Name: Détection du cancer de lovaire à laide de la cytométrie du flux photoacoustique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez la détection du cancer de l'ovaire par cytométrie photoacoustique utilisant des nanoparticules de sulfure de cuivre ciblées. Cette méthode simple et peu coûteuse permet d'identifier les cellules tumorales circulantes dans le sang.

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Les auteurs aimeraient remercier Madeleine Howell pour son aide dans la synthèse, Matthew Chest pour son aide à la conception du système d'écoulement et Ethan Marschall pour l'aide de SolidWorks.

1. Synthèse et fonctionnalisation des nanoparticules
REMARQUE : La synthèse des NP FA-CuS est réalisée à l'aide d'une méthode de synthèse d'un pot adaptée d'un protocole publié précédemment21. CAUTION: Toute synthèse doit se produire dans un capot de fumée chimique ventilée.
<ol><li>Avant la synthèse, filtrer environ 300 ml d'eau déionisée (DI) à l'eau par un filtre stérile de 0,2 m.</li>
	<li>Nettoyer un flacon de fond rond en verre de 250 ml avec une solution de détergent et rincer à l'eau DI. Ajouter 0,0134 g de CuCl2 en 100 ml d'eau DI pour créer une solution de 1 mm.</li>
	<li>Ajouter 0,015 g d'acide folique (FA) à la solution CuCl2 et remuer pendant 5 min à l'aide d'une barre magnétique.</li>
	<li>Ajouter Na2S-9H2O (0,024 g dans 100 l d'eau DI) sur environ 10 s au mélange de réaction en utilisant une pipette de 200 l. REMARQUE : Lors de l'ajout de la Na2S-9H2O, la solution changera de couleur d'un jaune clair à un brun foncé.</li>
	<li>Capuchon de la réaction et placez-le dans un bain d'huile, réglé à 90 oC, et continuez à remuer avec une barre magnétique. Après environ 15 min, ou lorsque le bain d'huile a atteint 85-90 oC, laissez la réaction se poursuivre pendant une heure supplémentaire. Votre mélange devrait progressivement se transformer en une couleur vert foncé. REMARQUE : Assurez-vous d'évacuer le système tout en chauffant le mélange de réaction pour éviter l'accumulation de pression.</li>
	<li>Retirer le récipient de réaction du bain d'huile et refroidir brièvement à température ambiante pendant environ 10 à 15 minutes avant de le transférer dans un bain de glace.</li>
	<li>Une fois que le mélange de réaction a refroidi en dessous de 20 oC, ajustez le pH à 10 en utilisant 1M NaOH pour dissoudre le reste de l'acide folique en solution.</li>
	<li>Purifie le mélange de réaction FA-CuS à l'aide d'une colonne de centrifugation de 30 kDa. Ajouter la solution en lots de 15 ml à la colonne et la centrifugeuse à 3 082 x g pendant 15 min.</li>
	<li>Une fois que tout le mélange de réaction a été concentré, recombiner les fractions concentrées et laver 4x avec 15 ml de pH 10 NaOH dans la colonne de centrifugation de 30 kDa.</li>
	<li>Pour les mesures de masse, prendre 1/3 de la solution (66 l) et diviser en trois flacons de verre. Sécher dans un four à vide pendant la nuit à 40 oC sous un vide de 27 mmHg.</li>
	<li>Dissoudre les 2/3 autres de la solution concentrée dans 250 L de PBS et stocker à 4 oC jusqu'à une utilisation plus poussée.</li>
	<li>Avant d'utiliser les nPs FA-CuS, les sonicate pendant 30 minutes dans un sonicator de bain sur un réglage élevé.</li>
</ol>2. Caractérisation NP
<ol><li>Effectuer la diffusion dynamique de la lumière (DLS) Ajouter 10 L de CONCENTRÉ FA-CuS NPS dans la solution PBS de l'étape 1.1.14 à 2 ml d'eau DI. Avant la caractérisation par DLS, sonicate les particules pendant 30 min dans un sonicateur de bain sur un réglage élevé et filtrez à travers un filtre stérile de 0,2 m pour enlever la poussière résiduelle.</li>
	<li>Effectuer la microscopie électronique de transmission (TEM) : Ajouter 10 l de NPS FA-CuS concentré dans la solution PBS à un morceau de papier ciré. Inverser une grille de cuivre enduite de formvar sur le dessus de la gouttelette et laisser s'asseoir pendant 2 min. Touchez le bord de la grille enduite de formvar à un morceau de papier filtre pour enlever l'excès de liquide. Laisser sécher l'air. Image de la grille de cuivre à l'aide d'un microscope électronique à une tension d'accélération de 80 kV. REMARQUE : Les résultats typiques de la caractérisation du SNM FA-CuS sont présentés à la figure 1.</li>
</ol>3. Culture cellulaire
<ol><li>Ce protocole utilise des cellules SKOV-3. Sauf indication contraire, la culture SKOV-3 cellules dans le milieu 5A de McCoy complété avec 10% FBS, 100 U/ mL pénicilline, et 100 g/mL streptomycine, et de maintenir à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5% CO2.</li>
</ol>4. Marquage fluorescent de FA-CuS NPS pour la microscopie
<ol><li>Ajouter l'ester succinimidyl Texas-Red-X (0,2 mg dissous dans le DMSO à une concentration de 10 mg/mL) à une solution contenant 2 mg de NP FA-CuS dans 1 mL de 0,1 M NaHCO3 (pH 9) tampon.</li>
	<li>Remuer le mélange de réaction à l'aide d'une barre magnétique pendant 1 h, loin de la lumière à température ambiante.</li>
	<li>Concentrez le mélange de réaction dans une colonne de centrifugation MWCO de 4 ml 30 kDa en tournant à 4 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Laver la solution concentrée 3x avec 4 ml de 0,1 M NaHCO3 tampon (pH 9) dans une colonne de centrifugation. Par la suite, laver la solution concentrée avec 4 ml d'eau DI 3x ou jusqu'à ce que seule une quantité infime de fluorescence reste visible dans le débit par UV-VIS.</li>
</ol>5. FA-CuS NPS Uptake by Ovarian Cancer Cells 5. FA-CuS NPS Uptake by Ovarian Cancer Cells 5. FA-CuS NPS Uptake by Ovarian Cancer Cells 5.
<ol><li>Avant l'incubation avec les nP FA-CuS, incubez les cellules SKOV-3 dans un flacon T75 avec 8 à 15 ml de milieux RPMI-1640 sans acide folique avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine pendant au moins 24 h.</li>
	<li>Les cellules de graine dans 0.5 ml de le milieu de croissance complet de RPMI-1640 folique-acide-libre à une densité de 0.1 x 106 cellules/mL dans une plaque de 24 puits.</li>
	<li>Le lendemain, incubez des cellules avec 400 nPS FA-CuS FA-CuS de 400 g/mL dans 0,5 ml de RPMI-1640 sans acide folique, un support de croissance complet pendant 2 h.</li>
	<li>Après cette incubation, trypsiniser les cellules avec 0,5 ml de 0,25% trypsine avec EDTA. Ajouter au moins 1 ml de milieu de croissance complète RPMI-1640 sans acide folique pour neutraliser la trypsine, et centrifuger les cellules à 123 x g pendant 6 min.</li>
	<li>Retirez le supernatant, suspendez les cellules en 2 ml de PBS et centrifugez-vous à 123 x g pendant 6 min. Effectuez cette étape de lavage 2x pour enlever les NP non liés.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 1/2 ml de PBS avec une solution Tween de 2%.</li>
	<li>Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et d'un bleu trypan. D'autres cellules diluent si le nombre de cellules est trop élevé. Cellules diluées dans PBS avec 2% De tween à la concentration choisie pour la détection.</li>
	<li>Les cellules sont maintenant prêtes à être analysées par le système PAFC.</li>
</ol>6. Microscopie fluorescence de FA-CuS NPS Uptake
<ol><li>Répétez les étapes énumérées à l'étape 5.1 et procédez au protocole ci-dessous pour la microscopie.</li>
	<li>Cellules de graines à une densité de 0,1 x 106 cellules/mL dans 0,5 ml de rpMI-1640 sans acide folique support de croissance complète sur les couvertures de verre dans une plaque de 24 puits.</li>
	<li>Le lendemain, incuber les cellules avec des nP FA-CuS étiquetés fluorescents en triplette, à des concentrations de 100 g/mL, 200 g/mL, 300 g/mL, et 400 g/mL dans 0,5 mL de rpMI-1640 sans acide folique.</li>
	<li>Incuber les cellules avec les NP pendant 2 h dans l'incubateur de 37 oC</li>
	<li>Après cette période d'incubation, lavez les cellules 3x avec du PBS. REMARQUE : Pour toutes les étapes de lavage, ajouter soigneusement la solution sur le côté de la plaque de puits pour ne pas déranger les cellules. Après l'ajout, inclinez soigneusement la plaque et retirez la solution du côté du puits.</li>
	<li>Incuber les cellules avec 0,5 ml de 3,7 % de paraformaldéhyde (PFA) en PBS pendant 15 min et transférer les couvercles en verre dans une nouvelle plaque de 24 puits. CAUTION: PFA est un cancérogène connu. Faites toute la fixation dans une hotte de fumée chimique ventilée et portez l'équipement de protection individuelle approprié.</li>
	<li>Incuber les cellules dans une solution de 3,7% PFA avec 0,1% Triton-X en PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Laver les cellules avec 0,5 ml de PBS 3x pendant 5 min chacune et transférer les plaques de couverture dans une nouvelle plaque.</li>
	<li>Incuber les cellules avec 0,5 ml d'une solution PBS contenant du DAPI (20 l/mL d'une solution de stock de 0,5 mg/mL est utilisée pour la coloration) pendant 5 min, loin de la lumière.</li>
	<li>Laver les cellules avec PBS 3x.</li>
	<li>Après le lavage PBS final, monter les couvertures sur les diapositives avec le milieu de montage.</li>
	<li>Les cellules sont maintenant prêtes à être représentées par microscopie à fluorescence. La figure 2 montre un exemple de caractérisation cellulaire typique par microscopie fluorescence.</li>
</ol>7. Architecture du système de flux
<ol><li>Construction de chambre de flux REMARQUE : Un fichier SolidWorks d'un réservoir d'écoulement imprimé en 3D se trouve dans les Matériaux Supplémentaires.<ol>
<li>À l'aide du fichier SolidWorks fourni, imprimer en 3D le réservoir d'écoulement à l'aide de plastique thermoplastique ABS ou PLA. Les dimensions sont fournies ci-dessous si SolidWorks n'est pas disponible. La figure 3A montre une représentation de ce modèle. Le corps du réservoir d'écoulement est de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Les extrémités du réservoir d'écoulement comprennent des trous d'environ 5 mm de diamètre pour permettre l'entrée de tubes contenant le tube capillaire. REMARQUE : Le réservoir d'écoulement a un trou de 1 cm, perpendiculaire à l'orientation du tube capillaire, pour le placement du transducteur d'ultrason. Une extrusion cylindrique avec le même diamètre intérieur que le trou s'étend de 6 mm dans le réservoir. Pour l'imagerie en temps réel, le réservoir d'écoulement a une fente de 1 mm x 3 mm directement sous le tube capillaire.</li>
		<li>Après l'impression du réservoir d'écoulement 3D, nettoyez et assemblez le système pour l'utiliser.</li>
		<li>Placez les couvercles en verre sur la fente de 1 mm x 3 mm et le trou de 1 cm dans le système d'écoulement.</li>
		<li>Scellez soigneusement avec du silicone pour éviter les fuites.</li>
		<li>Adhérence du tube capillaire dans les tubes durcis en silicone. Insérez les tubes dans la chambre d'écoulement bien que le côté du réservoir d'écoulement de sorte que le tube capillaire en verre est directement au-dessus et devant la fente de 3 mm et le trou de 1 cm.</li>
		<li>Scellez le tube à l'aide de silicone pour prévenir les fuites.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuration du système de flux photoacoustique REMARQUE : La figure 3B et la figure 3C montrent un exemple de l'architecture du système d'écoulement.<ol>
<li>Connectez le transducteur à un pulseur/récepteur à ultrasons. Amplifiez le signal avec un gain de 59 dB.</li>
		<li>Connectez la sortie du filtre à un oscilloscope reconfigurable polyvalent équipé d'un tableau de porte programmable intégré sur le terrain.</li>
		<li>Connectez l'un des tubes provenant de la chambre d'écoulement à une jonction en T, reliée à deux pompes à seringues à chaque branche.</li>
		<li>Remplissez l'une des pompes à seringues d'air et l'autre pompe avec l'échantillon à analyser. Fixer la pompe contenant de l'air à un débit de 40 l/min et la pompe contenant l'échantillon à un débit de 20 l/min. Le débit en deux phases qui en résultera produira des volumes d'échantillons de 1 l. À ce débit, le système testera environ 6,4 échantillons par minute. REMARQUE : Pour maintenir une distribution cohérente des cellules, vortexz légèrement chaque échantillon immédiatement avant d'être examiné. En outre, faire pivoter la seringue toutes les quelques minutes afin d'empêcher les cellules de s'installer dans la solution.</li>
		<li>Connectez le tube restant sortant du système d'écoulement à un récipient avec 10% d'eau de Javel, pour éliminer les cellules après qu'ils sortent du système d'écoulement. REMARQUE : Avant d'utiliser le système d'écoulement, vérifiez s'il y a des fuites, car celles-ci peuvent affecter le débit. Les cellules doivent être contenues dans un système fermé pour maintenir la sécurité biologique pendant la procédure.</li>
		<li>La conception du réservoir imprimé en 3D permet un alignement cohérent et répétable entre le transducteur et la lumière laser avec un minimum d'étalonnage. Lorsqu'il est placé correctement dans le réservoir personnalisé, le tube capillaire de quartz assure que le transducteur et le laser sont directement alignés.</li>
		<li>Placez la section du tube capillaire de quartz en alignement direct avec le transducteur, dans le champ de vision du microscope, permettant le placement soigneux de la fibre optique au-dessus de l'échantillon de telle sorte qu'il illumine toute la largeur du tube.</li>
		<li>Irradiez l'échantillon à l'aide d'une fibre optique canalisant un laser à l'état solide pompé par diodes fonctionnant à une longueur d'onde de 1 053 nm. L'incident de lumière laser sur l'échantillon et le transducteur utilisé pour mesurer l'effet photoacoustique sont tous deux non ciblés.</li>
		<li>L'énergie de l'incident laser sur l'échantillon est d'environ 8 mJ et le taux laser de 10 Hz est suffisant pour éclairer chaque échantillon plusieurs fois pendant qu'il traverse le système.</li>
		<li>Placez le système d'écoulement au-dessus d'un microscope inversé et assurez-vous que l'impulsion laser et la trajectoire de l'échantillon sont visibles lorsque l'échantillon passe à bien que le système d'écoulement. Enregistrez le débit à l'aide d'une caméra montée au microscope.</li>
		<li>Enregistrez les acquisitions d'échographies à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données (voir Tableau des matériaux). Déclencher l'échographie et le laser pulsé à l'aide de la FPGA. Utilisez PBS avec 2% Tween, et FA-CuS NPs à une concentration de 100 g/mL dans PBS 2% Tween, comme contrôles négatifs et positifs, respectivement.</li>
		<li>En utilisant une caméra montée au microscope, enregistrez à la fois la mise à feu du laser et le passage d'échantillons par le système d'écoulement. Ces enregistrements seront utilisés pour corréler le signal acoustique enregistré par le transducteur avec le tir du laser. Lorsque les échantillons passent devant le tir du laser, le signal peut alors être corrélé au signal photoacoustique qui en résulte pour analyse. À un taux d'échantillonnage de 10 Hz, le laser illuminera chaque prise plusieurs fois.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Après le traitement
<ol><li>Pour chaque acquisition de signal, s(t), calculer la transformation Hilbert, H[s(t)], afin de créer un signal analytique.</li>
	<li>Créer une enveloppe complexe, se(t), en calculant l'ampleur du signal analytique, de telle sorte que <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> et intégrer l'enveloppe pour mesurer le signal total résultant de chaque acquisition. Comparez les signaux de chaque groupe de test (c.-à-d. PBS, cellules étiquetées, FA-CuS NPs, cellules seules) en utilisant un t-test dans le logiciel statistique R. Les signaux photoacoustiques bruts et leurs transformations Hilbert sont présentés dans la figure 4.</li>
	<li>Pour la reconstruction d'image, normalisez l'enveloppe complexe en fonction du maximum sur l'ensemble de la course. Si vous comparez une série de pistes, normalisez l'enveloppe complexe en utilisant le maximum de pointe sur l'ensemble de la série. Après normalisation, convertissez chaque acquisition en une série de valeurs pixel. Représentez chaque série de valeurs de pixels comme une colonne dans la reconstruction de l'image. Les reconstructions représentatives de PBS et des signaux NP FA-CuS sont indiquées à la figure 5, où les deux images ont été normalisées à l'aide du maximum sur les deux pistes.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+global+cancer+incidence+and+mortality+in+2018%3A+GLOBOCAN+sources+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods.</a> International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer+and+their+clinical+value+as+a+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis.</a> PLoS One. 10 (6), e0130873(2015).</li>
<li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+of+HE4%2B+circulating+tumor+cells+in+patients+with+suspicious+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer.</a> Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).</li>
<li>Lianidou, E., Hoon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9+-+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Principles+and+Applications+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA.</a> Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC cancer. 12 (1), 178(2012).</li>
<li>Galanzha, E., Zharov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+detection+and+capture+by+photoacoustic+flow+cytometry+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo.</a> Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).</li>
<li>Nedosekin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+analysis+of+graphene+nanomaterial+pharmacokinetics+using+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%3A+principle+and+application+for+real-time+detection+of+circulating+single+nanoparticles%2C+pathogens%2C+and+contrast+dyes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optic%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo.</a> Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).</li>
<li>Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic micropipette.</a> Applied Physics Letters. 113 (26), 264103(2018).</li>
<li>Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrauterine+photoacoustic+and+ultrasound+imaging+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).</li>
<li>Galanzha, E. I., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry.</a> Methods. 57 (3), 280-296 (2012).</li>
<li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+circulating+tumor+cells+using+photoacoustic+flowmetry+and+two+phase+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment%2C+photoacoustic+diagnosis%2C+and+photothermal+purging+of+infected+blood+using+multifunctional+gold+and+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles.</a> PLoS One. 7 (9), e45557(2012).</li>
<li>Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green-loaded+photoacoustic+nanodroplets%3A+dual+contrast+nanoconstructs+for+enhanced+photoacoustic+and+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging.</a> ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).</li>
<li>Kim, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+plasmonic+assemblies+of+gold+nanoparticles+with+multimodal+function+for+targeted+cancer+theragnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17327(2017).</li>
<li>Ku, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+sulfide+nanoparticles+as+a+new+class+of+photoacoustic+contrast+agent+for+deep+tissue+imaging+at+1064+nm%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm.</a> ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).</li>
<li>Parker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+expression+in+carcinomas+and+normal+tissues+determined+by+a+quantitative+radioligand+binding+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).</li>
<li>Cheung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+folate+receptor+alpha+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Targeting folate receptor alpha for cancer treatment.</a> Oncotarget. 7 (32), 52553(2016).</li>
<li>Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+CuS+nanoparticles+targeting+folate+receptors+for+PET+image-guided+photothermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).</li>
<li>Lusk, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+Flow+System+for+the+Detection+of+Ovarian+Circulating+Tumor+Cells+Utilizing+Copper+Sulfide+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+captured+by+microfluidic+device+in+patients+with+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).</li>
<li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole est une méthode simple pour la détection des CTC ovariens utilisant PAFC et un agent de contraste ciblé de CuS. De nombreuses méthodes ont été explorées pour la détection des CCT ovariens, y compris les dispositifs microfluidiques, RT-PCR, et la cytométrie de flux de fluorescence23,24,25. Ces gammes dans la complexité, le coût, et l'exactitude, limitant leur efficacité dans les arrangements cliniques. PAFC présente ...

Le cancer de l'ovaire est l'une des tumeurs malignes gynécologiques les plus meurtrières et a entraîné environ 184 800 décès dans le monde en 20181. De multiples études ont montré la corrélation entre la progression du cancer de l'ovaire (c.-à-d. métastes) et la présence des CCT2,3,4. La méthode la plus courante pour la détection et l'isolement des CTC utilise le système Cellsearch, qui cible le récepteur EpCam5. L'expression d'EpCam, cependant, est downregulated dans la transition épithéliale à la transition mésenchymale, qui a été impliquée dans la métastasie de cancer6. Malgré les progrès réalisés, les technologies cliniques actuelles souffrent encore d'une faible précision, d'un coût élevé et d'une complexité. En raison de ces inconvénients, les nouvelles technologies pour la découverte et le recensement des CTC ovariens sont devenues un domaine important pour la recherche.
Récemment, PAFC a émergé comme une méthode efficace pour la détection non invasive des cellules cancéreuses, l'analyse des nanomatériaux, et l'identification des bactéries7,8,9. PAFC diffère de la cytométrie traditionnelle de flux de fluorescence en détectant les analytes en flux en utilisant la photoacoustique. L'effet photoacoustique est généré lorsque la lumière laser est absorbée par un matériau qui provoque une expansion thermoélastique, produisant une onde acoustique qui peut être détectée par un transducteur d'ultrasons10,11. Les avantages de PAFC par rapport aux méthodes traditionnelles de cytométrie de flux incluent la simplicité, la facilité de traduction aux arrangements cliniques, et la détection des CTC à des profondeurs sans précédent dans les échantillons de patients12,13. Des études récentes ont utilisé des systèmes PAFC pour la détection des cellules en utilisant le contraste endogène et exogène14,15. Des agents de contraste absorbant la lumière dans l'infrarouge proche (NIR) tels que le colorant vert endocyanine et les NP métalliques (p. ex., or et CuS) ont été utilisés pour l'étiquetage sélectif des cellules et des tissus en combinaison avec l'imagerie photoacoustique16,17,18. En raison de l'amélioration de la profondeur de pénétration de la lumière NIR dans les tissus biologiques, la détection photoacoustique des absorbeurs peut être effectuée à de plus grandes profondeurs pour des applications cliniques. En raison de son grand potentiel d'utilisation dans la clinique, la combinaison d'agents de contraste NIR ciblés avec PAFC a suscité un intérêt considérable pour la détection des CCT.
PAFC en combinaison avec des agents de contraste ciblés fournit une approche améliorée pour l'analyse à haut débit des échantillons de patients avec une précision accrue et une détection ciblée des CTC. L'une des principales stratégies de détection des CTC est le ciblage spécifique des protéines membranaires présentes sur la cellule d'intérêt. Une caractéristique notable des CTC ovariens est la surexpression des récepteurs foliques situés sur leur membrane externe19. Le ciblage des récepteurs foliques est une stratégie idéale pour l'identification des CCT ovariens dans le sang parce que les cellules endogènes, qui ont une expression plus élevée des récepteurs d'acide folique, sont généralement lumineuses et ont une exposition limitée à la circulation sanguine20. Les nP de sulfure de cuivre (NPs de CuS) ont été récemment reconnus pour leur capacité à cibler des récepteurs foliaires exprimés sur des cellules cancéreuses21. Combinés à leur biocompatibilité, à leur facilité de synthèse et à leur absorption dans le NIR, ces agents de contraste NP constituent une stratégie de ciblage idéale pour la détection des CTC ovariens utilisant paFC.
Ce travail décrit la préparation des NP FA-CuS et leur utilisation pour la détection des cellules cancéreuses ovariennes dans un système de flux photoacoustique. Les IP CuS sont modifiés avec de l'acide folique pour cibler spécifiquement les CTC ovariens et émettent un signal photoacoustique lorsqu'ils sont stimulés avec un laser de 1 053 nm. Les résultats indiquent la détection réussie des cellules cancéreuses ovariennes incubées avec ces agents de contraste photoacoustique s'insinpeuser dans le système PAFC. Ces résultats montrent la détection des cellules cancéreuses ovariennes jusqu'à des concentrations de 1 cellule/L, et la microscopie de fluorescence confirme l'étude réussie de ces particules par les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-322. Ce travail fournit une description détaillée de la synthèse FA-CuS NPs, la préparation d'échantillons pour la microscopie de fluorescence, la construction du système de flux photoacoustique, et la détection photoacoustique des cellules cancéreuses ovariennes. La méthode présentée montre l'identification réussie des CTC ovariens dans le flux utilisant des NPs de FA-CuS. Les travaux futurs se concentreront sur l'application clinique de cette technologie vers la détection tôt des métastes de cancer de l'ovaire.

<table><tbody><tr><td>0,025 % de trypsine avec EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>0,2 & micro ; m 1 000 mL Unité de filtration sous vide</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Pour filtrer de plus grands volumes d’eau DI.</td></tr><tr><td>0,2 et micro ; m filtre à seringue stérile</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td> imprimé en 3D <td>Carte d’acquisition</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8 canaux, 14 bits</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Détergent utilisé pour le nettoyage de la verrerie.</td></tr><tr><td>Filtres centrifuges Amicon Ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Filtres centrifuges Amicon Ultra-4</td> Hématocytomètre <td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hausser</td><td>Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de cuivre(II)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>Objectif de couplage</td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>À coupler Lumière pulsée à fibre optique.</td></tr><tr><td>Platine d’accouplement</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Platine pour l’accouplement de la lumière pulsée à l’objectif. Contient le bain de nettoyage par ultrasons numérique FP-1A et LMH-10x-532</td></tr> série <tr><td>CPX Modèle</td><td>Fisherbrand</td><td>CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>logiciel d’acquisition de données</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32 bits)</td><td>LabVIEW utilisé pour synchroniser les impulsions laser avec l’acquisition de données.</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement de données</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Reconstructions et graphiques réalisés à l’aide du logiciel Matlab.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mandrin de fibre</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Utilisé pour maintenir la fibre nue.</td></tr><tr><td>Coupleur de fibre</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>Platine 3 axes pour positionner le mandrin de fibre et la fibre optique au centre de l’objectif.</td></tr><tr><td>Acide folique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Grilles TEM revêtues</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy’s 5A Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL SERINGUES</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Fibre optique</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Utilisé pour exposer l’échantillon à la lumière pulsée.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsé</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Source laser pulsée avec spécifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum.</td></tr><tr><td>Émetteur/récepteur</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Reçoit, filtre et amplifie les signaux photoacoustiques. Fonctionne avec un gain de 59 dB.</td></tr><tr><td>Instrument de sutter</td> à <td>tube capillaire en quartz</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Sans acide folique</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Cellules</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich S7795-500G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perles d’hydroxyde de sodium</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfure de sodium non hydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Pompes à seringue</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Détecteur à ultrasons avec fréquence centrale de 50 MHz et bande passante fractionnelle de -6 dB de 82 %.</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4 %</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gel à ultrasons</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Gel à ultrasons pour couplage de transducteur</td></tr></tbody></table>

détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Beaucoup d'études suggèrent que l'énumération des cellules de tumeur circulantes (CTC) puisse montrer la promesse comme outil pronostique pour le cancer ovarien. Les stratégies actuelles de détection des CCT comprennent la cytométrie du débit, les dispositifs microfluidiques et la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (RT-PCR). Malgré les progrès récents, les méthodes de détection des métastes précoces du cancer de l'ovaire n'ont toujours pas la sensibilité et la spécificité requises pour la traduction clinique. Ici, une nouvelle méthode est présentée pour la détection des cellules tumorales circulantes ovariennes par cytométrie de flux photoacoustique (PAFC) utilisant un système imprimé tridimensionnel (3D) personnalisé, y compris une chambre d'écoulement et une pompe à seringues. Cette méthode utilise des nanoparticules de sulfure de cuivre à teneur en acide folique (FA-CuS NPs) pour cibler les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3 par PAFC. Ce travail démontre l'affinité de ces agents de contraste pour les cellules cancéreuses de l'ovaire. Les résultats montrent la caractérisation de NP, la détection de PAFC, et l'utilisation de NP par microscopie de fluorescence, démontrant de ce fait le potentiel de ce nouveau système pour détecter les CTC ovariens aux concentrations physiologiquement pertinentes.

La figure 1A montre une image TEM typique des nanoparticules synthétisées. La taille moyenne de la nanoparticule typique est d'environ 8,6 nm et 2,5 nm. La mesure de nanoparticule a été exécutée dans ImageJ. Des fonctions de seuil et de bassin versant ont été appliquées pour séparer les particules aux fins de mesure. Les diamètres horizontaux et verticaux de chaque particule ont été mesurés perpendiculairement les uns aux autres et ont fait l...

Un protocole est présenté pour détecter les cellules tumorales ovariennes circulantes à l'aide d'un système de flux photoacoustique sur mesure et de nanoparticules de sulfure de cuivre plaquées à l'acide folique ciblée.

Détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Les mesures cliniques actuelles de détection du cancer de l’ovaire ne sont pas spécifiques et manquent de détection du point de soins des cellules tumorales circulantes. Notre système d’écoulement photoacoustique permet de tester des échantillons de patients pour des marqueurs spécifiques du cancer de l’ovaire dans le flux sanguin. Cette procédure fournit une technologie de plate-forme unique avec des améliorations par rapport aux techniques actuelles en termes de simplicité, faible coût, des limites prometteuses de détection, et la capacité d’être appliquée à des applications larges.Grâce à ces travaux, nous visons à construire à partir de notre système de nanoparticules ciblées pour le cancer de l’ovaire pour tester des échantillons ex vivo patient pour les CTC. Ce système PAFC hautement polyvalent est capable de se développer pour un usage clinique, testant la présence d’un large éventail de biomarqueurs dans le sang. Un alignement optique approprié est essentiel à la détection des cibles dans le système photoacoustique de cytométrie du débit.De plus, pour assurer un couplage acoustique adéquat, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre la glissière de verre et le transducteur. En raison de la nature personnalisée du système d’écoulement et de ses composants, la visualisation de la méthode est bénéfique pour une reproduction précise. Dans un capot de fumée chimique ventilé, filtrer environ 300 millilitres d’eau déionisée à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre.Ajouter 0,0134 gramme de chlorure de cuivre et 100 millilitres d’eau déionisée à un flacon de fond rond propre de 250 millilitres pour créer une solution de chlorure de cuivre d’un millimlaire. Ajouter 0,015 gramme d’acide folique au flacon et utiliser une barre magnétique pour mélanger la solution pendant environ cinq minutes. Mélanger ensuite 0,024 gramme de sulfide de sodium nonhydrate avec 100 microlitres d’eau déionisée.Utilisez une pipette de 200 microlitres pour ajouter lentement cette solution au mélange de réaction sur une durée d’environ 10 secondes. Cap le vaisseau de réaction. Placez le navire dans un bain d’huile réglé à 90 degrés Celsius et continuez à remuer.Après environ 15 minutes ou lorsque le bain d’huile a atteint la plage de température entre 85 et 90 degrés Celsius, permettre à la réaction de procéder pendant une heure supplémentaire. Lorsque la réaction est terminée, retirez le récipient de réaction du bain d’huile et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 à 15 minutes avant de le transférer dans un bain de glace. Une fois la réaction refroidie, réglez le pH à environ 10 à l’aide d’un hydroxyde de sodium molaire.Ajouter le mélange à une colonne de centrifugation de 30 kilodaltons en lots de 15 millilitres et centrifugeuse à 3 082 fois g pendant 15 minutes pour purifier le mélange de réaction. Tout d’abord, mélanger les nanoparticules de sulfure de cuivre plafonnées à l’acide folique à la bonne concentration dans les médias RPMI frais. Ajoutez cette solution nanoparticule à chaque puits de la plaque préparée de 24 puits qui contient des cellules SK-OV-3 à une concentration de 400 microgrammes par millilitre.Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après cela, trypsiniser les cellules avec 0,5 millilitres de 0,25% trypsine et EDTA. Pour neutraliser la trypsine, ajouter au moins un millilitre de RPMI 1640 sans acide folique et centrifuger les cellules à 123 fois g pendant six minutes.Pour laver les cellules, enlever le supernatant, résuspendre les cellules en deux millilitres de PBS et centrifugeuse à 123 fois g pendant six minutes. Répétez cette étape de lavage deux fois pour enlever les nanoparticules non liées. Puis résuspendez les cellules avec un à deux millilitres d’une solution 2%Tween dans PBS.Comptez les cellules à l’aide d’un hémomètre et trypan bleu. Diluer les cellules dans une solution de 2%Tween dans PBS à la concentration choisie pour la détection. Utilisez le fichier STL tridimensionnel fourni pour imprimer en 3D le réservoir d’écoulement avec du plastique thermoplastique ABS ou PLA.Après avoir imprimé le réservoir, nettoyez et assemblez le système pour l’utiliser. Placez les couvercles en verre sur la fente d’un millimètre par trois millimètres et le trou d’un centimètre dans le système d’écoulement et scellez soigneusement avec du silicone pour éviter les fuites. Ensuite, placez le tube capillaire dans les tubes durcis au silicone.Insérez les tubes dans la chambre d’écoulement par le côté du réservoir d’écoulement de sorte que le tube capillaire en verre soit directement au-dessus et devant la fente de trois millimètres et le trou d’un centimètre. Sceller le tube avec du silicone. Connectez ensuite le transducteur à un pulsateur à ultrasons et à un récepteur.Amplifiez le signal avec un gain de 59 décibels. Connectez la sortie du filtre à un oscilloscope reconfigurable polyvalent équipé d’un réseau de portes programmables sur le terrain intégré. Connectez l’un des tubes provenant de la chambre d’écoulement à une jonction T qui est reliée à deux pompes à seringues à chaque branche.Remplissez l’une des pompes à seringues d’air et l’autre pompe avec l’échantillon à analyser. Réglez la pompe contenant de l’air à un débit de 40 microlitres par minute et réglez la pompe contenant l’échantillon à un débit de 20 microlitres par minute. Ensuite, connectez le tube restant sortant du système d’écoulement à un récipient de 10% d’eau de Javel pour éliminer les cellules après leur sortie du système d’écoulement.Placez la section du tube capillaire de quartz en alignement direct avec le transducteur dans la vue sur le terrain du microscope pour permettre un placement soigneux de la fibre optique au-dessus de l’échantillon de sorte qu’il illumine toute la largeur du tube. Irradier l’échantillon à l’aide d’une fibre optique canaliser un laser à l’état solide pompé par diode fonctionnant à une longueur d’onde de 1053 nanomètres. Utilisez une caméra montée au microscope pour enregistrer le débit, le tir du laser et le passage d’échantillons à travers le système d’écoulement.Dans cette étude, la cytométrie photoacoustique d’écoulement et l’agent ciblé de ciblage de sulfide de cuivre sont employées pour détecter des cellules de tumeur circulante ovariennes. Une image TEM typique des nanoparticules synthétisées montre que la taille moyenne d’une nanoparticule typique est d’environ 8,6 nanomètres. Les diamètres horizontaux et verticaux de chaque particule sont ensuite mesurés perpendiculairement les uns aux autres et en moyenne.Le diamètre hydrodynamique moyen de ces particules est de 73,6 nanomètres. Les nanoparticules de sulfure de cuivre ont une courbe d’absorption caractéristique qui s’étend dans le proche infrarouge. Il ya un artefact léger autour de 850 nanomètres qui est causée par le commutation de lasers par le spectrophotomètre.Les images de microscopie par fluorescence de cellules incubées avec des nanoparticules étiquetées fluorescentes montrent que l’absorption de nanoparticules peut être visualisée par la présence de fluorescence à travers la cellule. Les cellules non incubées avec des nanoparticules ne montrent aucun signal fluorescent. La présence de ce signal fluorescent indique l’absorption réussie des particules et leur capacité à être détectées dans le système d’écoulement.Des exemples de signaux typiques d’acquisition de données sont affichés ici. Les données brutes indiquent les différences de signal entre les nanoparticules étiquetées cellules, PBS, et l’acide folique plafonné nanoparticules de sulfure de cuivre. En utilisant la vue de laboratoire personnalisée et le logiciel MATLAB, les reconstructions d’images sont faites des contrôles positifs et négatifs en temps réel et après l’acquisition respectivement.Les enveloppeurs individuels sont ensuite convertis en valeurs pixel et affichés sous forme de colonnes indépendantes. Des différences claires dans le signal photoacoustique se produisent entre PBS et les nanoparticules de sulfure de cuivre plafonnées à l’acide folique à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Au cours de cette procédure, il est essentiel d’aligner correctement le transducteur ultrasons, le microscope et la fibre optique dans le système photoacoustique de cytométrie d’écoulement.Confirmez l’alignement du système en testant les contrôles positifs et négatifs. En raison de la polyvalence des techniques de ciblage photoacoustique et du large éventail d’applications possibles à l’aide de PAFC, cette technique ouvre la voie à des applications cliniques et de recherche d’importance translation. Pour assurer l’application clinique, d’autres études devraient se concentrer sur l’essai d’échantillons de patients et la réduction des étapes procédurales.La synthèse des nanoparticules doit avoir lieu dans une hotte de fumée chimique utilisant l’équipement de protection approprié. Les lignées cellulaires humaines doivent être traitées conformément aux lignes directrices de votre établissement. L’utilisation du laser nécessite une formation en radioprotentique et un EPI approprié.L’utilisation du laser et les tests photoacoustiques ne devraient être effectués que par du personnel hautement qualifié.

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Nous avons développé un cytomètre en flux en utilisant des ultrasons pour détecter induite par laser circulant cellules de mélanome comme un indicateur précoce de la maladie métastatique.

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Nous rapportons un protocole d’échographie et d’imagerie photoacoustique coenregistré pour l’imagerie transvaginale des lésions ovariennes / annexielles. Le protocole peut être utile pour d’autres études d’imagerie photoacoustique translationnelle, en particulier celles utilisant des réseaux d’ultrasons commerciaux pour la détection de signaux photoacoustiques et des algorithmes standard de formation de faisceau de retard et de somme pour l’imagerie.

Protocole d’échographie et d’imagerie photoacoustique coenregistré pour l’imagerie transvaginale des lésions ovariennes

Les modifications du flux sanguin ovarien pendant la période préovulatoire sont essentielles à l’ovulation. L’échographie Doppler a été utilisée chez l’homme et les grands animaux pour évaluer l’hémodynamique et la perfusion ovarienne. Un protocole est présenté pour l’application de l’échographie Doppler pour évaluer l’hémodynamique ovarienne pendant les phases préovulatoire et périovulatoire chez la souris.

L’échographie Doppler pour l’imagerie en direct et la quantification de la fonction vasculaire ovarienne chez la souris

Découvrez la détection du cancer de l'ovaire par cytométrie photoacoustique utilisant des nanoparticules de sulfure de cuivre ciblées. Cette méthode simple et peu coûteuse permet d'identifier les cellules tumorales circulantes dans le sang.

Détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique

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