Name: Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant lhybridation fluorescente in Situ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez la visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murin par hybridation fluorescente in situ. Cette méthode révèle la localisation et la morphologie du champignon dans son environnement naturel.

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Les auteurs tient à remercier Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg et KC Huang pour leur orientation dans le développement de la technique FISH. Teresa O'Meara a fourni des commentaires utiles sur le manuscrit, et Miriam Levy a aidé à la photographie. Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R01AI108992, R01DK113788, et un Burroughs Welcome Award dans la pathogenèse des maladies infectieuses.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La méthode décrite ici permet la visualisation des levures et des hyphes de C. albicans dans les voies gastro-intestinales des souris colonisées de n'importe quel sexe ou souche. La sonde FISH s'hybride à 23S rRNA, qui est distribué dans tout le cytoplasme fongique. Notre méthode a été adaptée d'un protocole précédemment rapporté pour visualiser des bactéries d'intestin20. Parce que C. albicans change sa morphologie au sein de l'hôte, la méthode est utile pour surveiller la forme des cellules fongiques ainsi que la localisation. Par exemple, nous avons utilisé cette méthode pour réfuter l'hypothèse selon laquelle les levures prédominent dans tout le tube digestif, et pour exposer les écarts entre les phénotypes in vivo et in vitro de certains mutants « défectueux de filamentation »12.
Plusieurs modèles de souris existent pour C. albicans commensal colonization. Le microbiote des souris de laboratoire et des humains est distinct et, chez la souris, l'utilisation d'antibiotiques ou d'un régime spécialisé est nécessaire pour établir une colonisation stable. Le traitement aux antibiotiques améliore également la colonisation de C. albicans de l'homme et est un facteur de risque majeur pour la maladie disséminée10. Les antibiotiques utilisés dans cette étude sont relativement peu coûteux et produisent des diminutions fiables du microbiote bactérien. Notez que les antibiotiques sont utilisés pour diminuer le fardeau des espèces bactériennes antagonistes, pas pour éliminer toutes les bactéries des animaux. Si les chercheurs souhaitent étudier les interactions C. albicans-hôteen l'absence de bactéries ou pour éviter l'utilisation d'antibiotiques ou d'un régime alimentaire spécial, les animaux exempts de germes peuvent être remplacés par des animaux élevés de façon conventionnelle; cependant, les souris gnotobiotiques présentent certaines anomalies immunitaires et anatomiques et peuvent donc ne pas convenir à toutes les fins.
Plusieurs étapes sont importantes pour la coloration FISH réussie: La méthode de fixation recommandée est essentielle pour préserver l'intégrité structurelle des tissus gastro-intestinaux, en particulier le contenu fragile de l'intestin lumen, tels que la couche de mucus et la tridimensionnelle l'organisation des champignons et des bactéries16. Veuillez noter que de nombreuses solutions de fixation couramment utilisées qui contiennent de l'eau sont très dommageables pour l'architecture lumineuse. Les fixatifs et les solutions pour les lavages post-fixation recommandés dans ce protocole ne contiennent pas d'eau, et il est important d'éviter la contamination par l'eau. Une autre étape critique est l'étape d'hybridation, où il est important d'éviter l'évaporation de la solution d'hybridation lors de l'incubation des toboggans dans le four d'hybridation. Nous vous suggérons de placer les diapositives dans un contenant étanche pour éviter ce problème. Alternativement, on peut utiliser des chambres d'hybridation étanches comme celles utilisées à l'origine pour l'hybridation des microréseaux.
Une sonde C. albicans-spécifique FISH est décrite dans ce protocole. Cependant, parce que beaucoup de souris d'élevage en laboratoire ne contiennent pas de C. albicans ou d'autres champignons dans le cadre de leur microbiote intestinal naturel, une sonde panfongique peut spécifiquement tacher C. albicans chez des animaux colonisés expérimentalement. La substitution d'une sonde panfunonique peut être souhaitable en raison de ses caractéristiques d'hybridation supérieures et de son rapport signal-bruit plus élevé. Si la sonde panfunonale est utilisée comme sonde pseudospécifique pour C. albicans, il est important de documenter un manque de coloration chez les animaux non infectés (c.-à-d., traités avec des antibiotiques, mais pas C. albicans). La coloration d'un animal témoin non colonisé est également utile pour évaluer la coloration de fond qui peut résulter de l'adhérence des sondes FISH aux particules alimentaires. Dans l'ensemble, l'utilisation de sondes FISH offre une spécificité accrue par rapport à la plupart des autres méthodes de coloration des champignons, comme le blanc Calcofluor (qui tache la chitin, un composant de la paroi cellulaire qui peut varier d'un type de cellule à l'autre), le GMS ou les anticorps antifongiques disponibles dans le commerce. En outre, la coloration FISH permet la costaining de plusieurs organismes à l'aide de sondes FISH étiquetées différemment pour les rARN spécifiques aux espèces.
Une mise en garde de cette technique est que certains types de cellules de levure C. albicans semblent très similaires par FISH (par exemple, les types de cellules opaques et GUT). Pour distinguer entre ces types de cellules, il serait utile de développer des sondes d'hybridation aux ARNm fongiques spécifiques au type cellulaire. Néanmoins, dans sa forme actuelle, la technique FISH a déjà révélé des écarts surprenants entre les comportements in vivo et in vitro des mutants de C. albicans évalués dans les deux conditions12, indiquant des interactions complexes dans le environnement commensal naturel qui ne sont pas suffisamment imités par les essais in vitro existants. D'autres études de différentes taches de C. albicans dans d'autres hôtes de type sauvage et mutants sont susceptibles de donner des informations supplémentaires sur les interactions fongiques-hôtes. En particulier, il sera instructif de profiler C. albicans dans les modèles de maladie sexiste inflammatoire, qui est associée à des seins élevés de C. albicans chez l'homme21, et d'autres modèles de C. albicans surcroissance et la maladie. La technique FISH peut également être combinée avec l'immunohistochimie pour tacher les cellules hôtes spécifiques. Dans l'ensemble, la méthode présentée ici fournit un moyen raisonnablement rapide et fiable pour déterminer la localisation et la morphologie de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.

Candida albicans est un commensal fongique ainsi qu'un agent pathogène humain opportuniste. Cette levure n'a pas de niche environnementale définie et se propage plutôt dans le tractus gastro-intestinal (GI), la peau et le tractus génito-urinaire des humains et d'autres mammifères1. Alors que les premières recherches sur C. albicans se sont concentrées principalement sur son potentiel de virulence, plusieurs rapports récents suggèrent que la propagation des organismes dans l'intestin peut jouer un rôle important dans la santé normale, y compris le développement immunitaire de la hôte2,3,4. Pour faciliter les investigations du commensalisme de C. albicans dans l'intestin des mammifères, nous avons développé un modèle de souris de colonisation stable de GI et une méthode d'hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour visualiser des cellules de levure fongique et des hyphes dans le lumen intestinal.
À quelques exceptions près5, les souris de élevage en laboratoire présentent généralement une résistance à la colonisation fongique du tube digestif. On pense que la résistance à la colonisation est médiée par des espèces bactériennes spécifiques; cependant, ceci peut être surmonté par le traitement des animaux avec des antibiotiques6,7 ou l'utilisation d'un régime chimiquement défini qui modifie vraisemblablement la composition bactérienned'espèces 8,9. De même, chez l'homme, l'utilisation d'antibiotiques à large spectre a été associée à la surcroissance et à la diffusion de C. albicans 10. Notre modèle de colonisation murine utilise des antibiotiques à large spectre pour établir la colonisation de C. albicans de souris immunocompétentes et traditionnellement élevés. La pénicilline et la streptomycine sont fournies dans l'eau potable des animaux pendant une semaine avant le gavage avec 108 unités de formation de colonies (CUS) de C. albicans. Tant que l'eau infusée d'antibiotiques est continue, C. albicans se propagera à travers le tractus gastro-intestinal, atteignant les titers fécaux de 106à 108 CfU/g. Malgré le niveau élevé de colonisation fongique, les animaux restent en bonne santé et prennent du poids au même rythme que les témoins non infectés. Ce modèle a été utilisé avec succès pour dépister et caractériser plusieurs c. albicans commensalism facteurs11,12.
Comme d'autres membres du royaume fongique, C. albicans est capable d'une énorme plasticité morphologique13. Dans des conditions in vitro, il a été montré à la transition entre au moins six types de cellules de levure unicellulaires, ainsi que des hyphes multicellulaires et des pseudohyphes. La transition levure-hypha est l'un de ses attributs de virulence les mieux caractérisés, et les hyphes et les pseudohyphes prédominent dans la plupart des modèles de maladies des mammifères, ainsi que dans les tissus humains infectés. Pour déterminer la localisation et la morphologie de cellules de C. albicans dans le tube digestif murine, nous avons développé une technique de FISH pour colorer des levures et des hyphes dans les sections histologiques fixes. Les sondes se composent d'oligonucléotides d'ADN étiquetés fluorescents qui s'hybrident à l'ARN ribosomal fongique 23S (rRNA), qui est distribué dans tout le cytoplasme fongique. Parce que les tissus hôtes sont fixés d'une manière qui préserve l'architecture tridimensionnelle de l'intestin, y compris la muqueuse hôte, le matériel digestif, le microbiote bactérien, et le mucus dans le lumen intestinal, cette technique permet la localisation des champignons cellules par rapport à ces repères lorsqu'ils sont tachés. La technique FISH se compare favorablement aux taches histologiques traditionnelles pour les champignons, telles que le Schiff acide périodique (PAS) ou la méthénamine-Argent (GMS) de Gomori, ainsi que les anticorps antifongiques disponibles dans le commerce, parce que ces réactifs ne sont pas spécifiques pour C. albicans. En outre, les fixatifs standard enlèvent la couche de mucus et perturbent d'autres contenus de l'intestin lumen14,15.
Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées pour établir la colonisation de haute qualité de C. albicans du tractus gastro-intestinal de souris, pour la dissection du tube digestif des animaux euthanasiés, pour la fixation de tissu d'une manière qui préserve luminal pour la détection de C. albicans dans les tissus hôtes à l'aide de FISH. En plus des souches sauvages de type et mutant de C. albicans, la technique du gavage peut être utilisée pour fournir d'autres micro-organismes. La technique de fixation serait utile pour toute étude dans laquelle la préservation du contenu de l'intestin est souhaitée. La procédure FISH peut être complétée en un jour et peut être utilisée pour localiser plusieurs espèces fongiques à l'aide de multiples sondes étiquetées différemment.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td>peut être substituée par n’importe quel fournisseur</td></tr> La <tr><td>gélose</td><td></td><td></td> au sang BHI <td>peut être substituée par n’importe quel fournisseur</td></tr> <tr><td>C. albicans Sonde FISH</td><td>IDT DNA Technologies</td><td>sur commande</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Chambre pour l’incubation</td><td></td><td></td> d’hybridation <td>Chambre étanche destinée à réduire l’évaporation</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99,5</td></tr> %<tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Chiffons d’essuie-glace à tâche délicate</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>de qualité biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Aiguilles d’alimentation</td><td>Cadence, Inc.</td><td>7910</td><td>métal ; 20 X1-1/2" W/2-1/4 ; peut être autoclavé pour stériliser</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>autres fluorophores disponibles</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>autres fluorophores disponibles</td></tr><tr><td>Coussinets en mousse</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Commandez des coussinets en mousse qui s’adapteront aux cassettes</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>grade de biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>réactif ACS, >=99,5 %</td></tr> <tr><td>Verre Coplin</td><td>pot Fisher</td><td>08-815</td><td>pouvant contenir jusqu’à 10 lames dos à dos</td></tr><tr><td>Cassettes d’histologie</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Cassettes profondes pour que le caecum ne soit pas écrasé</td></tr><tr><td>Lamelles d’hybridation</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td> sans <td>RNase</td></tr><tr><td>Four</td> <td>d’hybridation</td><td></td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Le milieu</td><td></td><td></td> de Lee <td>a été préparé comme décrit dans Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>réactif ACS, >=99,8</td></tr> %<tr><td>Souris</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>adulte BALB/c ; 18-21 grammes (8-10 semaines)</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>Solution à 16 %</td></tr><tr><td>Cire de parrafine</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast pour enrobage tissulaire</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>UCSF Installation de culture cellulaire Unité de production de milieux</td><td>CCFAL003</td><td>sans calcium, sans magnésium ; peut être substitué par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr> La <tr><td>gélose</td><td></td><td></td> au dextrose Sabouraud <td>peut être Chlorure de</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur ; maintenir</td></tr> le <tr><td>dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>peut être remplacé par n’importe quel fournisseur ; maintenir</td>le streptomycine sans RNase</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>Le stylo Super PAP</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>peut être remplacé par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur ; maintenir sans RNase</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>ne contient pas de DAPI</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>réactif de qualité</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>peut être substitué par n’importe quel fournisseur</td></tr></tbody></table>

visualisation de candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in situ

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans est une composante fongique du microbiote intestinal chez l'homme et de nombreux autres mammifères. Bien que C. albicans ne cause pas de symptômes chez la plupart des hôtes colonisés, le réservoir commensal ne servent de dépôt pour les maladies infectieuses, et la présence de seins fongiques élevés dans l'intestin est associée à une maladie inflammatoire de l'intestin. Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser la morphologie et la localisation de cellules de C. albicans dans un modèle de souris de colonisation gastro-intestinale stable. La colonisation est établie à l'aide d'une seule dose de C. albicans chez les animaux qui ont été traités avec des antibiotiques oraux. Des segments de tissu intestinal sont fixés d'une manière qui préserve l'architecture du contenu luminal (micro-organismes et mucus) ainsi que la muqueuse hôte. Enfin, l'hybridation in situ fluorescente est effectuée à l'aide de sondes contre l'ARNr fongique pour tacher les C. albicans et les hyphes. Un avantage clé de ce protocole est qu'il permet l'observation simultanée de la morphologie cellulaire de C. albicans et de son association spatiale avec les structures hôtes pendant la colonisation gastro-intestinale.

Suivant les instructions fournies, le résultat de cette technique sera l'étiquetage fluorescent des noyaux dans l'épithélium hôte, le mucus, et C. albicans dans les tissus gi sectionnés. Les cellules sauvages de type Candida albicans devraient apparaître comme des cellules de levure rondes et unicellulaires ou des hyphes multicellulaires très allongés, parfois ramifiés (les divisions cellulaires ne seront pas apparentes dans les hyphes). Les mutants de C. albicans peuvent en outre apparaître comme des levures « grises » plus petites et légèrement allongées ou comme des levures « GUT » plus grandes et légèrement allongées (transition induite par les gastro-intestinaux) ou « opaques ».
La figure 1 représente l'aiguille d'alimentation utilisée pour le gavage oral, ainsi que les positions clés de l'aiguille pendant la procédure de gavage. La figure 2 fournit une configuration typique utilisée pour la dissection d'organe et l'apparition de segments gastro-intestinaux de la souris.
Figure 3 affiche la coloration FISH de différents types de cellules C. albicans suite à la propagation in vitro et dans le modèle de la souris. La figure 3A montre des images de fluorescence et de phase d'hyphes fixes, perméabilisés et propagés in vitro. La formation d'hypha a été induite avec le milieu de Lee liquide18 avec 2% N-acetylglucosamine, pH 6.8 à 37 oC. La figure 3B montre des images de fluorescence et de phase de cellules de levure fixes, perméabilisées et propagées in vitro. La figure 3C,D montre des cellules GUT fixes, perméabilisées et propagées in vitro et des cellules opaques, respectivement. Les types de cellules GUT et opaques sont morphologiquement indiscernables, sauf lorsqu'ils sont visualisés par microscopie électronique à balayage. Veuillez noter que la coloration FISH des cellules prophétisées in vitro sera sous-optimale si les cellules ne sont pas bien perméabilisées. Un exemple de coloration faible et diffuse est illustré dans la figure 3C. Pour de meilleurs résultats, les conditions de fixation et de perméabilisation cellulaires doivent être déterminées empiriquement pour chaque type de cellule et espèce à étudier. Heureusement, le protocole recommandé pour visualiser C. albicans dans les tissus sectionnés produit une perméabilisation plus cohérente.
Figure 3E-G dépeignent C. albicans dans de grands intestins de souris, tachés de la sonde spécifique C. albicans(Figure 3E) ou de la sonde panfunonale (Figure 3F,G). C. albicans apparaît rouge dans ces images, les noyaux de cellules hôtes sont bleus, et la couche de mucus est verte. Les deux levures rondes et hyphes très allongés (pointes de flèche sailles blanches) se produisent dans les gros intestins. Veuillez noter que la coloration est plus brillante avec la sonde panfungique. Figure 3G représente un mutant ume6 dans le même compartiment, taché de la sonde panfunonique. Ume6 code un facteur de transcription qui est nécessaire pour la formation d'hyphe dans des conditions in vitro19 . Fait intéressant, le phénotype à levures verrouillé s'affiche par ce mutant dans des conditions in vitro n'est pas récapitulé dans l'intestin, ce qui suggère qu'un facteur redondant doit être activé dans l'hôte12. La figure 4 représente l'apparition de types sauvages De C. albicans dans différents segments du tractus gastro-intestinal murine, y compris les régions adjacentes à la muqueuse hôte et aux régions plus centrales du lumen intestinal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> Figure 1 : Positions principales de l'aiguille d'alimentation pendant le gavage. (A) Aiguille d'alimentation. (B) Boule d'aiguille d'alimentation insérée sur le côté de la langue. (C) Aiguille d'alimentation en position verticale avec insertion dans l'œsophage. (D) Aiguille d'alimentation insérée dans l'estomac avec quelques millimètres visibles au-dessus du nez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple de disposition de dissection. (A) Dissection pad et outils. (B) Tract gastro-intestinal excisé. Proximal (œsophage) aux sections distales (anus) : I. Estomac. II. Intestins grêles proximal. III. Intestins grêles médiaux. IV. Intestins grêles distal. V. Cecum. VI. Gros intestin. Les boîtes de bordure pointillées roses indiquent que les tissus doivent être fixés. (C) Tissus positionnés dans des cassettes. Les chiffres romains sont les mêmes que dans le panneau B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives de C. albicans tachésfish. (A) FISH de C. albicans hyphes cultivés dans les médias liquides de Lee18 avec 2% N-acetylglucosamine, pH 6.8. (B) FISH de C. albicans cellules de levure rondes cultivées sur YEPD - 2% plaques d'agar. (C) FISH des cellules GUT de C. albicans (ySN1045) cultivées sur des plaques de YEPD - 2% d'agar. (D) FISH de C. albicans cellules opaques cultivées sur YEPD - 2% plaques d'agar. (E) Type sauvage C. albicans (ySN250) dans les gros intestins, tachés de la sonde c. albicans-spécifique. (F) Sauvage de type C. albicans dans les gros intestins, tachés de la sonde panifgique. (G) Ume6 mutant (ySN1479) dans les gros intestins, taché de la sonde panfunonique: rouge est C. albicans, bleu est l'hôte des noyaux épithéliales, et le vert est mucine. Les pointes de flèche indiquent des hyphes. Les flèches indiquent la levure. Les barres d'échelle de 20 m. Les images F et G sont adaptées de Witchley et coll.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> Figure 4 : Apparition de C. albicans tachés fish dans différents compartiments intestinaux. Le type sauvage C. albicans est indiqué dans les segments indiqués du tractus gastro-intestinal de la souris. Dans chaque compartiment, des images représentent la zone adjacente à la muqueuse hôte et la région centrale du lumen intestinal. La coloration a été réalisée avec la sonde panfongique. Barre à l'échelle de 20 m. Les images sont adaptées de Witchley et coll.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Stocks d'antibiotiques (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pénicilline G</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Streptomycine</td>
			<td>400 mg/L</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Methacarn Methacarn</td>
		</tr>
<tr>
<td>stock</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>volume</td>
			<td>Unités</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méthanol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>chloroforme</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide acétique glaciaire</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solution d'hybridation</td>
		</tr>
<tr>
<td>stock</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>volume</td>
			<td>Unités</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% formamide</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>L (conservé dans de petits aliquots à -20 oC entre les utilisations)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau sans RNase</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solution de lavage FISH</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau sans RNase</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solution de coloration Mucin-nuclei</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 g/mL</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>lectine, 40 g/mL</td>
			<td>1,6 g/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7,4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Volumes et concentrations typiques de solutions utilisées dans ce protocole.

Le but de ce protocole est de visualiser la forme et la localisation des cellules de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.

Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Ce protocole a donné quelques-unes des meilleures idées que nous avons jusqu’à présent sur la façon dont Candida albicans habite le tractus gastro-intestinal mammifère. Par exemple, jusqu’à récemment, nous ne savions pas vraiment où Candida est localisée dans l’intestin ou laquelle de ses nombreuses formes morphologiques il assume dans ce créneau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser Candida dans son environnement naturel sans perturber les interactions tridimensionnelles du champignon avec les structures hôtes ou avec les bactéries du microbiote.Parce que l’intestin est un environnement complexe, il est très difficile de modéliser dans le laboratoire et donc il a été très satisfaisant de trouver un moyen de sonder la biologie Candida directement dans un modèle hôte. Certains composants du microbiote intestinal, y compris candida albicans sont soupçonnés de jouer un rôle dans des maladies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin. Cette technique peut potentiellement être utilisée pour diagnostiquer la présence de micro-organismes spécifiques dans les échantillons de biopsie obtenus auprès des patients.La maîtrise de la technique du gavage et la capacité de disséquer les segments gastro-intestinaux sans déchirer les organes sont importantes pour obtenir des résultats optimaux. Pour commencer, gavage chaque animal avec le volume calculé d’un inoculum donné. Fixez une aiguille d’alimentation autoclavée à une seringue d’un millilitre et remplissez la seringue d’un volume de gavage pour vous assurer d’enlever toutes les bulles.Placez la seringue sur une surface stérile. Pour fixer l’animal, maintenez-le à la base de la queue avec la main dominante et faites glisser la main non dominante vers le haut du dos de l’animal à la peau lâche juste derrière les oreilles. Rassemblez le scruff ensemble étroitement avec le pouce et l’index.Prenez l’animal par le scruff, retournez-le et bouclez le petit doigt de la même main autour de la queue pour immobiliser l’animal contre la paume de la main. Étendre doucement la tête de l’animal de sorte qu’il soit en ligne droite avec le corps. Puis ramasser la seringue avec la main dominante et la tenir perpendiculaire à l’animal avec l’aiguille incurvée pointant vers le bas.Utilisez la boule de l’aiguille pour accrocher doucement un coin intérieur de la bouche et avancer l’aiguille le long du côté de la bouche à l’arrière de la gorge, puis déplacez l’aiguille vers le centre. Une fois que la boule de l’aiguille est à l’arrière de la gorge de l’animal, inclinez l’aiguille vers le haut de sorte qu’elle soit parallèle à la ligne du corps de l’animal et laissez-la glisser en douceur dans la gorge. Si l’aiguille ne glisse pas en douceur dans la gorge, l’aiguille peut ne pas être bien positionnée et doit être retirée pour se repositionner et réessayer.Avancez l’aiguille en douceur, ce qui permet à l’animal d’avaler l’aiguille jusqu’à ce que seulement quelques millimètres restent visibles. Testez que la boule de l’aiguille est dans l’estomac en avançant doucement le piston et s’il n’y a pas de résistance, continuer à livrer l’inoculum. Retirez lentement l’aiguille une fois que l’inoculum a été administré et placez l’animal dans sa cage.Continuez à surveiller l’animal pendant cinq à dix minutes à la recherche de signes de respiration ou de détresse laboriée et vérifiez qu’il reprend son activité normale peu après le gavage. Si le même inoculum sera utilisé pour le prochain animal, nettoyez l’aiguille avec un lingette d’alcool. Si un inoculum différent est utilisé, remplacez l’aiguille.Utilisez des forceps émoussés pour pincer une section de la peau abdominale et inciser la peau et le fascia sous-jacent près de la base du bassin à l’aide de ciseaux. Étendre l’incision en forme de U le long de chaque côté de la cavité péritonéale et jusqu’à la cage thoracique, puis soulever la peau de la route. Utilisez des forceps émoussés pour extraire doucement le cécu de la cavité péritonéale à l’aide de ciseaux pour rompre les connexions entre le cécu et les petits et grands intestins.Placez l’ensemble du céccum dans une cassette d’histologie afin qu’il soit détordé et pose à plat. Placez la deuxième garniture en mousse sur le dessus et fermez la cassette. Placez ensuite la cassette dans un bocal à bouchon à vis contenant du méthacarn.Exciser la section des gros intestins qui contient une à deux boulettes fécales et a une longueur inférieure à celle de la cassette. Placez le tissu dans la cassette en le gardant à plat et détordre. Superposez-le avec le deuxième tampon de mousse, fermez la cassette et placez-la dans le méthacarn.Pour chaque section de l’intestin grêle à échantillonner, exciser un segment d’un à deux centimètres qui contiennent du matériel digestif. Placez le tissu dans la cassette, superposez-le avec le deuxième tampon de mousse, fermez la cassette et mettez-la dans le méthacarn. Lors de l’excision de l’estomac, couper les connexions à l’œsophage et les intestins grêles.Placez le tissu dans la cassette et placez la cassette dans le méthacarn. Laissez les cassettes dans la solution méthacarn à température ambiante pendant au moins trois heures mais moins de deux semaines. Après fixation, retirer les tampons de mousse et remettre chaque section de tissu intact dans sa cassette.Ensuite, lavez les tissus deux fois pendant 35 minutes dans 100% méthanol, deux fois pendant 25 minutes dans 100% éthanol, et deux fois pendant 20 minutes en xylène. Tapoter les cassettes sur une serviette en papier et les placer dans une cire de paraffine pré-fondue pendant deux heures à 70 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Retirez ensuite les cassettes de la cire, laissez l’excès de cire s’écouler et rangez-les à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient intégrées dans des blocs de cire.Dé-cirer la paraffine encastré sections histologiques en insérant les diapositives dans un bocal préchauffé rempli de xylène. Laisser le bocal à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis jeter le lavage au xylène. Verser le xylène frais à température ambiante dans le bocal et répéter l’incubation.Remplissez ensuite le bocal avec 100% d’éthanol et incubez-le à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, retirer les glissières du bocal et les sécher à l’air libre. Pour tacher les C.albicans à l’aide d’une sonde de poisson, commencez par dessiner un cercle autour de la section tissulaire à l’aide d’un stylo Pat.Pipette 50 microlitres de sonde contenant la solution d’hybridation sur le tissu fixe et doucement l’étendre avec la pointe pipette. Superposer le liquide avec un coverslip hybridation en s’assurant d’éviter les bulles. Puis sceller les glissières dans une chambre d’hybridation étanche à l’eau et incuber les sections pendant trois heures à 50 degrés Celsius dans un four d’hybridation dans l’obscurité.Après l’incubation, ajouter la solution de lavage dans un bocal Coplin. Retirez soigneusement le coverslip de la lame avec des forceps et placez la lame dans la solution de lavage. Couvrir le bocal de papier d’aluminium et l’incuber à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, lavez les glissières en versant la solution de lavage et en remplissant le bocal avec PBS. Versez immédiatement et remplissez-le de PBS frais en répétant le processus pour un total de deux lavages. Évacuez le PBS avec une tâche délicate essuyer et entourer la section des tissus intestinaux avec un stylo Pat.Placez les glissières dans un récipient en plastique opaque et ajoutez 50 microlitres de solution de coloration des noyaux de mucine à la section tissulaire. Couvrir le contenant de papier d’aluminium et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l’incubation, mettre les glissières dans un bocal Coplin et les laver deux fois avec du PBS.Appuyez sur l’excès de PBS sur une serviette en papier, puis évacuez les gouttes finales avec un mouchoir. Placez une goutte de milieu de montage sur chaque section et superposez-la avec un couvercle en verre en s’assurant d’éviter les bulles. Laissez le milieu de montage s’étendre sous l’ensemble du coverslip.Ancrez le coverslip en place avec du vernis à ongles dans les coins et imagez les diapositives à l’aide d’un microscope fluorescent. Ce protocole peut être utilisé pour étiqueter de façon fluorescente les C.albicans in vitro et dans les tissus hôtes. L’hyphe propagé in vitro, les cellules rondes de levure, les cellules intestinales, et les cellules opaques ont été fixés, permeabilized, et distingués avec la fluorescence et la microscopie de contraste de phase.Des levures rondes et des hyphes très allongés ont été photographiés dans les gros intestins de la souris. Les tissus hôtes ont été tachés avec la sonde spécifique C.albicans ou la sonde panfongique. C.albicans a été étiqueté rouge, noyaux de cellules hôtes bleu, et la couche de mucus vert.C.albicans a été détecté dans différents segments de la région IG murine, y compris les régions immédiatement adjacentes à la muqueuse hôte et les régions plus centrales du lumen intestinal. Pour les scientifiques qui n’ont pas encore effectué la technique du gavage, il est important d’obtenir une formation spécialisée avant de tenter cette méthode. Après la coloration des poissons, des techniques immunofluorescentes peuvent être utilisées pour tacher d’autres caractéristiques de la muqueuse hôte.Cela peut permettre de caractériser les lésions tissulaires ou les réponses immunitaires de l’hôte. Cette technique nous a permis de caractériser la relation entre la morphologie cellulaire fongique des mutants candida albicans et la survie au sein de l’hôte, ce qui nous permet de mieux comprendre la biologie candida albicans dont on peut tirer parti lors du développement de thérapies.

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Hybridation in situ par fluorescence des bactéries intestinales dans les sections intestinales de la souris

Cette vidéo démontre le développement d’un modèle murin in vivo pour étudier la formation du biofilm de Candida albicans dans le tissu sous-cutané. L'expérience consiste à implanter des dispositifs infectés par Candida dans la région arrière de l'animal pour le développement d'un biofilm.

Candida albicans Formation d’un biofilm dans un modèle murin in vivo

Nous présentons une procédure expérimentale de développement du biofilm de Candida albicans dans un modèle sous-cutané de souris. Les biofilms fongiques ont été quantifiés en déterminant le nombre d’unités formant des colonies et par une imagerie de bioluminescence non invasive, où la quantité de lumière produite correspond au nombre de cellules viables.

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Nous décrivons ici une technique basée sur le microscope pour visualiser et quantifier les cascades précoces d’événements au cours de la phagocytose d’agents pathogènes tels que les champignons Candida albicans et les particules de plus de 0,5 μm, y compris les billes recouvertes de zymosan et d’IgG.

Visualiser les premiers stades de la phagocytose

Pour visualiser et quantifier les caractéristiques internes des biofilms Candida albicans, nous préparons des spécimens intacts fixes qui sont clarifiés par l’appariement des indices réfractifs. Ensuite, la microscopie de section optique peut être utilisée pour obtenir des données d’image tridimensionnelles bien que toute l’épaisseur du biofilm.

Clarification et imagerie Candida albicans Biofilms

L’analyse ex vivo décrite dans cette étude à l’aide d’extraits d’homogénéisation intestinale et de taches d’immunofluorescence représente une nouvelle méthode pour examiner la morphogenèse hyphale de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les signaux environnementaux régulant la transition morphogenétique dans l’intestin.

Un essai ex vivo pour étudier Candida albicans Hyphal Morphogenesis dans le tractus gastro-intestinal

Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .

Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.

Hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) pour visualiser la colonisation microbienne et l’infection dans les intestins de Caenorhabditis elegans

Ce manuscrit décrit une méthode de criblage de banques mutantes de Candida albicans de taille moyenne pour les phénotypes de morphogenèse au cours d’une infection active chez un hôte mammifère en utilisant la microscopie confocale non invasive.

Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

Nous établissons un modèle murin d’infection liée au cathéter (IRC) associée à C. albicans, dans lequel un biofilm se forme sur le cathéter, et l’interaction entre C. albicans et l’hôte est bien corrélée avec l’IRC clinique. Ce modèle aide à dépister les thérapies pour l’IRC associé au biofilm de C. albicans , jetant ainsi les bases d’une transformation clinique.

Un modèle d’infection à Candida albicans lié à un cathéter chez la souris

Découvrez la visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murin par hybridation fluorescente in situ. Cette méthode révèle la localisation et la morphologie du champignon dans son environnement naturel.

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