Name: Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse dans les cellules progénitrices souches hématopoïétiques isolées de la moelle osseuse murine.

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Ce travail est en partie soutenu par le soutien financier des National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de la Fondation St. Baldrick's et de la Fondation Pelotonia.

Ce protocole a été approuvé par le Comité national de soins et d'utilisation des animaux de l'Hôpital pour enfants (IACUC).
REMARQUE: Le protocole est décrit dans l'ordre chronologique qui s'étend sur une période de deux jours. Utilisez des réactifs frais tels que décrits dans le protocole ci-dessous.
1. Préparation des réactifs le jour précédant l'essai
<ol><li>
Hydratez la cartouche du capteur.
	<ol>
<li>Incuber 5 ml du calibrant (Table of Materials) dans un incubateur non-CO2 37 oC pendant la nuit.</li>
		<li>Ouvrez le kit d'analyse de flux (Table of Materials) et séparez la cartouche du capteur (vert; haut) de la plaque d'utilité (transparente; inférieure). Ensuite, placez la cartouche du capteur à l'envers et à côté de la plaque d'utilité.</li>
		<li>À l'aide d'eau stérile, remplir les puits de la plaque d'utilité (200 l) et les chambres autour des puits (400 l).</li>
		<li>Immerger la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité en vous assurant que les capteurs sont complètement recouverts d'eau. Appuyez sur 3x pour éviter la formation de bulles.</li>
		<li>Placer la cartouche immergée dans la plaque d'utilité dans un incubateur non-CO2 37 oC pendant la nuit. Pour éviter l'évaporation de l'eau, assurez-vous que l'incubateur est bien humidifié. Placez un bécher ouvert contenant H2O par mesure de précaution supplémentaire à côté de la plaque d'utilité de la cartouche, en particulier si vous utilisez un four ordinaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer la plaque d'astodonte.
	<ol>
<li>Stériliser la surface de la classe 2 de l'armoire de biosécurité à l'aide de 70 % d'éthanol. Ouvrez la plaque d'astodonte sous le capot.</li>
		<li>Ajouter 40 ll de solution de 0,01 % (w/v) en polylysine (PLL) disponible dans le commerce à chaque puits de la plaque d'assay sous le capot.</li>
		<li>Couvrir la plaque d'astodonte avec le couvercle fourni dans le kit. Incuber la plaque d'assay fermée à température ambiante (RT) sous le capot pendant 1 h. REMARQUE: Le but de l'incubation est de laisser PLL enrober la surface de la plaque d'assay pour faciliter l'adhérence des cellules de suspension à la surface de la plaque d'assay.</li>
		<li>Après 1 h d'incubation de la plaque d'aspiration, retirer l'excédent de solution à l'inpirateur stérile à base de vide et sécher le puits sous le capot. REMARQUE: Il faut 30 à 60 min pour sécher à l'air les puits de la plaque d'analyse après l'enlèvement excessif de La PLL à l'aide de l'aspirateur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Jour de l'Assay
<ol><li>Préparer la cartouche.
	<ol>
<li>Soulevez la cartouche du capteur. Placez-le à l'envers dans le capuchon de culture de tissu et jetez l'eau de la plaque d'utilité.</li>
		<li>Remplissez les puits de plaque d'utilité avec 200 l du calibrant pré-chauffé.</li>
		<li>Remplissez les chambres autour des puits avec 400 l l du calibrant.</li>
		<li>Immerger la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité, en vous assurant que les capteurs sont complètement couverts par le calibrant. Appuyez sur 3x pour éviter la formation de bulles.</li>
		<li>Équilibrez la cartouche du capteur immergée dans la plaque d'utilité dans un incubateur non-CO2 37 oC pendant 45 à 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Récoltez les HSPC LSK dérivés de la moelle osseuse.
	<ol>
<li>Pour tenir compte de suffisamment de répliques biologiques, prévoyez d'utiliser des HSPC dérivés d'une souris par puits de la plaque d'astodonte. REMARQUE: Cette méthode de récolte de moelle osseuse fournit 50 000 à 80 000 HSPc LSK de chaque souris. Ce protocole pour mesurer le flux extracellulaire est optimisé pour 70 000 HSPC LSK par puits d'une plaque de puits de 96.</li>
		<li>Euthanasier les souris en utilisant le surdosage de CO2 et la luxation cervicale, suivant les méthodes locales approuvées par l'IACUC.</li>
		<li>Stériliser la surface des outils de dissection et le banc à l'aide de 70% d'éthanol.</li>
		<li>Pour chaque souris, remplissez un plat Petri avec 1x salin tamponné par phosphate (PBS) contenant 2 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SF) à RT. REMARQUE: N'utilisez pas de PBS préréfrigéré car il créera des amas dans les étapes suivantes.</li>
		<li>Vaporiser 70% d'éthanol (v/v) sur toute la souris euthanasiée. Isoler tous les os, y compris les membres supérieurs et inférieurs, les os de la hanche, le sternum, la cage thoracique et la colonne vertébrale, de la souris17,18. Retirez la matière blanche de la moelle épinière de la souris car elle peut contaminer les cellules LSK. Placer tous les os dans 1x PBS (2% FBS), comme ils sont recueillis, dans un plat Petri jusqu'à une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Inverser un tube conique de 50 ml (nouveau à chaque fois) et l'utiliser pour triturer les os immergés dans 1x PBS (2 % FBS) dans le plat Petri.</li>
		<li>À l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml, pipette de haut en bas (10x) pour éliminer uniformément les cellules des os, après avoir écrasé les os.</li>
		<li>Placer une passoire cellulaire de 40 m sur un tube conique de 50 ml. Prémouiller la surface de la passoire en passant 1 ml de 1x PBS (2 % FBS).</li>
		<li>Récoltez la suspension cellulaire dérivée de la moelle osseuse à partir de l'étape 2.2.7 et passez-la à travers la surface préhumide de la passoire cellulaire pour enlever les débris osseux.</li>
		<li>Répétez les étapes 2.2.6 à 2.2.9 jusqu'à ce que tous les matériaux osseux deviennent blancs comme marqueur que la plupart des cellules de moelle osseuse sont rassemblées dans le tube conique de 50 ml. REMARQUE: Il faut souvent deux tubes coniques de 50 ml par souris pour recueillir toutes les cellules dérivées de la moelle osseuse.</li>
		<li>Centrifugeuse 50 mL tubes coniques contenant des cellules dérivées de la moelle osseuse pendant 5 min à 500 x g et RT.</li>
		<li>Retirez le supernatant. Resuspendre les cellules dérivées de la moelle osseuse (combiner le contenu des deux tubes de 50 ml) dans 5 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) en volume final et conserver les cellules à RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Récoltez les cellules de moelle osseuse murine mononucléées.
	<ol>
<li>Ajouter 5 ml de milieu de gradient de densité (c.-à-d. Ficoll) à un tube conique de 15 ml. Ensuite, ajoutez lentement 5 ml de suspension de la cellule de moelle osseuse. Assurez-vous que les cellules restent comme une couche au-dessus du milieu de gradient de densité.</li>
		<li>Centrifugeuse de 30 min à 500 x g et RT. N'utilisez pas de frein dans la centrifugeuse. Assurez-vous que la centrifugeuse est à la plus faible accélération possible (p. ex., 1 accélération et 0 décélération).</li>
		<li>Récoltez l'interface médiane des cellules mononucléées (couleur blanche) après centrifugation dans un tube conique frais de 15 ml.</li>
		<li>Laver les cellules, récoltées à partir du milieu de gradient de densité, avec 5 ml de 1x PBS (-2 % de FBS). Centrifugeuse de 5 min à 500 x g et 4 oC. Retirez le supernatant.</li>
		<li>Répétez l'étape 2.3.4.</li>
		<li>Resuspendre le contenu cellulaire du tube en 300 oL de 1x PBS (2 % DE FBS). Aliquot 10 l de suspension cellulaire pour un contrôle non taché ou monocolore dans un tube FACS.</li>
	</ol></li>
	<li>Récoltez des HSPC LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées.
	<ol>
<li>Faites un cocktail d'anticorps biotineens en mélangeant 3 L par échantillon des anticorps suivants : Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Ajouter 15 ll du cocktail biotine-anticorps à 300 l de cellules de moelle osseuse mononucléées. REMARQUE: Chaque anticorps est utilisé à 1:100 dilution.</li>
		<li>Incuber les cellules avec le cocktail biotine-anticorps pendant 30 min à 4 oC avec de l'agitation pour éviter que les cellules ne s'agglutinent au fond du tube.</li>
		<li>Ajouter 10 ml de 1x PBS préréfrigéré (2 % de FBS) aux cellules mélangées au cocktail biotine-anticorps.</li>
		<li>Centrifuger le tube pendant 5 min à 500 x g et 4 oC. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 400 OL de 1x PBS (2 % DE FBS). Aliquot 10 l pour le contrôle des couleurs streptavidin-single.</li>
		<li>Brièvement vortex microbilles d'antibiotine (Tableau des matériaux) avant utilisation. Ajouter 80 l de microbilles à chaque échantillon de cellule (de 400 l). Bien mélanger et incuber pendant 20 min supplémentaires à 4 oC, avec de l'agitation.</li>
		<li>Ajouter 10 ml de 1x PBS préréfrigéré (2 % de FBS) aux cellules. Centrifuger le tube pendant 5 min à 500 x g et 4 oC.</li>
		<li>Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de 1x PBS (2% FBS). Conserver à 4 oC pendant la mise en place de l'unité de séparation magnétique.</li>
		<li>Placer une colonne (Tableau des Matériaux) dans le champ magnétique du séparateur de tri des cellules assistées magnétiques (MACS) à 4 oC. Préparer la colonne pour la séparation magnétique en la rinçant avec 3 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) sous le débit gravitationnel à 4 oC.</li>
		<li>Ajouter la suspension cellulaire de l'étape 2.4.7 à la colonne pré-humide à 4 oC. Laisser passer les cellules à travers la colonne à 4 oC et recueillir les effluents dans un tube conique de 15 ml. REMARQUE: La fraction avec des cellules non étiquetées dans de tels effluents représente les cellules négatives enrichies de lignée.</li>
		<li>Laver la colonne avec 3 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) à 4 oC. Répéter 3x. Recueillir le flux à travers et le garder à 4 oC. Comptez les cellules viables élucées par exclusion bleue trypan à l'aide d'un hémocytomètre.</li>
		<li>Centrifuger le tube conique de 15 ml contenant l'écoulement pendant 5 min à 500 x g et 4 oC. Jetez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) et transférer le contenu dans un tube FACS.</li>
		<li>Ajouter 24 ll du cocktail d'anticorps LSK à chaque 107 cellules. Le cocktail d'anticorps contient une concentration égale d'anticorps 450-streptavidin, d'anticorps PE-CY7-Sca1 et d'anticorps APC-c-Kit.</li>
		<li>Incuber pendant 1 h à 4 oC avec agitation sous l'obscurité (couvert de papier d'aluminium).</li>
		<li>Ajouter 3 ml de 1x PBS (2 % FBS) au tube FACS. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g et 4 oC. Jetez le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules étiquetées par anticorps dans 1 ml de 1x PBS (2 % de FBS). Ajouter 1 oL d'iodide de propidium de 1 mg/mL à la suspension cellulaire juste avant le tri.</li>
		<li>Filtrer le contenu du tube FACS à l'aide d'une passoire de 40 m juste avant de trier les cellules LSK.</li>
		<li>Recueillir les cellules LSK, via le tri FACS, dans 1,5 mL tube contenant 0,5 ml de médias complets complétés par 2 mM de glutamine, 3 mg/mL de glucose, 1 mM de pyruvate, 1x thrombopoétine (TPO), 1x facteur de cellules souches (SCF), 0,5x pénicilline/streptomycine (P/S), pH 7.4 (tableau 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tests de respiration mitochondriale et de glycolyse des HSPC LSK
<ol><li>
Ensemencement LSK dans la plaque d'assay
	<ol>
<li>Centrifugeuses cellules LSK à partir de l'étape 2.4.17 pour 5 min à 500 x g et RT. Jetez le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans un support complet à une concentration finale d'au moins 70 000 cellules/40 l.</li>
		<li>Contenu de graines de 40 l'enclenché (contenant 70 000 cellules) dans la plaque de 8 puits recouverte de PLL à partir de l'étape 1.2.4. Laissez tous les puits d'angle vides.</li>
		<li>Centrifugeuse pour 1 min à 450 x g et RT. N'appliquez pas le frein. Assurez-vous que les cellules sont fixées au fond du puits à l'aide du microscope inversé.</li>
		<li>Ajouter 135 l de support complet aux cellules de chaque puits pour un volume final de 175 l. Ajouter 175 l de support complet aux 2 coins de la plaque comme des blancs.</li>
		<li>Incuber les cellules de l'incubateur non-CO2 pendant 2 h à 37 oC.</li>
		<li>Mettre en place un programme pour ajouter des médicaments à chaque puits de la plaque de puits dans l'analyseur à l'aide d'une mesure décrite dans le tableau 2 (test d'effort mitochondrial) et le tableau 3 (test d'effort de glycolyse). REMARQUE : Pendant que les cellules couvent, allumez l'instrument et assurez-vous qu'il est à 37 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test de stress mitochondrial
	<ol>
<li>Préparer 45 millions de solutions de stock d'oligomycine, 50 M de cyanure de carbonyle 4-(trifluromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) et 25 solutions de stock M de rotenone/antimycine A. Pour préparer une solution de stock d'oligomycine de 45 M, dissoudre le contenu de la pochette disponible dans le commerce dans 280 l'un des supports complets. Pour préparer une solution d'actions FCCP de 50 M, dissoudre le contenu de la pochette disponible dans le commerce dans 288 L du support complet. Pour préparer une solution de bouillon de 25 M rotenone/antimycine, dissoudre le contenu de la poche commerciale disponible dans 216 L du support complet.</li>
		<li>Retirez la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité de l'incubateur et chargez ses ports (A, B et C) de sorte que chaque puits ait une concentration finale de 2 m d'oligomycine, de 1,5 M FACP et de 0,5 M de roténonne/antimycine A au besoin, selon les mesures de dilution décrites dans le tableau 4 (pour le taux de consommation d'oxygène).</li>
		<li>Retirez le couvercle de la cartouche du capteur assemblée dans la plaque d'utilité et placez-le sur le plateau de l'instrument. Démarrer l'étalonnage qui prendra 20 min.</li>
		<li>Après l'étalonnage, retirez la plaque d'utilité et remplacez-la par une plaque d'ascompte contenant des cellules LSK, qui sont maintenant adhérées au fond du puits.</li>
		<li>Presse Continuer à lancer le programme décrit dans le tableau 2. Après l'achèvement du programme, récupérez les données et analysez-les à l'aide du logiciel Wave Desktop. REMARQUE: Les données générées à partir des analyses de flux extracellulaires peuvent être tracées à l'aide de la parcelle de point du logiciel Wave Desktop ou exportées vers le programme de statistiques sur le Web.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test de stress de glycolyse
	<ol>
<li>Reconstituer le glucose en 300 l (100 mM), l'oligomycine en 288 l (50 M), le glucose 2-D (2-DG) dans 300 l (500 mM) de support complet à partir de la poche commercialedisponible.</li>
		<li>Pipette doucement de haut en bas (10x) pour solubilité les composés. Vortex le 2-DG pendant environ 1 min pour assurer une dissolution appropriée dans les médias.</li>
		<li>Retirez la cartouche du capteur de l'incubateur. Ports de chargement A à C suivant les mesures de dilution décrites dans le tableau 5 pour obtenir une concentration finale de 10 mM de glucose, d'oligomycine de 2 M. et de 50 mM de 2-DG.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.2.3 et 3.2.4.</li>
		<li>Presse Continuer à lancer le programme décrit dans le tableau 3. Après l'achèvement du programme, récupérez les données et analysez-les à l'aide du logiciel Wave Desktop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
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<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici, nous démontrons l'isolement d'une quantité maximale de population pure et viable de HSPCs murine aussi bien que la mesure de leur glycolyse et respiration mitochondriale avec un analyseur extracellulaire de flux. Plus précisément, le protocole surmonte les problèmes techniques suivants pour l'utilisation des HSPC LSK : i) la basse fréquence des HSPC LSK dans la moelle osseuse murine14, ii) faible activité métabolique basale de LSK HSPCs26, iii) la fragilité de LSK HSPc...

Puisque la durée de vie de la plupart des cellules sanguines matures est courte, l'homéostasie du sang repose sur l'auto-renouvellement et la différenciation d'une population de longue durée mais rare de cellules souches hématopoïétiques (HSPC)1. Les HSPC sont tranquilles, mais ils sont prompts à proliférer et à subir une différenciation à la stimulation pour soutenir les exigences du système sanguin. Comme chaque état cellulaire HSPC nécessite une demande bioénergétique unique, les changements métaboliques sont des moteurs clés des décisions de destin HSPC. Par conséquent, la perte de plasticité métabolique, en modifiant l'équilibre entre la quiescence, l'auto-renouvellement et la différenciation des HSPC, conduit souvent à des troubles myéloou ou lympho-proliférants. Ensemble, la compréhension de la régulation métabolique du développement HSPC est essentielle pour découvrir les mécanismes sous-jacents aux malignités hématologiques2,3,4,5.
La respiration mitochondriale et la glycolyse génèrent de l'ATP pour susciter des réactions intracellulaires et produire les éléments constitutifs nécessaires à la synthèse des macromolécules. Puisque les HSPC ont la basse masse mitochondrique comparée aux cellules différenciées6 et ils soutiennent la quiescence dans les niches hypoxiques de moelle, Les HSPC s'appuient principalement sur la glycolyse. L'activation des HSPC améliore leur métabolisme mitochondrial qui mène à la perte de quiescence et à leur entrée ultérieure dans le cycle cellulaire. Une telle plasticité métabolique des HSPC permet le maintien de la piscine HSPC tout au long de la vie adulte6,7,8,9,10,11,12. Par conséquent, il est essentiel d'étudier leurs activités métaboliques, telles que le taux de consommation d'oxygène (OCR; indice de phosphorylation oxydative) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR; indice de glycolyse) pour analyser l'activation du HSPC et l'état de santé. L'OCR et l'ECAR peuvent être mesurés simultanément, en temps réel, à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire. Cependant, la méthode actuelle nécessite un grand nombre de cellules et est optimisée pour les cellules adhérentes13. Étant donné que les HSPC ne peuvent pas être isolés en grandes quantités de souris14, nécessitent le tri pour obtenir une population pure, sont des cellules non adhérentes15, et ne peuvent pas être cultivés du jour au lendemain sans éviter la différenciation16, il a été difficile de mesurer l'OCR et l'ECAR des HSPC. Ici, nous fournissons un ensemble d'instructions claires, étape par étape pour accompagner des tutoriels vidéo sur la façon de mesurer la respiration métabolique et la glycolyse de quelques milliers de moelle osseusemurine-Lineage negSca1-c-Kit (LSK) HSPCs.

<table><tbody><tr><td>0,01 % (p/v) de solution de poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Utilisé pour la fixation LSK</td></tr><tr><td>40 & micro ; Filtre à cellules m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Utilisé pour la filtration cellulaire après broyage d’os</td></tr><tr><td>Microbilles anti-biotine</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Utilisé pour la séparation de la lintine</td></tr><tr><td>Rat Anti-souris CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Utilisé pour la séparation de la lintine</td></tr><tr><td>Rat Anti-souris CD5 Clone 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Utilisé pour la séparation de la lin- séparation</td></tr><tr><td>Biotine Rat Anti-souris CD8a Clone 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>Utilisé pour la séparation Lin- rat</td></tr><tr><td>Biotine Anti-souris Ly-6G et Ly-6C Clone RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>utilisé pour la séparation Lin-</td></tr><tr><td>Rat Biotine Anti-souris TER-119/Clone de cellules érythroïdes TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>utilisé pour la séparation Lin-</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD117 (c-Kit) (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Utilisé pour le tri LSK</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubes coniques à centrifuger</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubes coniques à centrifuger</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Falcon Tubes en polypropylène à fond rond</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>Utilisé pour Tri LSK</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>Utilisé dans le tampon FACS</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Utilisé pour la séparation du gradient ficoll</td></tr><tr><td>L-glutamine 100x Fisher</td><td>Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Utilisé pour le milieu de test</td></tr><tr><td>LS Colonne</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Utilisé pour la séparation des lignes</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Anticorps (D7), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Utilisé pour le tri LSK</td></tr><tr><td>Facteur de cellules souches murines (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Utilisé pour le milieu de dosage</td></tr><tr><td>Thrombopoïétine murine (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Utilisé pour le milieu de test</td></tr><tr><td>PBS 1 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Utilisé pour le tampon FACS</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine ( 10 000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Utilisé pour le milieu de dosage</td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>Utilisé pour le tri LSK</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>Utilisé pour l’ensemencement de LSK</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Utilisé pour le milieu de test</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450 Conjugué</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>Utilisé pour le tri LSK</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Utilisé pour l’équilibrage des cartouches</td></tr><tr><td>Milieux XF</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Utilisé pour les milieux de dosage</td></tr><tr><td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Médicaments pour le test de stress de glycolyse</td></tr><tr><td>XFp Mitochondriale Kit de test d’effort</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>Médicaments pour le test de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>Cartouche de capteur XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>Utilisé pour la glycolyse et le test de stress mitochondrial</td></tr></tbody></table>

analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Les cellules hématopoïétiques progénitrices de tige (HSPc) ont la plasticité métabolique distincte, qui leur permet de passer de leur état quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de la formation de sang. Cependant, il a été difficile d'analyser l'état métabolique (respiration mitochondriale et glycolyse) des HSPC en raison de leur nombre limité et de l'absence de protocoles optimisés pour les HSPC fragiles et non adhérents. Ici, nous fournissons un ensemble d'instructions claires, étape par étape pour mesurer la respiration métabolique (taux de consommation d'oxygène; OCR) et la glycolyse (taux d'acidification extracellulaire; ECAR) de la moelle osseuse murine-Lineageneg Sca1c-Kit(LSK) HSPc. Ce protocole fournit une plus grande quantité de HSPC LSK de la moelle osseuse, améliore la viabilité des HSPC pendant l'incubation, facilite les analyses de flux extracellulaires des HSPC non adhérents, et fournit des protocoles d'injection optimisés (concentration et temps) pour les médicaments ciblant la phosphorylation oxydative et les voies glycolytiques. Cette méthode permet de prédire l'état métabolique et la santé des HSPC pendant le développement sanguin et les maladies.

Notre méthode d'extraction nous a permis de récolter jusqu'à 80 000 HSPc LSK par souris. La viabilité et le nombre de cellules LSK ont été améliorés avec notre méthode, parce que nous : (1) la moelle osseuse combinée des membres supérieurs et inférieurs, des os de hanche, du sternum, de la cage thoracique, et de la colonne vertébrale, (2) évité d'utiliser le tampon de lyse de cellules rouges qui aurait augmenté la mort cellulaire et l'agglutination, (3) a utilisé la séparation moyenne de gradient de densité des cellules ...

Les cellules progénitrices de tige hématopoïétiques (HSPc) transition d'un état quiescent à un état de différenciation dû à leur plasticité métabolique pendant la formation de sang. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse des HSPC.

Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Les changements métaboliques dans les cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre leur permettent de passer de leur état de quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de formation de sang. L’altération de la plasticité métabolique des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre mène aux désordres hématologiques. Notre protocole aidera à mesurer la régulation métabolique et la santé des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pendant le développement sanguin et les maladies.L’analyse de la respiration mitochondrique et de la glycolyse des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre est difficile car elles sont la population fragile et rare. Notre protocole optimisé permet l’isolement d’une plus grande quantité de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse murine, améliore leur viabilité pendant l’incubation, facilite l’analyse du flux extracellulaire des HSPC non adhérents et fournit des paramètres d’injection optimisés pour la phosphorylation oxydative ciblant les médicaments ainsi que les voies glycolytiques. Pour commencer cette procédure, remplissez les puits de la plaque d’utilité et les chambres autour des puits avec de l’eau stérile.Submergez la cartouche du capteur dans la plaque d’utilité en vous assurant que les capteurs sont complètement recouverts d’eau. Placez ensuite la cartouche immergée dans la plaque d’utilité dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius pour incuber pendant la nuit. Dans une armoire de biosécurité de classe II, ajouter 40 microlitres de solution PLL disponible dans le commerce à chaque puits de la plaque d’essai.Couvrir la plaque d’essai avec le couvercle fourni dans le kit et incuber la plaque fermée à température ambiante sous le capot pendant une heure. Après cela, utilisez un aspirateur stérile à base de vide pour enlever la solution excédentaire et sécher à l’air la plaque sous le capot. Pour récolter les cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajouter cinq millilitres de gradient de densité moyen à un tube conique de 15 millilitres.Ajouter lentement cinq millilitres de la suspension cellulaire de la moelle osseuse en s’assurant que les cellules restent comme une couche au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifugeuse à 500 fois g et à température ambiante pendant 30 minutes en s’assurant que la centrifugeuse est à la plus faible accélération possible. Récoltez l’interface moyenne des cellules mononucléées dans un tube frais de 15 millilitres.Ensuite, lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS contenant 2%FBS. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Enlevez le supernatant et resuspendez les cellules dans 300 microlitres de 1X PBS contenant 2%FBS.Ensuite, aliquot 10 microlitres de la suspension cellulaire pour un contrôle non taché ou unicolore dans un tube FACS. Pour récolter les HSPCs LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajoutez 15 microlitres de cocktail d’anticorps biotine à 300 microlitres de cellules de moelle osseuse mononucléées. Pour récolter les HSPCs LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajoutez 15 microlitres de cocktail d’anticorps biotine à 300 microlitres de cellules de moelle osseuse mononucléées.Placer les tubes dans un seau à glace placé sur un shaker dans un réfrigérateur pour incuber à quatre degrés Celsius avec agitation pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 10 millilitres de 1X PBS pré-refroidi contenant 2% de FBS aux cellules. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 400 microlitres de 1X PBS contenant 2%FBS. Vortex brièvement les microbilles anti-biotine avant utilisation. Ajouter 80 microlitres des microbilles à chaque échantillon et bien mélanger.Incuber pendant 20 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius avec agitation. Après cela, ajouter 10 millilitres de PBS pré-réfrigéré contenant 2%FBS aux cellules. Centrifuger le tube à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS contenant 2%FBS. Rangez la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius tout en installant l’unité de séparation magnétique. Placez la colonne dans un champ magnétique pour le séparateur de tri des cellules magnétiques assistées à quatre degrés Celsius.Préparez la colonne pour la séparation magnétique en la rinçant avec trois millilitres de 1X PBS contenant 2%FBS sous flux de gravité à quatre degrés Celsius. Ajouter la suspension cellulaire à la colonne pré-humide à quatre degrés Celsius. Laissez toutes les cellules traverser la colonne à quatre degrés Celsius et recueillez les effluents dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, lavez la colonne avec trois millilitres de 1X PBS et 2%FBS à quatre degrés Celsius. Répétez ce lavage trois fois. Recueillir le flux à travers et le garder à quatre degrés Celsius.Centrifugeuse le tube conique contenant le flux à travers à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en 0,5 millilitres de 1X PBS avec 2%FBS et transférez la suspension dans un tube FACS. Ajouter ensuite 24 microlitres du cocktail d’anticorps LSK à chaque tranche de 10 millions de cellules.Couvrir le tube de papier d’aluminium et incuber dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avec agitation pendant une heure. Après cela, ajouter trois millilitres de 1X PBS avec 2%FBS au tube FACS. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez les cellules étiquetées anticorps en un millilitre de 1X PBS contenant 2%FBS. Juste avant le tri, ajouter un microlitre d’un milligramme par millilitre d’iodure de propidium à la suspension cellulaire et utiliser une passoire de 40 micromètres pour filtrer le contenu du tube FACS. Tout d’abord, centrifugeuse les cellules LSK recueillies à 500 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et résépendez les cellules dans un média complet à une concentration finale d’au moins 70 000 cellules par 40 microlitres. Ensemencer 40 microlitres de cette suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de huit puits recouverte de PLL en s’assurant de laisser tous les puits d’angle vides. Centrifuger la plaque à 450 fois g et à température ambiante pendant une minute.Utilisez un microscope inversé pour vous assurer que les cellules sont fixées au fond des puits. Après cela, ajouter 135 microlitres de supports complets aux cellules de chaque puits, ce qui porte le volume final de chaque puits à 175 microlitres. Ajouter 175 microlitres de supports complets aux deux coins de la plaque sous forme de blancs.Incuber les cellules dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, mettre en place un programme pour l’analyseur d’ajouter des médicaments à chaque puits de la plaque tel que décrit dans le tableau deux et le tableau trois du protocole texte. Pour le test de résistance mitochondrial, récupérer la cartouche de capteur dans la plaque d’utilité de l’incubateur de sorte que chaque puits a une concentration finale de deux oligomycine micromolaire, 1,5 micromolaire FCCP, et 0,5 micromolaire de rotenone et anti-mycine A au besoin.Retirez le couvercle de la cartouche du capteur et placez-le sur le plateau de l’instrument. Commencez le processus d’étalonnage qui prendra 20 minutes. Lorsque l’étalonnage est terminé, retirez la plaque utilitaire et remplacez-la par la plaque d’analyse contenant les cellules LSK.Appuyez sur continuer à démarrer le programme précédemment défini. Lorsque le programme est terminé, récupérez les données et analysez-les. Dans cette étude, une quantité maximale de HSPCs viables de LSK de murine sont isolés et leur métabolisme glycolyse et mitochondrique est mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire.Bien que l’analyse du flux extracellulaire soit traditionnellement utilisée pour les cellules adhérentes, cette méthode rend les HSPC LSK adhérents aux puits enduits de PLL, ce qui permet de mesurer le flux extracellulaire et donc la santé métabolique des HSPCs LSK. Afin de mesurer la respiration mitochondrique par le taux de consommation d’oxygène et la glycolyse par le taux d’acidification extracellulaire dans des conditions basales et de stress, les médicaments qui interfèrent avec la glycolyse et la respiration mitochondrique sont injectés séquentiellement. Comme prévu, le niveau basal du taux d’acidification extracellulaire est plus élevé pour les HSPCs de LSK cultivés dans le glucose et pyruvate les médias positifs comparés à ceux cultivés dans les médias négatifs.L’injection de glucose n’a pas changé le taux d’acidification extracellulaire pour les cellules cultivés dans les médias positifs, mais elle a stimulé la glycolyse des cellules dans les médias négatifs. Cependant, le niveau basal de ces cellules est resté plus bas dans le groupe positif. L’injection avec l’oligomycine a activé la glycolyse à son niveau maximum dans le groupe positif, mais n’a pas affecté le groupe négatif.L’injection avec l’analogue de glucose à 2-DG a retourné le taux d’acidification extracellulaire aux niveaux non glycolytiques. Pour le test de stress mitochondrial, l’injection d’oligomycine hyperpolarisé la membrane mitochondriale empêchant plus de pompage de protons à travers les complexes ETC et réduisant ainsi le taux de respiration mitochondriale. L’injection de FCCP pousse le taux de consommation d’oxygène au maximum pendant que les cellules essayent de récupérer le potentiel mitochondrique de membrane.L’injection avec deux autres inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons provoque l’arrêt complet de la respiration mitochondriale et donc le taux de consommation d’oxygène est revenu à son niveau minimum. S’il vous plaît éviter l’utilisation de tampon de lyse de globule rouge pour l’isolement cellulaire mononucléaire. Nous recommandons la séparation du gradient Ficoll pour empêcher la formation de touffes et réduire la perte de LSK.En utilisant notre méthode optimisée, nous pouvons mesurer la respiration mitochondrique et la glycolyse des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques rares et fragiles et l’étude des indices métaboliques régulent l’hématopoïèse normale et maligne.

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Research

Recherche

JoVE Journal

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