Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Comme la prévalence des troubles neurocognitifs ne cesse d’augmenter, notre objectif est d’obtenir, de caractériser et de stocker des échantillons de tissus cérébraux de qualité afin d’obtenir un diagnostic précis et de faire la lumière sur les mécanismes neurodégénératifs. Compte tenu de l’assymétrie cérébrale, notre méthodologie d’échantillonnage permet d’effectuer toutes les méta-études sur des tissus histologiquement bien définis des deux hémisphères et les nombreuses données peuvent être recueillies et corrélées par l’apprentissage profond. Des effets additifs sur des dommages de cerveau par des pathologies multiples sont fréquemment observés.

Le diagnostic défini exige combinant le syndrome clinique avec les résultats neuropathologiques pour découvrir la pathogénie de la maladie, et les thérapies possibles. Les procédures de coupe fraîches ainsi que la gestion des sections macro sont délicates, mais sont également essentielles pour obtenir de bons résultats. Une équipe formée et soudée est cruciale pour surmonter ces difficultés.

Notre protocole comprend une série d’étapes qui sont nécessaires dextérité des mammifères, donc la démonstration visuelle peut être plus utile que les textes descriptifs pour les chercheurs qui souhaitent maîtriser ces techniques. Après confirmation de la thanatographie, utilisez un scalpel pointu pour faire une incision du cuir chevelu à travers la peau des cheveux et le tissu sous-cutané sur la plaque coronale de la pointe du processus mastoïde d’un côté à l’autre, en passant par-dessus le sommet. Séparez soigneusement les deux plis du cuir chevelu du crâne et continuez l’incision jusqu’à ce que la graisse orbitale super jaune devienne visible.

Réfléchissez le cuir chevelu antérieurement et tirez l’autre section du tissu postérieurement. À l’aide d’un scalpel et de forceps, récoltez un petit échantillon du muscle temporal de chaque côté du crâne, plaçant un spécimen dans 4 % de formaldéhyde et l’autre échantillon à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une scie électrique couper le crâne dans une coupe en V sur le côté frontal et enlever la calotte crân.

Après avoir coupé les méninges, récolter un morceau de dura pour la fixation et un autre pour la congélation. Insérez une aiguille de 3,5 pouces de calibre 20 fixée à une seringue de 10 millilitres à travers le corpus callosum pour atteindre le troisième ventricule et rétracter le piston pour obtenir environ 10 millilitres de liquide céphalo-rachidien cérébral. Évaluer la couleur d’apparence et la turbidité du fluide et mesurer le pH.

Tirez doucement sur les deux lobes frontaux pour soulever le cerveau et couper les deux nerfs optiques infundibulum, les artères carotides internes et les troisième, quatrième, cinquième et sixième nerfs crâniens. Couper le tentorium pour atteindre la fossa postérieure et couper les artères vertébrales et les nerfs crâniens inférieurs. Puis insérez le scalpel aussi profondément que possible à travers le magnum foramen pour couper la partie la plus caudale de la médule et enlever soigneusement tout le cerveau.

Utilisez le scalpel pour apparaît à l’os au-dessus de la grotte de Meckel et de recueillir le ganglion gasserien de chaque côté pour la fixation et le gel. Utilisez un maillet chirurgical et un ciseau pour fracturer la sella turcica osseuse et enlever la glande pituitaire pour la fixation dans 4% de formaldéhyde. Inspectez le crâne et tout le cerveau à partir d’altérations macroscopiques et de changements vasculaires.

Utilisez un ruban à mesurer pour mesurer les diamètres de posture transversaux et antérieurs du cerveau et peser le cerveau sur une échelle. Récupérez soigneusement le cercle de Willis pour l’évaluation macroscopique pour la présence des variantes anatomiques, des lésions, ou de la sténose de navire. Séparez et inspectez le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral avant de peser les tissus individuellement.

Retirez un à deux, deux à quatre centimètres carrés de leptomeninges de la convexité et conservez les échantillons dans le milieu de culture de DMEM à haut glucose complet à quatre degrés Celsius. Récoltez la glande pinéale pour la fixation dans 4% de formaldéhyde et retirez les bulbes olfactifs et les nerfs optiques pour la fixation et la congélation d’une de chaque paire. Placez le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral sur la glace à quatre degrés Celsius.

Lorsque tous les tissus d’intérêt ont été récoltés utiliser une colle super adhésif pour rattacher l’os et utiliser une aiguille chirurgicale, et sutures non absorbables pour recoudre le cuir chevelu. Pour la dissection de banque de cerveau emploient un couteau disséquant pour couper le tronc cérébral axially et faire la première coupure au niveau du midbrain rostral par le colliculus supérieur pour obtenir deux tranches pour exposer le nigra de substantia. Couper le tronc cérébral en tranches de 10, huit millimètres en prenant soin d’inclure des coupes passant à travers les pons rostral près des marges supérieures du quatrième ventricule pour observer le locus caeruleus et à travers la medulla oblongata inférieure à la strie acoustique, juste au-dessus de l’apex inférieur du quatrième ventricule pour obtenir des tranches, y compris le noyau moteur dorsal du vagus.

Étiquetez toutes les tranches d’une manière caudale rostrale comme BS pour le tronc cérébral suivie de chiffres arabes. Après la dernière section de tronc cérébral, utilisez la désignation SC pour la moelle épinière suivie de chiffres arabes. Couper le cervelet sur le plan sagittal pour séparer les deux hémisphères cerébelleux au niveau du verme et effectuer des sections sagittales pour obtenir cinq tranches de chaque hémisphère.

Nommez toutes les tranches du verme comme CBR ou CBL pour le cervelet droit et gauche respectivement, et utilisez des chiffres arabes pour identifier chaque section. Ensuite, séparez les deux hémisphères du cerveau à travers le corpus callosum sur le plan sagittal avant de trancher l’hémisphère comme singulièrement le long du plan coronal passant entre le chiasm optique et les corps mammillaires à travers le pôle temporal du lobe frontal, le cingule antérieur, le commissaire antérieur, le noyau des ganglions mineurs et basiques. Faire une deuxième coupe d’environ un centimètre postérieure en passant par les corps mammillary et en exposant les ganglions basiques, thalamus antérieurs sous thalamus, et amygdale.

Continuer à trancher pour disséquer les régions antérieures et postérieures jusqu’à ce que 15 à 21 tranches de centimètre aient été obtenues pour chaque hémisphère. Placez la tranche est sur une surface plane comme ils sont atteints en suivant leur position d’origine dans la direction postérieure antérieure du frontal au pôle occipital, avec la partie continue avec les diapositives précédentes orientées vers le haut. Lorsque toutes les tranches ont été placées, sélectionnez les sections principales à fixer pour l’histopathologie, y compris les sections précédemment acquises et les sections hippocampale, pariétale et occipitale, et étiquetez les tranches comme L ou R suivies de chiffres arabes, y compris une étiquette indiquant si la tranche doit être fixée ou congelée.

Lorsque tous les tissus ont été sectionnés et étiquetés, obtenir une image pour chaque série de sections avant leur fixation ou leur congélation. Pour congeler les échantillons, placez les sections réservées des tissus alternatifs sur un plateau en aluminium prégelé et recouvrez les sections d’une plaque d’aluminium imbriquée pour les garder à plat. Congelez ensuite les tranches d’azote liquide pendant trois minutes avant de placer les échantillons congelés à l’intérieur d’un sac en plastique étiqueté avec leurs codes d’identification correspondants et les numéros de tranche pour un stockage dans la boîte cryogénique appropriée à 80 degrés Celsius.

Pour fixer les échantillons placer les sections réservées de tissu supplétif dans des morceaux individuels de gaze et placer les tranches dans la solution de formaline tamponnée de phosphate de 10% pendant cinq jours dans une salle froide de quatre degrés Celsius. 24 des 27 cerveaux récoltés ont reçu la caractérisation neuropathologique complète avec un diagnostic pathologique clinique défini. L’analyse quantitative préliminaire d’électroencéphalogramme d’une série de 36 donneurs de cerveau indique que le pourcentage principal de rythme alpha est sensiblement inférieur dans les désordres neurocognitifs principaux que dans le désordre neurocognitif doux de personnes âgées normales.

Ici, un exemple d’une pathologie asymétrique est montré avec une atrophie du côté droit évidente macroscopiquement avec les dilatations ventriculaires graves observées dans la section coronale droite par rapport à la gauche. Un autre cas montre un infarctus de l’hémisphère droit, tandis qu’un autre spécimen montre une atrophie claire du corps mammillary droit. Les sections macro peuvent être tachées pour identifier la perte de myéline ou la distribution de l’immunoréactivité dans les hémisphères.

Ces échantillons proviennent de jumeaux qui ont eu un début clinique de la maladie d’Alzheimer dans différents délais en raison de facteurs épigénétiques et environnementaux. Néanmoins, l’analyse microscopique a indiqué une image neuropathologique très semblable indiquant une pathologie élevée de la maladie d’Alzheimer et une angiopathie amyloïde. Dans ces deux patients cependant, le même diagnostic clinique de la maladie d’Alzheimer n’a pas exactement correspondu aux dispositifs neuropathologiques, qui ont indiqué un duo de démence dans les étiologies multiples.

En effet, le premier cas a présenté des corps de Lewy dans le mensonge simple de gyrus et le nigra de substantia. Et le deuxième cas a montré des corps de Lewy liés aux neurites de Lewy dans l’amygdale et dans le noyau de mineurs. La photographie des tranches est soigneusement pour une identification précise des zones anatomiques pendant l’analyse microscopique.

La fixation et la congélation des tranches simples sont également importantes pour préserver la microstructure tissulaire Omics la topographie de l’activation des gènes et la distribution des protéines et corréler ces données avec l’histopathologie. Cultures cellulaires à partir de tissus bien caractérisés, également une enquête sur la pathogénie de la maladie. Portez toujours suffisamment d’équipement de protection individuelle car un tissu cérébral acquis est considéré comme potentiellement infectieux et parce que l’utilisation d’outils dangereux tels que des instruments pointus et de l’azote liquide est nécessaire.