture (Table of Materials) pendant 1/2 jours avant de commencer les collections23. REMARQUE: Plus de mouches peuvent être utilisées, mais le rapport femme-mâle doit être maintenu à 2:1.</li>
		<li>Pré-chauffer les assiettes d'agar de jus de pomme(tableau 1) à 25 oC pendant la nuit. REMARQUE: Ceci est nécessaire pour la mise en scène appropriée des embryons. Si les assiettes se dessèchent rapidement, ajouter un bol avec de l'eau à l'incubateur pour augmenter l'humidité de la chambre.</li>
		<li>Anesthésiez les mouches à partir de l'étape 1.1.1 avec le CO2 et transférez les mouches vers une cage de collecte. Placer une plaque d'agar de jus de pomme pré-chauffée avec un petit frottis de pâte de levure à l'extrémité ouverte et fixer à la cage avec la manche rouge (Table des matériaux). Afin d'éliminer les embryons plus âgés, permettre aux mouches de pondre des embryons/œufs sur une plaque d'agar de jus de pomme pendant 1 h à 25 oC.</li>
		<li>Retirer la cage de collecte de l'incubateur. Inverser le côté maille cage vers le bas et robinet vole vers le bas de la cage. Remplacer l'agar de jus de pomme par une nouvelle assiette d'agar de jus de pomme préréchauffée par un petit frottis de pâte de levure. Jeter la première assiette.</li>
		<li>Laisser les mouches pondre des embryons/œufs sur la nouvelle plaque d'agar de jus de pomme pendant 1 h à 25 oC. Jetez cette plaque après la collecte de 1 h et passez à l'étape suivante pour recueillir les embryons en cas d'injection.</li>
		<li>Pour recueillir les embryons de stade tardif 17 (20 à 21 h AEL), permettre aux mouches du génotype désiré à partir des étapes 1.1-1.1.5 de pondre sur une nouvelle plaque d'agar de jus de pomme préchauffée avec un petit frottis de pâte de levure à 25 oC pour 1 h. Plaque d'âge de 19 h dans un incubateur de 25 oC dans un incubateur de 25 oC , les embryons auront donc entre 20 et 21 h au moment de l'imagerie. REMARQUE: Cette étape peut être répétée comme souhaité pour plusieurs tours de collecte d'échantillons, d'injection et d'imagerie.</li>
		<li>Recueillir les embryons des plaques dans une passoire cellulaire avec un maillage en nylon de 70 m en ajoutant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un surfactant nonionique de 0,1 % (PBTx; Tableau 1) pour couvrir la surface de la plaque et desserrer les embryons de la surface à l'aide d'un pinceau.</li>
		<li>Décchorionate embryons recueillis dans la passoire cellulaire dans une solution d'eau de Javel de 50 % (tableau 1) dans un plat Petri de 100 mm pendant 5 min avec agitation occasionnelle à température ambiante. Rincer les embryons 3x en faisant tourbillonner la passoire cellulaire dans PBTx dans un plat Petri, en utilisant un plat frais de PBTx à chaque fois.</li>
		<li>Si tous les embryons sont du bon génotype, passez directement à l'étape 1.1.10. Si la génération d'embryons du génotype correct nécessite une croix avec des mouches hétérozygotes, sélectionnez des embryons du génotype correct en utilisant la présence ou l'absence de chromosomes d'équilibreur marqués fluorescents. Utilisez un stéréomicroscope avec des capacités fluorescentes pour la sélection du génotype. REMARQUE: Chromosomes d'équilibriste marqués de protéines fluorescentes déformées-jaunes; Kruppel-Gal4, protéine fluorescente vert UAS (GFP); et torsion-Gal4, UAS-GFP fonctionnent bien pour la sélection de génotype dans l'embryogenèse tardive (tableau 2)24,25,26.</li>
		<li>À l'aide d'une pipette en verre, transférer les embryons dans PBTx sur une dalle de gel agarose de 2 %(tableau 1). Retirer l'excès de liquide avec du papier filtre. Aligner les embryons de 6 à 8 sur la dalle de gel agarose de 2 % avec le côté postérieur vers la droite et le côté dorsal vers le haut (Figure 1B). REMARQUE: Le micropyle, le petit trou par lequel le spermatozoïde pénètre dans l'ovule, est situé à l'extrémité antérieure de l'embryon. L'extrémité postérieure est plus arrondie. La trachée apparaît blanche et est localisée doralement dans l'embryon, permettant la distinction des côtés dorsaux et ventrals de l'embryon (Figure 1B).</li>
		<li>Préparer une diapositive avec un morceau de ruban adhésif recto-verso. Appuyez fermement sur la diapositive sur le dessus des embryons pour les transférer sur la bande recto-verso.</li>
		<li>Descciquer les embryons par incubation à température ambiante pendant 25 min (aucun dessiccant n'est utilisé). Après la dessiccation, recouvrir les embryons d'huile d'halocarbone. REMARQUE: Les périodes de dessiccation peuvent varier en fonction de la température, de l'humidité et de la ventilation dans la pièce. La période d'incubation devrait être utilisée pour mettre en place l'appareil pour l'injection et le microscope confocal pour l'imagerie, tel que décrit dans les sections 2 et 3 de ce protocole.</li>
	</ol></li>
	<li>Collection Larvaire
	<ol>
<li>Mettre en place une croix avec 5 à 10 mouches femelles vierges du génotype désiré et la moitié autant de mâles du génotype désiré dans une fiole avec de la nourriture de semoule de maïs-agar et incuber à 25 oC23.</li>
		<li>Après 5 à 7 jours, selon le génotype, recueillir les larves errantes troisième instar de la fiole doucement avec des forceps. Rincer les larves dans 1x PBS pour enlever les aliments collés aux larves. Transférer les larves dans une plaque d'agar de jus de pomme pour le génotypage tel que décrit à l'étape 1.1.9 si nécessaire.</li>
		<li>Rouler les larves sur un tissu à l'aide d'un pinceau pour les sécher. Transférer 6 à 8 larves sur une lame préparée à l'aide de ruban adhésif recto-verso à l'aide de forceps.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation des aiguilles et de l'injection de spécimens
<ol><li>Tirez des aiguilles sur un puller micropipette avant le lancement de ce protocole. Fixez les tubes capillaires dans le pulleur d'aiguille et tirez selon la forme et les paramètres standard de l'aiguille pour les injections de D. melanogaster (tableau 3)27. Conserver les aiguilles dans un plat Petri en les ancrant dans l'argile jusqu'à ce qu'elles soient utilisées pour l'injection.</li>
	<li>Chargez une aiguille de 5 l de 10 kDa dextran conjuguée à la sulforhodamine 101 chlorure d'acide (Tableau des matériaux) à l'aide d'une tuyauterie à chargement de gel de 20 l pendant la période de dessiccation de 25 minutes pour les embryons (étape 1.1.12), ou immédiatement après le transfert de larves à la glissière (étape 1.2.3).</li>
	<li>Chargez l'aiguille dans un support d'aiguille et placez-la dans un micromanipulateur fixé à une base en acier (Tableau des matériaux). REMARQUE: L'aiguille doit être presque parallèle au stade du microscope pour l'injection d'embryons et légèrement inclinée vers le bas pour les injections larvaires.</li>
	<li>Définir l'appareil d'injection (Table des Matériaux) à 50 psi, 5 à 10 ms avec une gamme de 10. REMARQUE: Il peut être nécessaire de modifier ces paramètres pour l'appareil d'injection particulier utilisé.</li>
	<li>Placez la glissière sur scène et brossez le bord de l'aiguille contre le bord du ruban à double face à un angle de 45 degrés pour créer une pointe inclinée et brisée. REMARQUE: Pour les embryons, il suffit de casser la pointe assez pour permettre l'écoulement de la dextran 10 kDa. Une aiguille parfaite a une pointe légèrement inclinée et seule une petite goutte de colorant sortira à chaque injection. Pour les larves, il est nécessaire de briser la pointe plus, mais avec une pointe inclinée pour pénétrer la paroi du corps larvaire. Une plus grande goutte de colorant sortira.</li>
	<li>Pompez la pédale jusqu'à ce que le colorant soit à l'extrémité de l'aiguille.</li>
	<li>Alignez l'aiguille de sorte qu'elle soit parallèle à l'embryon ou inclinée légèrement vers le bas vers la larve.</li>
	<li>Déplacez l'aiguille pour percer l'extrémité postérieure du spécimen et injectez le spécimen en pompant la pédale. Injecter 2 nL de colorant dans les embryons, et 220 nL de colorant dans les larves. REMARQUE: L'embryon ou la larve devrait inonder de colorant si l'injection est réussie.</li>
	<li>Notez l'heure de l'injection à des fins d'incubation. Incuber les embryons pendant 10 min à température ambiante. Incuber les larves pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Continuer sur la diapositive pour injecter d'autres spécimens, en notant l'heure de l'injection pour chaque spécimen. REMARQUE: Selon la vitesse à laquelle des étapes ultérieures de dissection et d'imagerie peuvent être effectuées, 4 à 8 spécimens peuvent être injectés à la fois.</li>
</ol>3. Préparation d'échantillons pour l'imagerie
<ol><li>
Imagerie d'embryons
	<ol>
<li>Après l'injection, préparer les embryons à l'imagerie. Appliquer de la gelée de pétrole avec un applicateur à pointe de coton sur les côtés droit et gauche des échantillons sur la glissière comme espaceur pour éviter les dommages aux embryons lors du placement de la glissière.</li>
		<li>Échantillons d'images à l'aide d'un microscope confocal dans toute la profondeur de l'embryon avec un objectif 20x. Calculer le pourcentage d'échantillons totaux avec colorant observé dans le cordon nerveux ventral (VNC) à l'aide de l'équation suivante : % des échantillons avec bBB compromis - Nombre d'échantillons avec accumulation de colorant dans le VNC/nombre total d'échantillons analysés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissection et imagerie des larves
	<ol>
<li>Préparer à l'avance les diapositives pour les échantillons larvaires. Mont deux couvercles espacés d'environ 0,5 cm à la glissière avec du vernis à ongles. REMARQUE: Les couvertures fonctionnent comme des espaceurs pour le cerveau, de sorte qu'il n'est pas endommagé pendant le processus de montage.</li>
		<li>Après l'incubation de 30 min, disséquer les larves en 1x PBS directement sur la diapositive qui sera utilisée en imagerie. Tout d'abord, utilisez une paire de forceps pour saisir la larve à mi-chemin dans le corps larvaire, et utilisez une deuxième paire de forceps pour séparer les moitiés antérieures et postérieures de la larve.</li>
		<li>Ensuite, utilisez une paire de forceps pour saisir la région antérieure aux crochets buccaux, et utilisez une deuxième paire de forceps pour inverser la paroi du corps sur la pointe des forceps saisissant les crochets de la bouche. Le cerveau et le VNC seront exposés.</li>
		<li>Séparez le cerveau et le VNC de la paroi du corps en coupant les nerfs, et retirez la paroi du corps de la glissière (Figure 1C,D). Retirer les disques imaginaires si désiré.</li>
		<li>Couvrir l'échantillon de 10 là de 80 % de glycérol et placer une feuille de couverture sur l'échantillon pour l'imagerie.</li>
		<li>Image à travers la profondeur du tissu du système nerveux à l'aide d'un objectif 20x. Calculer le pourcentage d'échantillons totaux avec colorant observé dans le VNC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li>
<li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS%2FPNS+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038(2018).</li>
<li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole fournit une description complète des étapes nécessaires pour l'analyse de l'intégrité bBB au cours des derniers stades embryonnaires et troisièmes larvaires instar du développement de D. melanogaster. Des approches similaires ont été décrites ailleurs pour mettre en valeur l'intégrité de la BBB pendant le développement, ainsi que dans les stades adultes5,7,29,30. Cependant...

Pendant le développement, la communication et les interactions de cellule-cellule sont critiques pour établir la structure et la fonction de tissu et d'organe. Dans certains cas, ces interactions cellules-cellules scellent les organes de l'environnement environnant pour assurer le bon fonctionnement des organes. C'est le cas du système nerveux, qui est isolé par la barrière hémato-encéphalique (BBB). La dysfonction du BBB chez l'homme a été liée à des troubles neurologiques, y compris l'épilepsie, et la dégradation de la barrière a été observée dans les maladies neurodégénératives, y compris la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique1. Chez les mammifères, le BBB est formé par des jonctions étroites entre les cellules endothéliales2,3. D'autres animaux, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, ont un BBB composé de cellules gliales. Ces cellules gliales forment une barrière sélectivement perméable pour contrôler le mouvement des nutriments, des déchets, des toxines et des grandes molécules dans et hors du système nerveux4. Cela permet le maintien du gradient électrochimique nécessaire pour tirer des potentiels d'action, permettant la mobilité et la coordination4. Dans D. melanogaster, la glie protège le système nerveux de l'hémolymphique riche en potassium et en forme de sang5.
Dans le système nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (PNS) de D. melanogaster, deux couches gliales externes, la glie subperineuriale et la glie périnévriale, ainsi qu'un réseau externe de matrice extracellulaire, la lamelle neurale, forment le hémolymphe-cerveau et barrière hémolymphe-nerf6, dénommé le BBB tout au long de cet article. Pendant le développement des glissides subperineuriales deviennent polyploïdes et agrandissent pour entourer le système nerveux5,6,7,8,9,10,11 . Les glies subpériineuses forment des jonctions septates, qui fournissent la principale barrière de diffusion entre l'hémolymphe et le système nerveux5,6,12. Ces jonctions sont moléculairement similaires aux jonctions septates trouvées aux paranodes de la glie myélinisante chez les vertébrés, et elles remplissent la même fonction que les jonctions serrées dans le BBB des mammifères13,14, 15 Annonces , 16 Annonces , 17. Les glissides périnéales divisent, grandissent et s'enroulent autour de la glie subperineuriale pour réguler la diffusion des métabolites et des grandes molécules6,10,18,19. La formation de BBB est complète par 18,5 h après la ponte (AEL) à 25 oC5,8. Des études antérieures ont identifié des gènes qui sont des régulateurs critiques de la formation bBB20,21,22. Pour mieux comprendre les rôles exacts de ces gènes, il est important d'examiner l'effet de la mutation de ces régulateurs potentiels sur l'intégrité de BBB. Alors que des études antérieures ont décrit des approches pour l'analyse de l'intégrité BBB chez les embryons et les larves, un protocole complet pour cet essai n'a pas encore été décrit5,7. Ce protocole étape par étape décrit les méthodes d'analyse de l'intégrité bBB pendant les stades embryonnaires d'In. melanogaster et les troisièmes stades larvaires instar.

<table><tbody><tr><td>10 kDa de chlorure d’acide de sulforhodamine 101 (Texas Red) Dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1863</td><td>Le dextran doit être dilué dans du ddH2O autoclavé à une concentration de 25 mg/mL.</td></tr><tr><td>20 &mu ; L Pointes de pipette à chargement de gel</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol (200 proof)</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>11000200</td><td></td></tr><tr><td>Levure sèche active</td><td>Red Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Compresseur d’air</td><td>DeWalt</td><td>D55140</td><td></td></tr><tr><td>Jus de pomme</td><td>Jus de pomme</td><td></td><td></td>naturel Mott’s</tr><tr><td>Eau de Javel</td><td></td><td></td> domestique Capillaires en verre borosilicaté <td>1-5 % d’hypochlorite</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons de bouteille</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-277</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à cellules</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Échantillons imagés à l’aide d’un objectif 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>Puritan</td><td>19-062614</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face 1/2"</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers ; Motif #5 ; .05 x .01 mm Pointe</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles de nourriture pour mouches</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de nourriture pour mouches</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Pédale</td><td>Treadlite II</td><td>T-91-S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caster</td><td>Bio-Rad</td><td>1704422</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1704436</td><td></td></tr><tr><td>Verre Pipette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr>Sucre <td></td><td></td><td>cristallisé</td><td>Acheté à l’épicerie.</td></tr><tr><td>Halocarbon Oil</td><td>Lab Scientific, Inc.</td><td>FLY-7000</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Schott</td><td>Ace I</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator Stand World</td><td>Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>World Precision Instruments</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH310</td><td></td></tr><tr><td>Nightsea Filtres Sets</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>SFA-LFS-CY</td><td>Pour la visualisation du système d’adaptateur complet YFP</td></tr><tr><td>Nightsea avec tête lumineuse de couleur bleu royal</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>SFA-RB</td><td>Pour la visualisation du pinceau GFP</td></tr><tr><td></td><td>Simply Simmons</td><td>Chisel Blender #6</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Pompe pneumatique</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Ceci est également appelé micro-injecteur ou régulateur de pression. Étant donné que le modèle utilisé dans notre étude n’est plus disponible, il s’agit d’une alternative.</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Cages de collecte de petits embryons</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de base en acier</td><td>World Precision Instruments</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Utilisé pour la dissection tissulaire.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope avec source de lumière transmise</td><td>Baytronix</td><td></td><td>Utilisé pour l’injection.</td></tr><tr><td>Tegosept (acide p-hydroxybenzoïque, ester méthylique)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>Tensioactif non ionique</td></tr><tr><td>Bouchons de flacon</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-273</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster drosophila

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Le développement approprié du système nerveux comprend la formation de la barrière hémato-encéphalique, la barrière de diffusion qui régule étroitement l'accès au système nerveux et protège les tissus neuronaux contre les toxines et les agents pathogènes. Des défauts dans la formation de cette barrière ont été corrélés avec des neuropathies, et la panne de cette barrière a été observée dans beaucoup de maladies neurodegenerative. Par conséquent, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent la formation et le maintien de la barrière hémato-encéphalique pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Afin de comprendre les rôles exacts de ces gènes dans le développement neuronal, il est nécessaire d'essayer les effets de l'expression génique altérée sur l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Beaucoup de molécules qui fonctionnent dans l'établissement de la barrière hémato-encéphalique se sont avérées être conservées à travers les espèces eucaryotes, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Les mouches des fruits se sont avérées être un excellent système modèle pour examiner les mécanismes moléculaires régulant le développement et la fonction du système nerveux. Ce protocole décrit une procédure étape par étape pour essayer l'intégrité de barrière hémato-encéphalique pendant les étapes embryonnaires et larvaires du développement de D. melanogaster.

Les méthodes décrites ici permettent de visualiser l'intégrité du BBB dans l'ensemble du SNC chez les embryons et larves de D. melanogaster (Figure 1). À l'achèvement de la formation de BBB en fin d'embryogenèse, le BBB fonctionne pour exclure de grandes molécules du cerveau et VNC5. Ce protocole tire parti de cette fonction pour essayer la formation de BBB. Lorsque des embryons de type sauvage (Oregon R) de type avancé 17 (20 à 21 h) ont été injectés avec 10...

L'intégrité de la barrière hémato-encéphalique est essentielle à la fonction du système nerveux. Dans Drosophila melanogaster, la barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules gliales au cours de l'embryogenèse tardive. Ce protocole décrit les méthodes à essayer pour la formation et l'entretien de barrière hémato-encéphalique dans les embryons de D. melanogaster et les larves de troisième instar.

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant la régulation génétique de la formation et le maintien de la barrière céphalo-encéphalique au cours de plusieurs étapes du développement de la drosophile. Cette méthode peut également être adaptée pour examiner la perméabilité d’autres barrières, comme l’épithélium intestinal dans une variété d’organismes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’évaluation de la fonction de barrière céphalo-encéphalique dans les tissus vivants.La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car les manipulations d’échantillon peuvent être difficiles et beaucoup d’étapes exigent une attention particulière aux détails. Pour la collecte d’embryons placer un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles par bouteille avec corn meal agar nourriture et incuber ces mouches pendant un à deux jours avant de commencer les collections. La veille de la collecte, les assiettes chaudes d’agar de jus de pomme à 25 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain matin, transférez les mouches anesthésiées au dioxyde de carbone dans une cage de collecte et placez une assiette d’agar de jus de pomme préchauffée avec un pe

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Comportement des dosages pour mesurer des fonctions locomotrices, l'apprentissage et les capacités de...

Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence

Drosophila melanogaster est un système modèle génétiquement et comportemental souple qui a été utilisée pour comprendre la base moléculaire et cellulaire de nombreux processus biologiques importants pour plus d'un siècle 1. Drosophile a été bien exploitée afin de mieux comprendre la base génétique du comportement à la mouche.

Méthodes de dosage à Drosophila Comportement

Cette vidéo présente une procédure d’évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin EAE. Des colorants fluorescents de différentes tailles sont injectés rétro-orbitaire et circulent dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Le plus petit colorant s’échappe par des interstices dans le tissu cérébral, tandis que le plus grand colorant n’y pénètre que si la perturbation est grave, en corrélation avec l’étendue des dommages à la barrière.

Détermination de la rupture de la barrière hémato-encéphalique à l’aide de colorants fluorescents dans un modèle murin EAE

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA)...

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Le protocole décrit une analyse simple pour identifier des larves de drosophile qui sont confrontés à une hypoxie selon les niveaux de l’oxygène atmosphérique normale. Ce protocole permet des larves hypoxiques être distinguée des autres mutants qui montrent des phénotypes qui se chevauchent comme la lenteur ou une croissance lente.

Un dosage des terriers/Tunneling pour détection d’hypoxie chez les larves de Drosophila melanogaster

Nous présentons un protocole permettant de mesurer la consommation d’oxygène et l’acidification extracellulaire dans le cerveau larvaire et adulte de Drosophila melanogaster . Un analyseur métabolique est utilisé avec un protocole adapté et optimisé. Micro-tissu restrictions sont un élément essentiel du présent protocole et ont été conçues et créées spécialement pour leur utilisation dans cette analyse.

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

Le protocole présente une méthode à haut débit et rentable pour évaluer la neurotoxicité chez la mouche des fruits grâce à la quantification de la dysfonction locomotrice comme alternative aux modèles traditionnels de mammifères. Il vise à évaluer les effets neurotoxiques de composés pharmaceutiques, d’agents environnementaux ou de modifications génétiques à l’aide d’un modèle sensible, reproductible et éthiquement favorable.

Analyse comportementale de la dysfonction locomotrice chez Drosophila melanogaster comme lecture de la neurotoxicité

Ce protocole présente une méthode fiable pour évaluer l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) dans le modèle de poisson-zèbre adulte (Danio rerio) à l’aide de l’évaluation basée sur le colorant bleu d’Evan, permettant une analyse qualitative et quantitative de la perturbation neurovasculaire.

Visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’Evan chez le poisson-zèbre adulte

Découvrez l'analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique chez Drosophila melanogaster par injection de colorants et microscopie confocale. Cette méthode permet d'évaluer la fonction barrière sur tissus vivants.

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

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