Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

Ce protocole a donné quelques-unes des meilleures idées que nous avons jusqu’à présent sur la façon dont Candida albicans habite le tractus gastro-intestinal mammifère. Par exemple, jusqu’à récemment, nous ne savions pas vraiment où Candida est localisée dans l’intestin ou laquelle de ses nombreuses formes morphologiques il assume dans ce créneau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser Candida dans son environnement naturel sans perturber les interactions tridimensionnelles du champignon avec les structures hôtes ou avec les bactéries du microbiote.

Parce que l’intestin est un environnement complexe, il est très difficile de modéliser dans le laboratoire et donc il a été très satisfaisant de trouver un moyen de sonder la biologie Candida directement dans un modèle hôte. Certains composants du microbiote intestinal, y compris candida albicans sont soupçonnés de jouer un rôle dans des maladies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin. Cette technique peut potentiellement être utilisée pour diagnostiquer la présence de micro-organismes spécifiques dans les échantillons de biopsie obtenus auprès des patients.

La maîtrise de la technique du gavage et la capacité de disséquer les segments gastro-intestinaux sans déchirer les organes sont importantes pour obtenir des résultats optimaux. Pour commencer, gavage chaque animal avec le volume calculé d’un inoculum donné. Fixez une aiguille d’alimentation autoclavée à une seringue d’un millilitre et remplissez la seringue d’un volume de gavage pour vous assurer d’enlever toutes les bulles.

Placez la seringue sur une surface stérile. Pour fixer l’animal, maintenez-le à la base de la queue avec la main dominante et faites glisser la main non dominante vers le haut du dos de l’animal à la peau lâche juste derrière les oreilles. Rassemblez le scruff ensemble étroitement avec le pouce et l’index.

Prenez l’animal par le scruff, retournez-le et bouclez le petit doigt de la même main autour de la queue pour immobiliser l’animal contre la paume de la main. Étendre doucement la tête de l’animal de sorte qu’il soit en ligne droite avec le corps. Puis ramasser la seringue avec la main dominante et la tenir perpendiculaire à l’animal avec l’aiguille incurvée pointant vers le bas.

Utilisez la boule de l’aiguille pour accrocher doucement un coin intérieur de la bouche et avancer l’aiguille le long du côté de la bouche à l’arrière de la gorge, puis déplacez l’aiguille vers le centre. Une fois que la boule de l’aiguille est à l’arrière de la gorge de l’animal, inclinez l’aiguille vers le haut de sorte qu’elle soit parallèle à la ligne du corps de l’animal et laissez-la glisser en douceur dans la gorge. Si l’aiguille ne glisse pas en douceur dans la gorge, l’aiguille peut ne pas être bien positionnée et doit être retirée pour se repositionner et réessayer.

Avancez l’aiguille en douceur, ce qui permet à l’animal d’avaler l’aiguille jusqu’à ce que seulement quelques millimètres restent visibles. Testez que la boule de l’aiguille est dans l’estomac en avançant doucement le piston et s’il n’y a pas de résistance, continuer à livrer l’inoculum. Retirez lentement l’aiguille une fois que l’inoculum a été administré et placez l’animal dans sa cage.

Continuez à surveiller l’animal pendant cinq à dix minutes à la recherche de signes de respiration ou de détresse laboriée et vérifiez qu’il reprend son activité normale peu après le gavage. Si le même inoculum sera utilisé pour le prochain animal, nettoyez l’aiguille avec un lingette d’alcool. Si un inoculum différent est utilisé, remplacez l’aiguille.

Utilisez des forceps émoussés pour pincer une section de la peau abdominale et inciser la peau et le fascia sous-jacent près de la base du bassin à l’aide de ciseaux. Étendre l’incision en forme de U le long de chaque côté de la cavité péritonéale et jusqu’à la cage thoracique, puis soulever la peau de la route. Utilisez des forceps émoussés pour extraire doucement le cécu de la cavité péritonéale à l’aide de ciseaux pour rompre les connexions entre le cécu et les petits et grands intestins.

Placez l’ensemble du céccum dans une cassette d’histologie afin qu’il soit détordé et pose à plat. Placez la deuxième garniture en mousse sur le dessus et fermez la cassette. Placez ensuite la cassette dans un bocal à bouchon à vis contenant du méthacarn.

Exciser la section des gros intestins qui contient une à deux boulettes fécales et a une longueur inférieure à celle de la cassette. Placez le tissu dans la cassette en le gardant à plat et détordre. Superposez-le avec le deuxième tampon de mousse, fermez la cassette et placez-la dans le méthacarn.

Pour chaque section de l’intestin grêle à échantillonner, exciser un segment d’un à deux centimètres qui contiennent du matériel digestif. Placez le tissu dans la cassette, superposez-le avec le deuxième tampon de mousse, fermez la cassette et mettez-la dans le méthacarn. Lors de l’excision de l’estomac, couper les connexions à l’œsophage et les intestins grêles.

Placez le tissu dans la cassette et placez la cassette dans le méthacarn. Laissez les cassettes dans la solution méthacarn à température ambiante pendant au moins trois heures mais moins de deux semaines. Après fixation, retirer les tampons de mousse et remettre chaque section de tissu intact dans sa cassette.

Ensuite, lavez les tissus deux fois pendant 35 minutes dans 100% méthanol, deux fois pendant 25 minutes dans 100% éthanol, et deux fois pendant 20 minutes en xylène. Tapoter les cassettes sur une serviette en papier et les placer dans une cire de paraffine pré-fondue pendant deux heures à 70 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Retirez ensuite les cassettes de la cire, laissez l’excès de cire s’écouler et rangez-les à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient intégrées dans des blocs de cire.

Dé-cirer la paraffine encastré sections histologiques en insérant les diapositives dans un bocal préchauffé rempli de xylène. Laisser le bocal à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis jeter le lavage au xylène. Verser le xylène frais à température ambiante dans le bocal et répéter l’incubation.

Remplissez ensuite le bocal avec 100% d’éthanol et incubez-le à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, retirer les glissières du bocal et les sécher à l’air libre. Pour tacher les C.albicans à l’aide d’une sonde de poisson, commencez par dessiner un cercle autour de la section tissulaire à l’aide d’un stylo Pat.

Pipette 50 microlitres de sonde contenant la solution d’hybridation sur le tissu fixe et doucement l’étendre avec la pointe pipette. Superposer le liquide avec un coverslip hybridation en s’assurant d’éviter les bulles. Puis sceller les glissières dans une chambre d’hybridation étanche à l’eau et incuber les sections pendant trois heures à 50 degrés Celsius dans un four d’hybridation dans l’obscurité.

Après l’incubation, ajouter la solution de lavage dans un bocal Coplin. Retirez soigneusement le coverslip de la lame avec des forceps et placez la lame dans la solution de lavage. Couvrir le bocal de papier d’aluminium et l’incuber à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, lavez les glissières en versant la solution de lavage et en remplissant le bocal avec PBS. Versez immédiatement et remplissez-le de PBS frais en répétant le processus pour un total de deux lavages. Évacuez le PBS avec une tâche délicate essuyer et entourer la section des tissus intestinaux avec un stylo Pat.

Placez les glissières dans un récipient en plastique opaque et ajoutez 50 microlitres de solution de coloration des noyaux de mucine à la section tissulaire. Couvrir le contenant de papier d’aluminium et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l’incubation, mettre les glissières dans un bocal Coplin et les laver deux fois avec du PBS.

Appuyez sur l’excès de PBS sur une serviette en papier, puis évacuez les gouttes finales avec un mouchoir. Placez une goutte de milieu de montage sur chaque section et superposez-la avec un couvercle en verre en s’assurant d’éviter les bulles. Laissez le milieu de montage s’étendre sous l’ensemble du coverslip.

Ancrez le coverslip en place avec du vernis à ongles dans les coins et imagez les diapositives à l’aide d’un microscope fluorescent. Ce protocole peut être utilisé pour étiqueter de façon fluorescente les C.albicans in vitro et dans les tissus hôtes. L’hyphe propagé in vitro, les cellules rondes de levure, les cellules intestinales, et les cellules opaques ont été fixés, permeabilized, et distingués avec la fluorescence et la microscopie de contraste de phase.

Des levures rondes et des hyphes très allongés ont été photographiés dans les gros intestins de la souris. Les tissus hôtes ont été tachés avec la sonde spécifique C.albicans ou la sonde panfongique. C.albicans a été étiqueté rouge, noyaux de cellules hôtes bleu, et la couche de mucus vert.

C.albicans a été détecté dans différents segments de la région IG murine, y compris les régions immédiatement adjacentes à la muqueuse hôte et les régions plus centrales du lumen intestinal. Pour les scientifiques qui n’ont pas encore effectué la technique du gavage, il est important d’obtenir une formation spécialisée avant de tenter cette méthode. Après la coloration des poissons, des techniques immunofluorescentes peuvent être utilisées pour tacher d’autres caractéristiques de la muqueuse hôte.

Cela peut permettre de caractériser les lésions tissulaires ou les réponses immunitaires de l’hôte. Cette technique nous a permis de caractériser la relation entre la morphologie cellulaire fongique des mutants candida albicans et la survie au sein de l’hôte, ce qui nous permet de mieux comprendre la biologie candida albicans dont on peut tirer parti lors du développement de thérapies.