Name: Livraison intrathécale dOligonucléotides antisens dans le système nerveux central de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Découvrez une méthode de livraison intrathécale d'oligonucléotides antisens dans le système nerveux central du rat par implantation de cathéter. Cette technique sûre et économique permet d'évaluer la pharmacocinétique et l'efficacité des traitements.

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Nous tenons à remercier Ionis Pharmaceuticals d'avoir fourni les AsOs décrits dans l'article.

Toutes les procédures in vivo ont été effectuées dans le cadre des protocoles approuvés par le Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) qui suivent les lignes directrices énoncées par le guide des National Institutes of Health des États-Unis pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation du matériel et des instruments
<ol><li>Préparer les cannulas guide spécial.<ol>
<li>Utilisez un outil rotatif avec roue de coupure (ou scie pointue) pour couper les deux extrémités d'une aiguille de 19 G, ce qui donne une canule guide de 1,5 à 2 cm de long (figure 1Aiii). Utilisez la meule de l'outil rotatif pour lisser les deux extrémités. REMARQUE : Alternativement, les canules préfabriquées et stériles de guide peuvent être achetées d'un vendeur commercial (tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le cathéter/l'assemblage du fil.<ol>
<li>Couper un morceau de tuyaute PE-10 de 8 cm de long (tube en polyéthylène, diamètre 0,011 pouce) pour servir de cathéter intrathécal. Faire une marque de 2 cm d'une extrémité avec un stylo marqueur résistant à l'éthanol. Coupez un fil de stylet de 11 cm de long à partir d'un fil en acier inoxydable recouvert de polytétrafluoroéthylène. Insérer le fil stylet (Figure 1Aii) dans le lumen du cathéter PE-10 (Figure 1Ai). REMARQUE : Un ensemble d'ensemble cathéter/fil (figure 1Av) est nécessaire pour chaque animal. Alternativement, les cathéters et les fils de stylet peuvent être achetés auprès d'un vendeur commercial (Table of Materials).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer l'assemblage du cathéter de livraison.<ol>
<li>Couper un morceau de cathéter PE-50 (5 à 10 cm, tube en polyéthylène, diamètre 0,023 pouce) (Figure 1Bi). À une extrémité du cathéter PE50 insérer un adaptateur de tubes 23 G (Figure 1Biv). Cette extrémité sera reliée à une seringue de 100 l(Tableau des Matériaux)pendant la chirurgie. Insérer une aiguille modifiée de 30 G avec moyeu coupé (Figure 1Biii) dans un morceau d'environ 0,5 cm de tube PE-10 (Figure 1Bii) et connecter le tube PE-10 à l'autre extrémité du cathéter.</li>
		<li>L'extrémité de l'aiguille de 30 G de l'assemblage du cathéter de livraison (Figure 1Bv) sera reliée à l'extrémité distale du cathéter PE-10 implanté dans le rat pendant la chirurgie. REMARQUE : Alternativement, l'assemblage du cathéter de livraison (figure 1Bv) peut être acheté auprès d'un vendeur commercial ( Tableaudes matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer l'assemblage de la canule-aiguille guide (Figure 1Avi) en plaçant une canule guide (figure 1Aiii) à l'extrémité d'une aiguille de 23 G.</li>
	<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux, y compris la canule guide et les ensembles de fils/cathéters à l'aide d'un stérilisateur à oxyde d'éthylène pendant 12 h. REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux excepté le cathéter peuvent être autoclaved ; cathéter fondra à haute température.</li>
</ol>2. Préparation chirurgicale
REMARQUE : Cette procédure est régulièrement exécutée sur les rats mâles et femelles de Sprague Dawley avec des poids corporels entre 200 g et 400 g. Deux rats sont logés par cage sous un cycle de 12 h de lumière/obscurité avec un accès gratuit à la nourriture et à l'eau.
<ol><li>Poids d'un rat et placez-le dans une chambre isoflurane pour induire l'anesthésie (1 à 5% isoflurane en O2, titré à effet). REMARQUE: Le rat est alors continuellement anesthésié avec l'isoflurane pour maintenir l'anesthésie profonde par l'intermédiaire d'un cône de nez tout au long de la procédure. Une autre méthode d'anesthésie (p. ex., administration de la kétamine 100 mg/kg et de la xylazine 10 mg/kg) peut être utilisée comme approuvé par l'IACUC.</li>
	<li>Lorsque le rat ne répond pas à une pincée d'orteil, raser son dos de la queue à la colonne thoracique caudale et placer le rat rasé sur une feuille stérile posée sur un coussin chauffant.</li>
	<li>Placez un tube conique de centrifugeuse de 50 ml sous l'abdomen du rat pour fléchir la colonne vertébrale dans la région lombaire (figure 2A) et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.</li>
	<li>Injecter de la buprénorphine à libération soutenue (1,0 mg/kg; Tableau des matériaux) sous-cutanée dans le rat. Nettoyez la peau exposée avec des gommages alternés de povidone et d'alcool et répétez-le trois fois. REMARQUE : Un autre soulagement de la douleur peut être utilisé tel qu'approuvé par le protocole de l'IACUC.</li>
	<li>Drapez l'animal avec un drapé transparent stérile qui a été fenestrated au-dessus du site chirurgical.</li>
</ol>3. Chirurgie
<ol><li>Avec le rat soutenu par le tube conique de 50 ml, identifiez les deux fosses naturelles entre les muscles au-dessus du bassin (flèches dans la figure 2A). D'une main tenant ces fosses, utilisez l'autre main pour presser doucement et sentir la colonne vertébrale de la direction caudale à rostrale et de trouver la première indentation majeure entre les vertèbres et c'est l'espace intervertébral entre les vertèbres S1 et L6(Figure 2B ).</li>
	<li>Déplacez-vous légèrement vers le roséement pour identifier la prochaine indentation, l'espace intervertébral entre les vertèbres L5 et L6 et le site d'injection (à la figure 2A). Utilisez un scalpel pour faire une incision d'au plus 2 cm de long dans la peau le long de la ligne médiane de rostral à caudal de sorte que le site d'injection est au centre de l'incision (ligne pointillée dans la figure 2A).</li>
	<li>Utilisez des ciseaux de dissection pour disséquer le tissu conjonctif afin de visualiser la couche musculaire. Ensuite, faire une incision de 1 cm dans la capsule musculaire immédiatement latérale au processus spinal dorsal de la vertèbre lombaire L6. REMARQUE : Les os de la vertèbre lombaire L6 pourraient être visualisés à ce stade.</li>
	<li>Placez l'assemblage de canules-aiguilles du guide près de l'aspect antérieur de la 6e vertèbre lombaire et poussez-le dans l'espace intervertébral le long de l'aspect antérieur de la 6e vertèbre afin que l'extrémité de l'aiguille pénètre dans le canal rachidien. Poussez la canule guide en place le long de l'aiguille et retirez l'aiguille de 23 G en ne laissant que la canule du guide en place. REMARQUE : Il est utile d'utiliser des forceps émoussés pour localiser le processus dorsal de la vertèbre lombaire L6 avant d'insérer l'aiguille. En général, on peut voir du liquide CSF entrer dans le moyeu de l'aiguille (ce liquide peut être teinté d'un soupçon de sang, mais cela n'indique pas que des dommages ont été causés ou que l'aiguille n'est pas placée correctement). Les auteurs n'ont pas vu une grande quantité de sang ou des saignements graves au cours de cette procédure. En cas de l'un ou l'autre, il faut communiquer avec un vétérinaire pour déterminer le traitement approprié et déterminer si les animaux doivent être euthanasiés.</li>
	<li>Insérez l'assemblage cathéter-fil dans la canule du guide. Inclinez l'assemblage du cathéter-fil à environ 45 degrés d'angle par rapport au canal rachidien et forcez l'extrémité à environ 0,3 cm dans le canal rachidien.</li>
	<li>Retirez la canule guide, en laissant le cathéter avec le fil de stylet en place. Retirez le fil de style à environ 2,5 cm de l'extrémité intrathécale du cathéter et avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu'à ce que la marque de 2 cm soit à l'entrée du canal (juste visible sous le muscle) comme le montre la figure 1Bvi. REMARQUE : Le cathéter inséré devrait s'étendre rostralement dans l'espace subarachnoïde. Le placement réussi devrait permettre la libre circulation du cathéter dans cet espace.</li>
	<li>Retirez complètement le fil de stylet, et CSF peut être vu entrer dans le cathéter implanté.</li>
	<li>Connectez l'assemblage du cathéter de livraison à l'extrémité distale du cathéter implanté via l'extrémité de l'aiguille de 30 G (Figure 1Bv,vi).</li>
	<li>Chargez 60 l de salin stérile dans une seringue de 100 l (seringue de chasse d'eau). Chargez un bolus de 30 oL du composé d'essai (p. ex., solution ASO) dans une deuxième seringue (seringue d'injection).</li>
	<li>Connectez la seringue de chasse d'eau (chargée de saline) à l'extrémité de l'adaptateur de tubes de l'assemblage du cathéter de livraison (Figure 1Bv). Injecter 20 ll de salin stérile dans l'espace intrathécal (chasse d'eau avant l'injection).</li>
	<li>Connectez la seringue d'injection (chargée de composé d'essai) à l'extrémité de l'adaptateur de tubes de l'assemblage du cathéter de livraison (Figure 1Bv). Injecter 30 ll de composé d'essai dans l'espace intrathécal sur 30 s. REMARQUE : Le volume d'injection de routine d'ASO est de 30 L pour obtenir un bon knockdown dans la moelle épinière et dans le cortex. Il a été rapporté que les volumes d'injection peuvent avoir un impact sur la distribution composée12, bien que différents volumes d'injection n'aient pas été testés. Si d'autres composés ou volume sont utilisés, l'innocuité et l'efficacité doivent être déterminées empiriquement.</li>
	<li>Répétez l'étape 3.10 et rincer le cathéter avec un autre 40 L de salin stérile (rinçage post-injection). Puis détacher l'assemblage du cathéter de livraison du cathéter implanté. REMARQUE : On pense que la chasse d'eau avant et après l'injection réduit la séquestration locale des composés et améliore leur distribution aux structures rostrales12.</li>
	<li>Couper et chauffer aseptiquement sceller le cathéter implanté : Placez une paire de forceps de dissection stériles dans un stérilisateur de perles jusqu'à ce qu'ils soient très chauds, puis serrez vers le bas sur le tube avec l'extrémité chaude des forceps. REMARQUE: Cette action fait fondre le cathéter. Ainsi, le trou dans le tube est effondré et tous les côtés collent les uns aux autres, scellant le tube d'une manière aseptique et puis il est placé dans l'espace sous-cutané.</li>
	<li>Utilisez des sutures absorbables de monofilament pour fixer le cathéter chauffant restant au tissu conjonctif. Ensuite, utilisez des sutures monofilament non absorbables pour fermer la peau au-dessus du cathéter scellé à la chaleur. REMARQUE : Les clips de blessure peuvent également être utilisés comme approuvé par le protocole de l'IACUC. La technique est compatible avec les injections répétées bien qu'elle n'ait été utilisée que pour des injections ponctuelles dans nos mains. La faisabilité des injections répétées devrait être évaluée empiriquement avec l'approbation de l'IACUC.</li>
	<li>Utilisez de la gaze et de la saline pour laver le sang de la peau et permettre à l'animal de se remettre de l'anesthésie dans un incubateur chauffé jusqu'à ce que mobile, à quel point il est retourné à sa cage d'origine (deux rats par cage). REMARQUE : Lors de l'exécution de chirurgies sur plusieurs rats le même jour, nettoyez les outils à l'aide d'eau pour enlever le sang et re-stériliser à l'aide d'un stérilisateur de perles sèches chauffées (pour au moins 20 s, avec le temps de refroidir) entre les animaux. Un nouvel ensemble d'instruments est utilisé tous les 5 animaux.</li>
	<li>Surveillez les animaux tous les jours pendant au moins 3 jours après la chirurgie et continuez à surveiller les animaux chaque semaine après avoir récupéré de la chirurgie selon le protocole de l'IACUC. REMARQUE : En cas de complications (rétention d'urine, infections par incision, troubles neurologiques comme la convulsion ou la paralysie), un vétérinaire doit être contacté pour déterminer le traitement approprié et si les animaux doivent être euthanasiés. Si la buprénorphine de libération soutenue n'est pas employée, le soulagement de douleur devrait être donné quotidiennement après chirurgie selon le protocole d'IACUC.</li>
</ol>4. Évaluation du renversement spécifique de tissu après injection de TI
<ol><li>Deux semaines après l'injection d'OSA par l'IT bolus, recueillir différentes régions du cerveau (c.-à-d. cortex cérébral, striatum et cervelet) ainsi que différents segments de la moelle épinière (c.-à-d. cervical, thoracique et lombaire). Extraire l'ARN total de tissu utilisant un kit commercial d'extraction d'ARN et effectuer la réaction de synthèse de cDNA comme décrit précédemment13. REMARQUE : Des réactifs standard ont été utilisés pour qPCR avec les essais suivants : rat Malat1 et rat GAPDH. Les niveaux relatifs de transcription ont été calculés à l'aide de la méthode de 2-CT (CT et cycle de seuil).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs sont tous des employés de Biogen, Inc. ou Ionis Pharmaceuticals. Les auteurs reçoivent les oligonucléotides antisens décrits dans l'article d'Ionis Pharmaceuticals.

Le présent article montre une méthode puissante pour livrer des agents thérapeutiques directement dans le Rat CNS. En théorie, une technique similaire peut également être effectuée chez la souris, mais en raison de la plus petite taille, la méthode peut être plus difficile. Par conséquent, notre groupe effectue des injections intracerebroventricular (ICV) chez les souris pour l'administration de médicaments cNS, qui atteignent les mêmes objectifs par une voie d'administration différente. Cette méthode a été décrite dans ...

Le système vasculaire du système nerveux central (SNC) a évolué en tant que régulateur critique de l'homéostasie, contrôlant le trafic des molécules, fournissant des nutriments et se débarrassant des déchets. Ce système est également la première ligne de défense contre les attaques d'agents pathogènes externes, grâce à une distribution dense de jonctions serrées le long des parois des cellules endothéliales. Ces jonctions serrées constituent un aspect de la barrière hémato-encéphalique (BBB). Bien que le BBB permette le transport de molécules nécessaires pour répondre aux besoins en nutriments et en énergie (par exemple, ions, glucose), il limite également sélectivement le passage des agents pathogènes ainsi que des produits chimiques toxiques1,2,3.
Ironiquement, la même fonction protectrice du BBB qui limite le passage des agents pathogènes et des produits chimiques toxiques est également le principal obstacle à notre capacité d'accéder facilement au SNC avec des traitements thérapeutiques après administration systémique à l'organisme2, 4,5. Ce rôle de la BBB a incité le développement d'une pléthore de nouvelles technologies de distribution de médicaments et d'approches6.
Une façon de surmonter cet obstacle est d'injecter les médicaments directement dans le liquide céphalo-rachidien (CSF) qui perfuse continuellement à la fois le cerveau et la moelle épinière7,8,9,10. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour livrer avec succès des agents dans l'espace intrathécal lombaire en plaçant l'extrémité interne du cathéter complètement dans l'espace d'equina de cauda de la colonne vertébrale de rat. Une description de cette procédure a été précédemment publiée par Mazur et coll. elsewhere11.
Le protocole est très efficace et produit un taux de réussite supérieur à 90 % de la livraison d'oligonucléotide antisens (ASO) au SNC lorsqu'il est évalué par l'analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymérase (qPCR) du gène cible knockdown8. La procédure cause un inconfort minimal aux animaux, car 100% des rats survivent à la chirurgie et montrent un gonflement minimal autour de la plaie chirurgicale et aucun signe de détresse (par exemple, hyperactivité, déshydratation, encerclant, perte d'équilibre, diminution de l'apport alimentaire, et déshydratation) pendant l'observation postopératoire. Un autre avantage de la méthode décrite ici est qu'elle ne nécessite pas d'équipement coûteux, ni d'outils spéciaux.

<table><tbody><tr><td>3M Steri-Drape Petit Champ avec Ouverture Adhésif</td><td>3M</td><td></td><td>1020</td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>Decon Laboratories, Inc</td><td></td><td>8416-160Z</td></tr><tr><td>Bâtonnets d’alcool</td><td>Dynarex</td><td></td><td>NO 1204</td></tr><tr><td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD Seringues à usage général 1 mL Embout Luer-Lok</a></td><td>BD</td><td>1ml TB Embout Luer-Lok</td><td>BD 302830</td></tr><tr><td>Tube PE BD Intramedic Tube</td> en <td></td><td>polyéthylène PE50 Diamètre 0,023 po BD</td><td>427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) ou 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td></tr><tr><td>Tube PE BD Intramedic</td> Tube <td>en</td><td>polyéthylène PE PE10 Diamètre 0,011 en</td><td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) ou 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Adaptateurs de tubes</td><td>BD</td><td>23 calibre intramedic luer stub</td><td>adaper BD 427565 ou Fisher Scientific 14-826-19E</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Aiguilles à usage unique 30G</td><td>BD</td><td></td><td>BD</td></tr> 305128 <tr><td>Buprénorphine à libération prolongée - laboratoire</td><td>ZooPharm Prescription</td><td>requise</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à l’oxyde d’éthylène</td><td>Andersen Sterilizer INC.</td><td>AN 74i, stérilisateur à gaz Canule</td> de guidage <td>AN 74i</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) aiguille</td><td>BD 305186</td></tr><tr><td>seringue Hamilton 100ul</td><td>Hamilton company</td><td>Hamilton seringue 100ul</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes chaudes</td><td>Outils de science fine STÉRILISATEUR</td><td></td><td>MODELNO FST 250</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Dechra veterranery product</td><td></td><td>17033-211-38</td></tr><tr><td>Pocket Pro Tondeuse pour animaux</td><td>de compagnie Braintree Scientific</td><td></td><td>CLP-9931 B</td></tr><tr><td>Gommage à la povidone</td><td>PDI</td><td></td><td>S48050</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>Chlorure de sodium 0,9 % Infusion intraveineuse BP 50ml</td><td>FE1306G</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>scalpel jetable</td><td>N° 10</td></tr><tr><td>Coussin chauffant pour petits animaux</td><td>K& H Manufacturing</td><td></td><td>Model # 1060</td></tr><tr><td>Stylet Wire</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T14</td><td>LH-36233780</td></tr><tr><td>Chirurgie Serviette drape</td><td>Dynarex</td><td></td><td>4410</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux et pinces</td><td>FST et Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td></td><td>4-0 ou 5-0</td></tr><tr><td>Outil pour fabriquer le canule de guidage</td><td>Outil rotatif Grainger</td><td>(Dremel)</td><td>14H446 (N° Amp. : EZ456)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Roue à tronçonner EZ lock</td><td>1PKX5 (N° M : 3000-1/24)</td></tr><tr><td></td><td></td>Meule à l<td>’oxyde d’aluminium</td><td>38EY44 (N’Indice fabricant : EZ541GR)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Mandrin EZ Lock</td><td>1PKX8 (N° M : EZ402-01)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Meule diamantée Sol Tuile</td><td>3DRN4 (N° M : EZ545)</td></tr><tr><td>Source alternative de matériaux préfabriqués et stérilisés pour cette procédure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de cathéter doseur</td><td>SAI Systèmes</td><td></td> de perfusion <td>RIDC-01</td></tr><tr><td>Canule guide</td><td>SAI Systèmes de perfusion</td><td>interne RIDC-GCA</td>Systèmes de perfusion <td></td></tr><tr><td>internes</td><td>SAI Systèmes de perfusion</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>RIDC-INC Stylet Wire SAI</td><td>RIDC-STY</td></tr></tbody></table>

livraison intrathécale d'oligonucléotides antisens dans le système nerveux central de rat

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une défense importante contre l'entrée d'agents potentiellement toxiques ou pathogènes du sang dans le système nerveux central (SNC). Cependant, son existence réduit considérablement l'accessibilité des agents thérapeutiques administrés par le Système au SNC. Une méthode pour surmonter cela, est d'injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien (CSF), contournant ainsi le BBB. Cela peut être fait par l'implantation d'un cathéter pour l'infusion continue à l'aide d'une pompe osmotique, ou pour la livraison de bolus unique. Dans cet article, nous décrivons un protocole chirurgical pour la livraison des oligonucléotides d'antisense ciblage de CNS (ASO) par l'intermédiaire d'un cathéter implanté directement dans l'espace d'equina de cauda de la colonne vertébrale adulte de rat. Comme résultats représentatifs, nous montrons l'efficacité d'une seule injection intrathécale bolus ASO (IT) par l'intermédiaire de ce système de cathétérique en faisant tomber l'ARN cible dans différentes régions du Rat CNS. La procédure est sûre, efficace et ne nécessite pas d'équipement coûteux ou d'outils chirurgicaux. La technique décrite ici peut être adaptée pour fournir des médicaments dans d'autres modalités ainsi.

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons injecté deux groupes de rats femelles adultes (250 à 300 g; n - 10/groupe) avec soit un seul bolus de PBS salin tamponné par le phosphate ou 300 g d'ASO ciblant le long non-codage (linc) ARN Malat1; dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement l'ASO Malat1 comme un composé d'outils, parce que Malat1 est exprimé de façon omniprésente et à des niveaux élevés dans tous les tissus14, y compris le cerveau et la moe...

Ici, nous décrivons une méthode pour livrer des drogues au système nerveux central de rat en implantant un cathéter dans l'espace intrathécal lombaire de la colonne vertébrale. Nous nous concentrons sur la livraison des oligonucléotides d'antisens, bien que cette méthode soit appropriée pour la livraison d'autres modalités thérapeutiques aussi bien.

Livraison intrathécale d'Oligonucléotides antisens dans le système nerveux central de rat

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Ce protocole permet la livraison directe de thérapeutiques dans le système nerveux central du rat pour évaluer la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et l’efficacité de nouvelles thérapeutiques dans les modèles de maladies du rat. Cette procédure est sûre, efficace et ne nécessite pas d’équipement coûteux ou d’outils chirurgicaux. Yi Chen et Yi Luo, chercheurs de mon laboratoire, démontreront la procédure.Pour préparer le guide spécial cannulas, utilisez un outil rotatif avec une roue coupée pour couper les deux extrémités d’une aiguille de calibre 19 pour obtenir une canule guide d’environ un mètre et demi à deux centimètres de long. Ensuite, utilisez la meule de l’outil rotatif pour lisser les deux extrémités. Pour préparer l’assemblage du fil de cathéter, couper un morceau de huit centimètres de long de tube PE10 de 011 pouces de diamètre pour servir de cathéter intrathecal pour chaque animal.Utilisez un stylo marqueur résistant à l’éthanol pour marquer deux centimètres d’une extrémité de chaque morceau de tube. Pour chaque animal, insérez un fil de stylet de 11 centimètres de long coupé à partir de fil en acier inoxydable recouvert de polytétrafluoroéthylène dans le lumen du cathéter PE10 de huit centimètres. Pour préparer l’assemblage du cathéter de livraison, couper un morceau de cathéter PE50 de 5 à 10 centimètres de diamètre et insérer un adaptateur de tubes de calibre 23 dans une extrémité du cathéter.Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 avec un moyeu coupé dans un morceau d’environ 0,5 centimètre de tube PE10 et connectez le tube PE10 à l’autre extrémité du cathéter. Pour préparer un assemblage guide canule-aiguille, placez une canule guide au-dessus de l’extrémité d’une aiguille de calibre 23. Avant de commencer la chirurgie, placez un coussin chauffant sur la table de chirurgie et couvrez le coussin avec une feuille de drapé stérile.Placez un tube de centrifugeuse conique de 50 mL sur la feuille et confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez le rat expérimental anesthésié. Après avoir pesé l’animal, raser le dos de la queue à la colonne thoracique caudale et placer le rat rasé sur la feuille stérile en position couchée. Placez le tube de 50mL sous l’abdomen pour fléchir la colonne vertébrale dans la région lombaire, et appliquez l’onguent ophtalmique aux yeux.Ensuite, injectez subcutanément un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération soutenue et nettoyez la peau exposée avec de la povidone séquentielle et des gommages d’alcool. Draper l’animal d’une feuille transparente stérile fenestrated. Pour le placement du cathéter et l’injection du composé, identifier les deux fosses naturelles entre les muscles au-dessus du bassin rasé, et avec une main tenant les fosses, utilisez l’autre main pour appuyer doucement et sentir la colonne vertébrale du caudal à la direction rostrale pour localiser la première indentation majeure entre les vertèbres.Après avoir identifié l’espace intervertébral entre les vertèbres S1 et L6, déplacez-vous légèrement rostrally pour identifier l’espace intervertébral entre les vertèbres L5 et L6. Utilisez un scalpel pour faire une incision d’au plus deux centimètres de long dans la peau et la capsule musculaire à cet endroit le long de la ligne médiane de la direction rostrale à caudale de sorte que le site d’injection sera au centre de l’incision. Utilisez des ciseaux de dissection pour disséquer le tissu conjonctif jusqu’à ce que la couche musculaire puisse être visualisée.Faire une incision d’un centimètre dans la capsule musculaire immédiatement latérale au processus spinal dorsal de la vertèbre lombaire L6. Placez l’assemblage de l’aiguille de canule guide près de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre lombaire et poussez l’assemblage dans l’espace intervertébral le long de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre de sorte que l’extrémité de l’aiguille pénètre dans le canal rachidien. Utilisez des forceps contondants pour localiser le processus rachidien dorsal de la vertèbre lombaire L6 puis poussez l’aiguille le long de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre dans l’espace des invertébraux.Poussez la canule guide en place le long de l’aiguille, retirez l’aiguille et insérez l’assemblage du fil de cathéter dans la canule du guide. La pêche au cathéter à un angle d’environ 45 degrés vers le canal rachidien force l’extrémité du cathéter à environ 0,3 centimètre dans le canal. Retirez le fil de stylet à environ 2,5 centimètres de la pointe intrathecale du cathéter et avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que le marquage de deux centimètres sur le cathéter soit juste visible sous le muscle.Lorsque le cathéter est en place, retirez la canule guide pour laisser le cathéter et le fil de stylet en place. Avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que la marque de deux centimètres soit à l’entrée du canal et retirez complètement le fil de stylet. Le liquide céphalo-rachidien peut être visualisé entrant dans le cathéter implanté.Connectez ensuite l’assemblage du cathéter de livraison à l’extrémité distale du cathéter implanté par l’intermédiaire de l’extrémité de l’aiguille de calibre 30. Ensuite, chargez 60 microlitres de solution saline stérile dans une seringue de 100 microlitres et chargez un bolus de 30 microlitres du composé d’essai dans une deuxième seringue. Connectez la seringue saline à l’extrémité de l’adaptateur de tubes de l’assemblage du cathéter de livraison et rincez 20 microlitres de solution saline stérile dans l’espace intrathecal.Lorsque toute la solution saline a été rincée, remplacez la seringue saline par la seringue chargée bolus et injectez 30 microlitres du composé d’essai dans l’espace intrathécal sur une période de 30 secondes. Lorsque tout le bolus a été livré, remplacer la seringue chargée de bolus par une autre seringue saline chargée et rincer le cathéter avec 40 microlitres supplémentaires de solution saline. Lorsque le deuxième volume de solution saline a été livré, détachez l’assemblage du cathéter de livraison du cathéter implanté et utilisez une paire de forceps de dissection stérilisés par la chaleur très chaude pour sévir contre le tube pour couper et sceller à la chaleur le cathéter implanté.Utilisez des sutures de monofilament absorbables pour fixer le cathéter scellé à la chaleur vers le tissu conjonctif, puis utilisez des sutures non absorbables pour fermer la peau. Ensuite, utilisez de la gaze et de la solution saline pour laver le sang de la peau et placer le rat dans un incubateur chauffé avec surveillance jusqu’à la pleine récomprégence. Dans cette expérience représentative, le knockdown très bon a été obtenu dans toutes les régions rassemblées après la livraison unique d’oligonucléotide de bolus antisense comme démontré.Cependant, un certain degré de variabilité régionale a été mesuré avec la moelle épinière présentant le pourcentage le plus élevé de knockdown. Après une injection réussie de l’oligonucléotide antisens, ou d’autres thérapeutiques, dans un modèle approprié, on peut évaluer la pharmacocinétique, la pharmacodynamique, et l’efficacité des thérapeutiques.

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Neuroscience

Neurosciences

Source : Chen, Y., et al. Administration intrathécale d’oligonucléotides antisens dans le système nerveux central du rat. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre l’administration d’un composé d’essai dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) par le biais d’un cathéter implanté dans la colonne vertébrale lombaire d’un modèle de rat. Le composé circule le long du LCR jusqu’au cerveau et à la moelle épinière, pénètre dans les neurones et offre un potentiel thérapeutique.

Administration intrathécale d’un composé d’essai dans le système nerveux central du rat

Source : Li, D., et al. Injection intrathécale directe de virus adéno-associés recombinants chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection intrathécale de virus adéno-associés (AAV) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) d’une souris éveillée, couvrant la préparation de la seringue, l’alignement de la colonne vertébrale et l’insertion précise de l’aiguille. Cette méthode valide l’administration ciblée de gènes, soutenant ainsi son potentiel pour les...

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Une injection intrathécale lombaire représente une voie d’administration pertinente sur le plan translationnel pour l’administration de la thérapie génique au système nerveux central. Ce protocole standardisé complet pour les injections intrathécales lombaires chez les souris et les rats néonatals, juvéniles et adultes vise à guider les chercheurs dans l’adoption de cette technique pour les études précliniques de thérapie génique.

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Cet article détaille les méthodes d’administration intrathécalienne pour les traitements ciblant le SNC chez les souris adultes, en mettant l’accent sur la précision des protocoles et la possibilité d’injections répétées. Il inclut les résultats d’une étude de validation où les oligonucléotides antisens ont réduit l’expression mutante de SOD1 chez des souris modèles SOD1-SLA, soutenant l’utilité de cette approche dans la recherche préclinique sur les maladies neurodégénératives.

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