Surveillance du pH extracellulaire dans les biofilms Cross-Kingdom à l'aide de la microscopie confocale

Le protocole présente une méthode facile à exécuter pour la culture de biofilms trans-royaume composé de StreptococcuS. mutans et Candida albicans. La ratiométrie confocale subséquente du pH à base de microscopie permet une surveillance précise des développements du pH à l’intérieur de la matrice extracellulaire de ces biofilms.

Le choix minutieux des paramètres d’acquisition d’images est de la plus haute importance pour obtenir des données d’image avec un contraste suffisant pour une analyse ultérieure. La ratiométrie du pH est une méthode rapide, précise et peu coûteuse pour étudier les gradients de pH horizontaux et verticaux dans les biofilms trans-royaume en temps réel. La ratiométrie du pH peut également être effectuée dans des biofilms purement fongiques et bactériens.

La méthode contribue à accroître notre compréhension du métabolisme microbien dans les biofilms. Anette Aakjaer Thomsen, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure de croissance du biofilm. Cultivez des S.mutans et des C.albicans sur des plaques d’agar sanguin à 37 degrés Celsius dans des conditions aérobies.

Transférez ensuite des colonies simples de chaque organisme à des tubes à essai remplis de cinq millilitres d’infusion cardiaque cérébrale et cultivez-les pendant 18 heures supplémentaires. Le lendemain, centrifuger les cultures à 1200 g pendant cinq minutes et jeter le surnatant. Resuspendez les cellules en solution saline physiologique et ajustez l’OD 550 à 0,5 pour les C.albicans et les S.mutans.

Ensuite, diluer la suspension S.mutans un à 10 pour atteindre des concentrations équivalentes. Pipette 50 microlitres de solution salivaire stérile dans les puits d’une plaque optique de fond de 96 puits pour la microscopie. Incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis laver la plaque trois fois avec 100 microlitres de solution saline physiologique stérile et vider les puits.

Ajouter 100 microlitres de suspension C.albicans à chaque puits, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis laver le puits trois fois avec de la solution saline. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur à chaque puits. Incuber la plaque pendant deux heures, puis la laver trois fois avec de la solution saline.

Videz les puits mais laissez un réservoir de 20 microlitres pour éviter les forces de cisaillement excessives. Ajouter 100 microlitres de suspension S.mutans et 150 microlitres de BHI avec 5% de saccharose à chaque puits. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures ou plus.

Lorsque vous cultivez des biofilms plus anciens, remplacez le milieu tous les jours. À la fin de la phase de croissance entre royaume, laver la plaque cinq fois avec stérile physiologique saline. Pour l’imagerie par pH ratiométrique, utilisez un microscope à balayage laser confocal inversé avec une lentille d’immersion d’huile ou d’eau 63X, une ligne laser de 543 nanomètres et un système d’imagerie spectrale.

Utilisez un incubateur pour réchauffer le stade du microscope à 35 degrés Celsius. Réglez le détecteur pour la détection simultanée de la fluorescence verte de 576 à 608 nanomètres et de la fluorescence rouge de 629 à 661 nanomètres. Choisissez ensuite une puissance laser appropriée et gagnez pour éviter la surexposition et la sous-exposition.

Réglez la taille du sténopé sur une unité d’air ou une tranche optique d’environ 0,8 micromètre. Réglez ensuite la taille de l’image à 512 par 512 pixels et la vitesse d’analyse à deux. Choisissez une moyenne de deux lignes en utilisant l’option moyenne.

Préparez 100 microlitres de solution saline physiologique stérile avec 0,4% de glucose titré au pH sept. Ensuite, faire une solution de stock de C-SNARF-4 et ajouter le colorant à une concentration finale de 30 micromolaires. Videz l’un des puits avec le biofilm cross-kingdom en laissant un réservoir de 20 microlitres et ajoutez la solution saline avec du glucose et du colorant ratiométrique.

Placez la plaque au stade du microscope et commencez l’imagerie. Préparez une série de tampons MES de 50 millimilliles titrés au pH quatre à 7,8 par incréments de 0,2 pH à 35 degrés Celsius. Pipette 150 microlitres de chaque solution tampon dans les puits d’une plaque optique de fond de 96 puits.

Ajouter le colorant aux puits remplis de tampon à une concentration de 30 micromolaires et laisser équilibrer pendant cinq minutes. Réchauffez le stade du microscope à 35 degrés Celsius et choisissez les mêmes paramètres que pour l’imagerie par pH ratiométrique décrite précédemment. Placez la plaque de 96 puits au microscope et concentrez-vous sur le fond des puits.

Acquérir des images de canaux verts et rouges pour toutes les solutions tampons. À intervalles réguliers, prendre des images avec le laser éteint pour corriger le décalage du détecteur. Effectuez l’expérience d’étalonnage en triplicate et exportez toutes les images sous forme de fichiers TIFF.

Stockez les images vertes et rouges dans des dossiers distincts et renommez les deux séries de fichiers avec des numéros séquentiels. Importez les images dans des logiciels d’analyse d’images dédiés tels que ImageJ. Dans les images prises avec le laser éteint, cliquez sur analyser et histogramme pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence.

Soustrayez cette valeur des images du biofilm en cliquant sur le processus, les mathématiques et soustrayez. Ensuite, importez les deux séries d’images en daime et effectuez une segmentation basée sur le seuil des images du canal rouge en cliquant sur le segment, la segmentation automatique et le seuil personnalisé. Placez le seuil bas au-dessus de l’intensité de fluorescence du cytoplasme fongique et du seuil élevé au-dessous de l’intensité des parois fongiques cellulaires et des bactéries.

Transférez ensuite la couche objet de la série d’images segmentée à la série d’images de canal vert en cliquant sur le segment et en transférant la couche d’objet. Supprimez les pixels non-objet dans la série de canaux rouges et verts. Maintenant, les images de biofilm sont effacées des cellules bactériennes et fongiques et peuvent être exportées sous forme de fichiers TIFF.

Importez la série d’images dans ImageJ et divisez la série d’images rouges par elle-même. Ensuite, multipliez le résultat par la série d’images d’origine. La série d’images qui en résulte est identique à l’original, sauf que tous les pixels d’intensité zéro sont supprimés.

Répétez le processus avec la série d’images vertes. Ensuite, utilisez le filtre moyen sur les deux séries d’images pour compenser le bruit du détecteur. Divisez le vert par la série d’images rouges qui donne ensuite le rapport vert-rouge pour tous les pixels d’objets.

De robustes biofilms cross-kingdom se sont développés dans les plaques de puits après 24 et 48 heures. Les cellules simples et les chaînes de S.mutans regroupées autour des hyphes fongiques et des grands espaces intracellulaires indiquaient la présence d’une matrice volumineuse. Le pH dans l’espace extracellulaire a été visualisé à l’aide d’une table de recherche.

Le pH extracellulaire dans les biofilms a chuté rapidement dans les cinq premières minutes après l’exposition au glucose. Par la suite, l’acidification a ralenti atteignant généralement des valeurs de 5,5 à 5,8 après 15 minutes. En raison des changements locaux de pH, l’intensité de fluorescence dans les biofilms a changé avec le temps.

Lors de la segmentation de l’image, des seuils élevés et bas ont été choisis pour éliminer adéquatement toutes les zones couvertes par les cellules bactériennes et fongiques. Les zones bleues et vertes ont été éliminées par les seuils bas et élevés respectivement. Le choix minutieux des paramètres d’acquisition d’image est crucial pour obtenir un bon contraste entre les cellules bactériennes, les cellules fongiques et la matrice de biofilm.

Si les biofilms trans-royaume sont cultivés dans les cellules d’écoulement, les développements de pH peuvent être surveillés dans l’état de flux imitant ceux dans la cavité buccale. La ratiométrie du pH a été utilisée pour identifier les zones locales dans les biofilms dentaires dont le pH est particulièrement faible, ce qu’on appelle les points chauds acidogènes.