Name: Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur linvasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez l'évaluation des inhibiteurs migrastatiques dans des modèles de gliome 3D par microscopie confocale haute résolution. Cette méthode permet d'analyser précisément l'efficacité des médicaments anticancéreux.

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Nous tenons à remercier le professeur Chris Jones d'avoir contribué à la lignée cellulaire KNS42. Le microscope confocal Zeiss LSM880 avec AiryScan utilisé dans ce travail fait partie du Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP) financé par le Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth Deal. Crédit pour l'image de microscope Figure 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Génération de sphéroïdes cellulaires
Jour 1
<ol><li>Préparer le milieu de culture standard comme l'exige la ligne cellulaire faisant l'objet de l'enquête.</li>
	<li>Effectuer toutes les étapes associées à la culture tissulaire dans une hotte de culture tissulaire en utilisant des techniques de manipulation stériles.</li>
	<li>Trypsiniser et compter les cellules cancéreuses. Utiliser 20 ml de suspension cellulaire par assiette. Gardez les suspensions cellulaires dans des tubes universels stériles clairement étiquetés.</li>
	<li>Ajoutez un nombre prédéterminé de cellules à chaque puits. Le nombre initial de cellules et la taille ultime du sphéroïde requis dépendent du taux de prolifération de la lignée cellulaire à l'étude. REMARQUE: Pour les lignées cellulaires de gliomes établies telles que U251 et KNS429,10, 5 x 103 cellules/mL produiront un sphéroïde microscopiquement visible (200 ou 800 m) après 4 jours d'incubation.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans des tubes universels par inversion douce pour éviter l'agglutination cellulaire. Pipette 200 l de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Si tous les puits ne sont pas nécessaires, il est conseillé d'ajouter 200 L de 1x PBS à chaque puits vide pour éviter l'évaporation.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur comme d'habitude à 37 oC. REMARQUE: Les lignées cellulaires telles que les lignées cellulaires cancéreuses du gliome formeront des sphéroïdes dans les 24 h. Permettre à l'architecture cellulaire 3D de se former en couvant le sphéroïde pendant 72 h.</li>
</ol>Jour 2
<ol start="7"><li>Vérifier les cellules par microscopie de champ lumineux après 24 h. Selon la lignée cellulaire, les cellules peuvent avoir formé un sphéroïde détectable au fond du puits. REMARQUE: Les lignées cellulaires cancéreuses établies de gliome forment facilement des sphéroïdes dans un délai de 24 h. Les lignées de cellules cancéreuses du gliome dérivées du patient peuvent prendre jusqu'à 1-2 semaines.</li>
</ol>2. Collagen Invasion Assay
Jour 3
<ol><li>Placer le collagène, le milieu de culture 5x, 1 M NaOH, et un tube de 20 ml sur la glace.</li>
	<li>Ajouter soigneusement et lentement 10,4 ml de collagène froid dans un tube de culture réfrigéré. Évitez les bulles. Cette quantité de collagène est suffisante pour une plaque de 96 puits. La mise à l'échelle est possible, mais il est recommandé qu'un tube de 20 ml par plaque soit préparé à la fois.</li>
	<li>Ajouter délicatement 1,52 ml de milieu de culture stérile froid 5x. Évitez les bulles.</li>
	<li>Juste avant l'utilisation, ajouter délicatement 72 'L de froid stérile 1 M NaOH. Gardez la solution sur la glace.</li>
	<li>Mélanger délicatement par pipetting. Évitez les bulles. Un mélange efficace entraîne un changement de couleur (du rouge au rouge orange (pH 7,4) dans le milieu. Laisser le mélange sur la glace jusqu'à l'utilisation.</li>
	<li>Étape cruciale : Retirez 190 l de supernatant de la plaque de 96 puits préparée le jour 1. Soyez très prudent de ne pas déranger les sphéroïdes qui se sont formés dans le fond du puits. Utilisez la pipette à un angle vers le côté, et non au centre, du puits.</li>
	<li>Ajouter délicatement 100 l du mélange de collagène à chaque puits. Pour éviter toute perturbation sphéroïde, pipette le mélange sur le côté du puits. Évitez les bulles. Conservez le reste du mélange de collagène dans le tube de 20 ml à température ambiante pour évaluer la polymérisation.</li>
	<li>Incuber la plaque dans l'incubateur pendant au moins 10 min pour permettre au collagène de polymériser. Comme ligne directrice, si le collagène restant a réglé, devenant semi-solide et éponge-comme, les sphéroïdes sont prêts à être traités avec l'inhibiteur.</li>
	<li>Ajouter les médicaments ou les inhibiteurs à la concentration 2x au milieu de la culture. Ajouter doucement le milieu à chaque puits (100 l par puits). Encore une fois, pipette le milieu sur le côté du puits pour éviter les perturbations sphéroïdes.</li>
	<li>Observez et imagez chaque sphéroïde par microscopie de champ lumineux à des moments T - 0 h, 24 h, 48 h, et 72 h pour évaluer l'activité de drogue. Puis remettez la plaque à l'incubateur. REMARQUE: Selon le comportement invasif de la lignée cellulaire, la migration loin du noyau sphéroïde d'origine peut être observée à partir de 24 h.</li>
</ol>3. Préparation de sphéroïdes incorporés au collagène et de cellules migratrices pour la microscopie confocale
<ol><li>Placer la plaque dans une hotte de culture tissulaire et retirer délicatement le supernatant (200 l). Encore une fois, prendre soin de ne pas déranger le sphéroïde et éviter de toucher le collagène, car cela peut interférer avec le bouchon de collagène.</li>
	<li>Remplacer le supernatant par 100 OL de 1x PBS. Répétez cette étape de lavage 3x.</li>
	<li>Retirer le lavage final et remplacer par 4 % de formaldéhyde dans 1 x PBS (100 l par puits). MISE EN GARDE: Le formaldéhyde est un cancérogène potentiel. Manipuler avec soin conformément aux directives de santé et de sécurité.</li>
	<li>Placer la plaque de 96 puits sur un banc de laboratoire, couvrir de papier d'aluminium et laisser reposer 24 h à température ambiante.</li>
	<li>Retirez soigneusement le formaldéhyde et remplacez-le par 1x PBS. Répétez ce lavage 1x PBS 3x.</li>
	<li>Préparer 0,1% Triton X-100 en 1x PBS. Retirez le lavage 1x PBS et remplacez-le par 100 L de la solution Triton X-100. Incuber 30 min à température ambiante. En attendant, préparer la solution de blocage avec 1x PBS et 0,05% de lait écrémé en poudre et bien mélanger.</li>
	<li>Retirez Triton X-100 et lavez 3x avec 1x PBS. Ajouter 100 l de solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 15 min.</li>
	<li>Diluer l'anticorps primaire requis pour bloquer le tampon à la concentration prédéterminée. Ici, utilisez l'anticorps anti-souris IgG acétylé tubulin (1:100).</li>
	<li>Centrifugeuse le mélange tampon principal de blocage d'anticorps pendant 5 min à 15 682 x g. Retirez soigneusement la solution de blocage et ajoutez le supernatant (25 à 50 l) à chaque puits. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Retirez la solution d'anticorps et lavez 3x avec 1x PBS (100 l par puits).</li>
	<li>Diluer l'anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration recommandée ou prédéterminée en plus de toutes les taches fluorescentes supplémentaires. Ici, utilisez 1:500 anticorps conjugués anti-souris fluorophore-488, phalloidin-594 (1:500) pour la coloration d'actine, et la tache d'ADN (DAPI).</li>
	<li>Encore une fois, centrifuger la solution d'anticorps secondaire pour 5 min à 13.000 tr/min.</li>
	<li>Retirez la solution de blocage de chaque puits et ajoutez 25 à 50 L du mélange anticorps/phalloidin/DAPI secondaire. Incuber dans l'obscurité pendant 1,5 h à température ambiante.</li>
	<li>Enlever la solution secondaire de teinture d'anticorps et laver 3x avec 1x PBS (100 L par puits).</li>
	<li>Soulevez soigneusement les bouchons individuels de collagène par aspiration avec une pipette en plastique (200 l) sur le centre d'un toboggan en verre ordinaire de haute qualité.</li>
	<li>Ajouter une goutte d'un mondeur approprié à la prise de collagène, en veillant à ce que la fiche soit complètement recouverte. Évitez les bulles.</li>
	<li>Appliquer le bordereau de l'épaisseur optimale pour l'objectif du microscope qui sera utilisé pour l'imagerie et permettre de définir pendant la nuit. Conserver les toboggans à température ambiante dans l'obscurité.</li>
</ol>4. Microscopie fluorescence
<ol><li>Capturez des images fluorescentes à l'aide d'un microscope confocal approprié.</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
<li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics+Technologies%22%5BJournal%5D)">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li>
<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPont%C3%A9n%2C+J+%22Human+Tumor+Cells+in+Vitro%22">Human Tumor Cells in Vitro</a>. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).</li>
<li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line%2C+KNS-42%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologica+Medico+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li>
<li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li>
<li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li>
<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
<li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Une nouvelle manière de créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses pour identifier l'activité migrastatique de drogue utilisant la microscopie confocale de haute résolution est décrite. L'utilisation de plaques adhérentes faibles sur d'autres techniques, telles que les gouttes suspendues15, a facilité un moyen de générer des sphéroïdes reproductibles et uniformes pour une utilisation dans la migration du collagène et les essais d'invasion. Les points critiques dans ce protocole sont l'enlèvement...

Les technologies sphéroïdes tridimensionnelles pour la découverte de médicaments précliniques et le développement de médicaments anticancéreux potentiels sont de plus en plus favorisées par-dessus les écrans de médicaments conventionnels; ainsi, il y a plus de développement des drogues migrastatiques — migration et invasion — . La raison d'être de ces développements dans le traitement du cancer est claire : les essais sphéroïdes 3D représentent une approche plus réaliste pour le dépistage des médicaments anticancéreux potentiels, car ils imitent l'architecture tumorale 3D plus fidèlement que les cultures monocouches cellulaires, récapitulez les interactions médicament-tumeur (cinétique) avec plus de précision, et permettez la caractérisation de l'activité médicamenteuse dans un cadre lié à la tumeur. En outre, l'augmentation de la résistance aux médicaments chimiotoxiques dans de nombreux types de cancer et les taux de mortalité élevés chez les patients atteints de cancer en raison de métastes potentialisées par la capacité des cellules cancéreuses à migrer vers des sites tumoraux éloignés soutient l'inclusion d'agents chimiothérapeutiques ciblant le potentiel migratoire des cellules cancéreuses comme traitement adjuvant dans les futurs essais cliniques sur le cancer1. C'est particulièrement le cas dans les cancers très invasifs, tels que les glioblastomes à haute teneur (GBM). La gestion de GBM inclut la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Cependant, même avec le traitement de combinaison, la plupart des patients rechutent dans un délai de 1 an du diagnostic initial avec une survie médiane de 11-15 mois2,3. D'énormes progrès dans le domaine de la technologie 3D ont été réalisés au cours des dernières années : systèmes rotatifs, structures microfabriquées et échafaudages 3D, et d'autres essais individuels sont continuellement améliorés pour permettre des essais de routine à grande échelle4, 5,6,7. Cependant, les résultats obtenus à partir de ces essais doivent être analysés de manière significative, car l'interprétation des données est souvent entravée par les tentatives d'analyse des données générées en 3D avec des systèmes d'analyse d'images 2D.
Bien qu'ils soient préférables en termes de vitesse d'acquisition d'images et de réduction de la toxicité de la photo, la plupart des systèmes à champ large restent limités par la résolution8. Ainsi, en dehors des données de lecture relatives à l'efficacité des médicaments, les effets détaillés de l'action médicamenteuse sur les structures cellulaires 3D des cellules migrantes sont inévitablement perdus s'ils sont représentés à l'aide d'un système à champ large. Inversement, la microscopie par balayage laser confocal (CLSM) capture des images de haute qualité, sectionnement optique qui peuvent être reconstruites et rendues en 3D après l'acquisition à l'aide d'un logiciel informatique. Ainsi, CLSM est facilement applicable à l'imagerie complexe structures cellulaires 3D, permettant ainsi l'interrogation des effets des inhibiteurs anti-migrastatic sur les structures 3D et des analyses approfondies des mécanismes de migration cellulaire. Cela guidera sans aucun doute le développement futur de médicaments migrastatiques. Ici, un flux de travail combiné de la génération sphéroïde, du traitement de drogue, du protocole de coloration, et de la caractérisation par microscopie confocale à haute résolution est décrit.

<table><tbody><tr><td>Collagène I, queue de rat, 100 mg</td><td>de Corning</td><td>354236</td><td>pour le test d’invasion du gliome ; ceci est offert par de nombreux distributeurs/fabricants et devra être déterminé à la fois pour le type de test prévu et les lignées cellulaires utilisées. Pour les lignées cellulaires de gliome, le collagène de type 1 (par exemple Corning) est le choix préféré. Le collagène doit être stocké à 4 &deg ; C, dans l’obscurité, jusqu’à ce que cela soit nécessaire. Il n’est pas conseillé de mélanger du collagène de différents lots car cela pourrait affecter la consistance du collagène polymérisé. &nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Lamelles,</td><td></td><td>diverses, diverses</td><td>pour l’imagerie microscopique</td></tr><tr><td>, poudre DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5648</td>, <td>nécessaire à une concentration de 5x pour la solution de collagène pour le test d’invasion de gliome ; &nbsp ; Celui-ci peut être acheté sous forme de poudre, préparé dans de l’eau doublement distillée et, selon la composition finale du milieu de croissance, complété avec tous les additifs nécessaires. La solution complète 5x doit être filtrée à travers un système de filtre à seringue (0,22 &mu ; m) avant utilisation.</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>nécessaire pour la culture cellulaire de lignées cellulaires de gliome</td></tr><tr><td>Lames</td><td>de verre diverses</td><td></td><td>diverses pour l’imagerie microscopique</td></tr><tr><td>Glycémie élevée DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>nécessaire pour la culture cellulaire de lignées cellulaires de gliome</td></tr><tr><td>Inhibiteur</td><td>Tocris</td><td>divers</td><td>divers - selon la conception expérimentale ; Les inhibiteurs peuvent être achetés auprès de fabricants tels que Selleckchem et Tocris. Ces fabricants offrent une description détaillée des caractéristiques de l’inhibiteur, des liens vers les références associées et des suggestions de concentrations de travail. Comme pour tous les inhibiteurs, ils peuvent être potentiellement toxiques et doivent être manipulés conformément aux directives de santé et de sécurité. Les inhibiteurs sont préparés sous forme de solutions mères recommandées par le fabricant. À titre d’exemple, nous avons utilisé l’inhibiteur migrastatique MI-192 pour démontrer l’utilisation de tels inhibiteurs. Nous avons testé une gamme d’inhibiteurs migrastatiques de cette manière avec des résultats comparables.</td></tr><tr><td>Montage</td><td>divers</td><td></td><td>pour l’imagerie microscopique</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>divers&nbsp ;</td><td>divers</td><td>NaOH peuvent être achetés à la molarité requise ou préparés à partir de forme solide. La solution préparée doit être stérilisée à l’aide d’un système de filtre à seringue. Un M NaOH est corrosif et des précautions doivent être prises lors de la préparation de la solution.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>divers</td><td>divers</td><td>pour la fixation des sphéroïdes et des cellules ; compenser à 4 %, mettre en garde contre les risques pour la santé, s’assurer que les réglementations en matière de santé et de sécurité sont respectées pour le collagène solution pour l’essai d’invasion</td></tr><tr><td>Pastettes (pipette graduée, 3 mL)</td><td>divers</td><td>divers</td><td>pour l’essai d’invasion, élimination de la solution</td></tr><tr><td>PBS, stérile pour la culture tissulaire</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML&nbsp ; &nbsp ;</td><td>nécessaire pour la culture cellulaire de lignées cellulaires de gliome et les lavages pour la coloration</td></tr><tr><td>Pen/streptocoque (antibiotiques)</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>nécessaire pour la culture cellulaire de lignées cellulaires de gliome</td></tr><tr><td>Anticorps primaire, anticorps secondaire, DAPI, Phalloïdine</td><td>divers</td><td></td><td>divers il existe de nombreux fabricants pour ces réactifs, pour les anticorps marqués secondaires, nous recommandons Alexa Fluor (sondes moléculaires). Ici, nous avons utilisé pour les anticorps primaires l’anticorps anti-tubuline acétylée de souris (1/100, Abcam). Pour les anticorps secondaires, nous avons utilisé un anticorps conjugué 1/500 anti-souris Alexa Fluor 488, des sondes moléculaires. Pour la coloration nucléaire, nous avons utilisé le DAPI (de nombreux fabricants) et le colorant d’actine Phalloidin (de nombreux fabricants), tous deux utilisés à la dilution recommandée de 1/500.</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S5761</td><td>nécessaire pour la solution de collagène pour le test d’invasion de gliome à une concentration de 5x</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>nécessaire pour la solution de collagène pour le test d’invasion de gliome à une concentration de 5x</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>pour la trypsinisation</td></tr><tr><td>Plaques de fixation ultra basses</td><td>Sigma/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>pour le dosage de l’invasion du gliome ; Une plaque à faible adhérence est requise, les plaques à 96 puits étant préférées pour permettre un criblage à grande échelle des composés à l’étude. Il existe plusieurs plaques à faible adhérence disponibles dans le commerce ; Il est conseillé de tester une variété de plaques pour une génération optimale de sphéroïdes. D’après notre expérience, Costar Ultra Low Cluster avec couvercle, à fond rond, fonctionne mieux pour la génération de sphéroïdes à partir de cellules cancéreuses de gliome en termes de formation et de reproductibilité de sphéroïdes à 100 %. Ces plaques ont également été utilisées avec succès pour la génération de sphéroïdes de gliome à partir de matériel dérivé de patients, de cellules cancéreuses de la vessie et de l’ovaire dans notre laboratoire. De plus, des neurosphères souches ou progénitrices peuvent être utilisées dans ces plaques pour faciliter la génération de neurosphères-sphéroïdes standardisées</td></tr><tr><td>Stripettes (pipettes sérologiques, stériles, 5 mL et 10 mL)</td><td>divers par exemple Costar</td><td>CLS4488-50 ; CLS4487-50</td><td>pour la culture tissulaire et la préparation de collagène</td></tr><tr><td>Divers multicanaux (50 - 250 &mu ; L) et les pipettes monocanaux (10 &mu ; L, 50 &mu ; L, 200 &mu ; L 1 mL)</td><td>divers</td><td>divers</td><td>pour la manipulation des cellules et des sphéroïdes</td></tr><tr><td>Microscopie à grand champ</td><td>divers&nbsp ;</td><td>divers</td><td>pour l’observation de la génération de sphéroïdes et l’imagerie sphéroïde ; ici, des images de fluorescence à grand champ ont été capturées à l’aide d’un système d’imagerie cellulaire EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 CLSM équipé d’un objectif à huile Plan Apochromat 63x 1.4 NA</td> Citation <td>Zeiss</td><td>du fabricant Des</td><td>images confocales ont été capturées à l’aide d’un Zeiss LSM 880 CLSM équipé d’un objectif à huile Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Les lasers à diode 405 nm, 458/488/514 nm à argon multiligne et HeNe 594 nm ont été utilisés pour exciter respectivement la phalloïdine 594, l’Alexa Fluor 488 et le DAPI. Pour chaque image, une seule section optique représentative a été capturée, tous les paramètres, tant avant et après la capture d’image, étant conservés à des fins de comparaison. Toutes les images ont ensuite été traitées à l’aide du logiciel d’imagerie Zen associé et d’Adobe Photoshop.</td></tr></tbody></table>

caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3d par microscopie confocale de haute résolution

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

La découverte et le développement de médicaments dans la recherche sur le cancer sont de plus en plus basés sur des écrans de médicaments dans un format 3D. De nouveaux inhibiteurs ciblant le potentiel migratoire et invasif des cellules cancéreuses, et par conséquent la propagation métastatique de la maladie, sont découverts et considérés comme des traitements complémentaires dans les cancers hautement invasifs tels que les gliomes. Ainsi, la génération de données permettant des analyses détaillées des cellules dans un environnement 3D après l'ajout d'un médicament est nécessaire. La méthodologie décrite ici, combinant des essais d'invasion sphéroïde avec la capture d'image à haute résolution et l'analyse des données par microscopie à balayage laser confocal (CLSM), a permis une caractérisation détaillée des effets de l'inhibiteur anti-migratoire potentiel MI-192 sur les cellules de gliome. Des sphéroïdes ont été produits à partir des lignées cellulaires pour des essais d'invasion dans les plaques de 96 puits adhérentes basses et ont ensuite préparé pour l'analyse de CLSM. Le flux de travail décrit a été préféré à d'autres techniques de production sphéroïde couramment utilisées en raison de la facilité et de la reproductibilité. Ceci, combiné à la résolution d'image améliorée obtenue par microscopie confocale par rapport aux approches conventionnelles à large champ, a permis l'identification et l'analyse des changements morphologiques distincts dans les cellules migratrices dans un environnement 3D suivant traitement avec le médicament migrastatique MI-192.

La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicamenteuses parce qu'elle est plus représentative de l'environnement spécifique au cancer. La génération de sphéroïdes peut être réalisée de plusieurs façons; des plaques de 96 puits à faible adhérence ont été utilisées dans ce protocole. Après avoir testé plusieurs produits de différents fabricants, les plaques utilisées ici ont été choisies parce qu'elles ont toujours obtenu les meilleurs ré...

Les effets des inhibiteurs migrastatiques sur la migration de cellules cancéreuses de glioma dans les essais tridimensionnels (3D) d'invasion utilisant un inhibiteur de l'histone deacetylase (HDAC) sont caractérisés par la microscopie confocale à haute résolution.

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Ce protocole démontre que nous pouvons maintenant déterminer l’effet des inhibiteurs migrastatiques en détail dans les modèles de cancer 3D. Le principal avantage est la facilité et l’approche tout-en-un avec laquelle cette technique peut être effectuée. Cette technique permet l’évaluation des médicaments migrastatiques dans la recherche sur le cancer dans un cadre 3D, permettant l’essai de médicaments dans un environnement plus tumoral pertinent.Cette méthode peut être appliquée au dépistage des médicaments cytotoxiques dans le cancer ou, par exemple, pour évaluer l’effet des radiations sur la prolifération du cancer et la migration cellulaire. Il est utile de pratiquer l’étape d’enlèvement moyen et le remplacement de collagène avec des plaques ordinaires de 96 puits pour devenir confiant. En outre, la formation sur un microscope confocal est essentielle.La démonstration visuelle de cette technique est essentielle pour que les chercheurs comprennent la manipulation délicate requise des sphéroïdes et leur utilisation dans la microscopie confoccale. Le premier jour de l’expérimentation, ont le milieu de culture standard, dans ce cas, U251, prêt pour la ligne cellulaire appropriée. Dans une hotte de culture tissulaire, ajouter 0,5 millilitres de trypsine dans la culture pour trypsiniser les cellules cancéreuses.Comptez les cellules cancéreuses sur un hémocytomètre, et diluer à une concentration de cinq fois 10 à la troisième cellule par millilitre. Gardez les suspensions cellulaires dans des tubes universels clairement étiquetés et stériles. Resuspendez les cellules par inversion douce pour éviter l’agglutination cellulaire.Utilisez une pipette pour ajouter 200 microlitres de la culture cellulaire à chaque puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter 200 microlitres de 1X PBS à chaque puits vide pour éviter l’évaporation. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius.Après 24 heures, vérifiez les cellules par microscopie à champ lumineux. Les lignées cellulaires telles que les lignées cellulaires cancéreuses du gliome forment des sphéroïdes au fond du puits dans les 24 heures. Incuber les sphéroïdes pendant encore 48 heures pour permettre à une architecture cellulaire 3D de se former.Le troisième jour, placez du collagène, un milieu de culture 5X, un hydroxyde de sodium molaire et un tube de 20 millilitres sur la glace. Ajouter soigneusement et lentement 10,4 millilitres de collagène froid dans le tube de culture réfrigéré. Évitez les bulles.Ajouter ensuite délicatement 1,52 millilitres de milieu de culture 5X stérile froid. Évitez les bulles. Juste avant l’utilisation, ajouter délicatement 72 microlitres d’hydroxyde de sodium stérile froid et un molaire, et garder la solution sur la glace.Mélanger délicatement en pipetage et en évitant les bulles. Un mélange efficace conduit à un changement de couleur du rouge au rouge orangé dans le milieu. Laisser le mélange sur la glace jusqu’à utilisation.Ensuite, pour enlever 190 microlitres de supernatant de la plaque de 96 puits préparée le premier jour, utilisez une pipette à un angle vers le côté du puits. Veillez à ne pas déranger les sphéroïdes qui se sont formés au fond du puits. Ajouter délicatement 100 microlitres du mélange de collagène à chaque puits, en descendant le côté du puits.Évitez les bulles et toute perturbation sphéroïde. Conservez tout mélange de collagène restant dans le tube de 20 millilitres à température ambiante pour évaluer la polymérisation. Incuber la plaque dans l’incubateur pendant au moins 10 minutes pour permettre au collagène de polymériser.Lorsque les restes de collagène deviennent semi-solubles et éponge-like, les sphéroïdes sont prêts à être traités avec inhibiteur. Ajouter les inhibiteurs à la concentration de 2X à cinq millilitres de milieu de culture. Pipette 100 microlitres du milieu doucement sur le côté de chaque puits pour éviter les perturbations sphéroïdes.Observez et imagez chaque sphéroïde par microscopie à champ lumineux à des moments de zéro heure, 24 heures, 48 heures et 72 heures pour évaluer l’activité médicamenteux. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur. Maintenant, placez la plaque dans une hotte de culture tissulaire, et remplacez doucement le supernatant par 100 microlitres de 1X PBS.Prenez soin de ne pas déranger le sphéroïde, et éviter de toucher le collagène. Répétez cette étape de lavage trois fois de plus. Retirer le lavage final dans chaque puits et remplacer par 100 microlitres de formaldéhyde de 4 % en 1X PBS.Déposer la plaque de 96 puits sur un banc de laboratoire, couvrir de papier d’aluminium et laisser pendant 24 heures à température ambiante. Le lendemain, retirez soigneusement le formaldéhyde et remplacez-le par 1X PBS. Répétez ce lavage trois fois de plus.Ensuite, remplacez le lavage 1X PBS par 100 microlitres de solution Triton X-100 fraîchement préparée. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Entre-temps, préparer la solution de blocage avec 50 millilitres de 1X PBS et 05% de lait écrémé en poudre dans un tube de 50 millilitres, et bien mélanger.Après 30 minutes, retirer le Triton X-100 et laver trois fois avec 1X PBS. Ajouter 100 microlitres de la solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 15 minutes. Ensuite, diluer l’anti-souris IgG anticorps à base de tubuline acétylated dans le tampon de blocage à un rapport de un à 100.Centrifugeuse le mélange tampon primaire anticorps bloquant pendant cinq minutes à 15, 682 fois g. Retirez soigneusement la solution de blocage dans chaque puits et ajoutez de 25 à 50 microlitres du supernatant tampon bloquant les anticorps du tube. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure.Ensuite, retirez la solution d’anticorps de chaque puits et lavez-la trois fois avec 100 microlitres de 1X PBS. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration recommandée en plus de toute tache fluorescente supplémentaire. Encore une fois, centrifugeuse de la solution d’anticorps secondaire pendant cinq minutes à 15, 682 fois g.Retirez la solution de blocage de chaque puits et ajoutez de 25 à 50 microlitres du supernatant anticorps secondaire. Incuber dans l’obscurité pendant 1 1/2 heure à température ambiante. Retirez la solution secondaire de colorant anticorps et lavez-la trois fois avec 1X PBS, 100 microlitres par puits.Soulevez soigneusement les bouchons individuels de collagène par aspiration avec une pipette en plastique de 200 microlitres sur le centre d’une glissière en verre. Ajouter une goutte d’un montage approprié pour couvrir le bouchon de collagène. Placez un coverslip sur le dessus de l’échantillon et rangez la lame à température ambiante dans l’obscurité.La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicament-tumeur parce qu’elle est plus représentative de l’environnement spécifique au cancer. Dans cette étude, des effets anti-ou pro-migratoires potentiels ont été détectés. Ceci est particulièrement visible dans KNS42 avec apparemment aucune migration dans le contrôle ou les sphéroïdes traités.La mort cellulaire a été observée à la concentration inhibitrice la plus élevée de 10 micromolaires. La fragmentation nucléaire et les cellules migrantes étaient évidentes dans les cellules U251. Les sphéroïdes de cellules U251 ont eu des pointes rayonnant loin du sphéroïde original, avec l’arrondi croissant de cellules dans les cellules apparentes avec la concentration croissante d’inhibiteur.Des microtubules effondrés et la fragmentation nucléaire ont été observés dans KNS42. Les saillies sheetlike avec des pointes de cellule simple indiquent la migration de KNS42. À la concentration d’inhibiteur la plus basse, ce phénotype a été prononcé mais a été perdu avec la concentration croissante d’inhibiteur.Il est crucial de laisser tous les reagents sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts. Sinon, le collagène commence à polymériser avant qu’il n’ait été ajouté aux sphéroïdes. Il est possible de quantifier les images générées par la microscopie confoccale pour évaluer les effets, par exemple, des médicaments migrastatiques sur la morphologie cellulaire.Il nous a permis, pour la première fois, de confirmer l’effet de l’inhibiteur migrastatique MI-192 sur les niveaux d’acétylation microtubule et d’explorer cette question plus en termes de migration cellulaire. Un soin supplémentaire doit être pris lors de la manipulation du formaldéhyde pour l’étape de fixation. Les lignes directrices habituelles en matière de santé et de sécurité s’appliquent.

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Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Modèles de l'invasion des cellules tumorales en trois dimensions de la matrice extracellulaire de mieux refléter...

Modélisation et Imagerie en 3 dimensions l&#39;invasion des cellules collectives

Source : Guyon, J., et al. Un modèle sphéroïde 3D pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo démontre la génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Les sphéroïdes sont formés à partir de cellules tumorales du cerveau humain et intégrés dans une matrice de collagène. Les cellules tumorales à la périphérie des sphéroïdes adoptent un phénotype invasif, sécrétant des protéases pour dégrader le collagène et progressant pour envahir la matrice...

Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante.  Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I.  L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

Ce protocole vise à évaluer l’effet des facteurs pro - et anti - migratory sur la migration cellulaire dans une matrice de fibrine en trois dimensions.

Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.

Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

Découvrez l'évaluation des inhibiteurs migrastatiques dans des modèles de gliome 3D par microscopie confocale haute résolution. Cette méthode permet d'analyser précisément l'efficacité des médicaments anticancéreux.

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur linvasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution (Vidéo) | JoVE Journal

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

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