Génération de mutants de suppression de gène dans le cadre dans Pseudomonas aeruginosa et essai pour l'atténuation de virulence dans un modèle simple de souris de l'infection

Ce protocole est significatif pour la création et la détermination des mutations souhaitées corps-esprit dans le génome de Pseudomonas aeruginosa, ainsi que pour tester l’effet des mutations sur la réduction de virulence dans un modèle reproductible de souris. Le principal avantage de cette technique est une validation chromée et une reproductibilité du modèle d’infection de souris. Les bactéries fonctionnent constamment, changent continuellement.

Pour ralentir ce processus, nous utilisons un arrêt gelé, les sac, les accrocher sur plusieurs échelons sur la modification avant de les tester dans le modèle de souris. Quelqu’un qui n’est pas familier avec ces méthodes sera très probablement aux prises avec le développement et la sélection de croisement possible recombinant à tester. En outre, la manipulation des souris pour l’infection sera difficile pour quelqu’un qui ne connaît pas le travail des animaux.

Cette méthode peut être appliquée à l’essai d’autres agents pathogènes et de leurs mutants, ainsi qu’à l’infection par la virulence chez la souris. Par rapport aux modèles actuels, les procédures de reproductibilité ainsi que la validation des clones avant et après l’infection peuvent bénéficier à d’autres chercheurs sur le terrain. La démonstration visuelle de ce protocole donne un aperçu des procédures étendues qui peuvent être difficiles à comprendre ou à comprendre par la lecture seule.

Commencez par cultiver des colonies monosegments, recombinantes dans pseudomonas isolation bouillon, ou PIB. Inoculer et stries 10 microlitres de chaque culture sur des plaques PIA préchauffées, complétées par 10% de saccharose. Puis incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, retirez les plaques de l’incubateur et inspectez-les pour la croissance. La colonie résistante au saccharose devrait être des recombinants à double croisement. Utilisez des cure-dents stériles pour patcher au moins 20 colonies sur des plaques préchauffées de PIA, PIA complétées par 10% de saccharose, et PIA complétées par de la carbenicilline.

Incuber les plaques pendant la nuit et les examiner pour la croissance le lendemain. Les vrais recombinants à double croisement seront sensibles à la carbenicilline et résistants au saccharose. Filtrez 10 à 20 colonies pour la suppression, en utilisant la colonie PCR.

Prenez la croissance d’un double crossover suspect recombinant avec un cure-dent stérile et suspendez-le dans 50 microlitres de PBS. Faire bouillir la suspension à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugeuse pendant trois minutes à 13 000 fois G et placez-la sur la glace.

Ensuite, effectuez pcr selon les instructions manuscrites. Une fois pcr terminé, effectuez l’électrophoresis de gel d’Agarose sur les produits. Les produits d’amplification plus petits indiquent les colonies dans lesquelles la région d’intérêt a été supprimée.

Le matin des injections, décongeler les cryoviaux des cellules bactériennes à quatre degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Garder les flacons sur la glace après la décongélation et injecter les souris dans les deux heures. Transférer le contenu de chaque cryovial dans un nouveau tube de deux millilitres et le centrifuger à 4 500 fois G pendant 10 minutes.

Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS. Répétez la centrifugation et suspendez les cellules de PBS à une concentration finale de 2,5 fois 10 à la neuvième colonie formant des unités par millilitre. Prélevez trois échantillons de la suspension finale de chaque souche pour valider la concentration, le génotype et le phénotype.

Pour chaque souche, aliquot 1,5 millilitres de la suspension cellulaire dans un tube de deux millilitres et préparer le PBS pour les injections de contrôle. Rassemblez les souris et les matériaux nécessaires aux injections dans une salle de chirurgie animale stérile et essuyez toutes les surfaces avec des lingettes désinfectantes avant de commencer. Portez deux paires de gants en latex pour limiter le risque de perforation, si elle est mordue, ainsi qu’un manteau de laboratoire, des lunettes de sécurité et un masque facial.

Retirez la souris de la cage et pesez-la, en marquant la queue avec un marqueur permanent pour le suivi post-injection. Ouvrez une nouvelle seringue d’un millilitre à l’aide d’une aiguille de calibre 27 et dessinez 200 microlitres de PBS stérile. Prenez la souris derrière ses oreilles, en utilisant le pouce et l’index, et pincez pour créer un pli de la peau à la nuque.

Ensuite, fixez la queue dans la paume à l’aide du rose pour maintenir la souris à plat et immobile. Insérez l’aiguille à un angle de 30 degrés dans la cavité péritonéale à gauche ou à droite de la ligne médiane. Soulevez légèrement l’aiguille pour vous assurer qu’elle n’a pas été insérée dans les organes.

Ensuite, injectez lentement le PBS et retirez l’aiguille. Un bolus au site d’injection est typique. Placez l’aiguille dans le récipient d’élimination des objets tranchants désignés et déplacez la souris vers une cage séparée.

Répétez la procédure avec la souris suivante et après que toutes les souris d’une cage sont injectées, déplacez-les de nouveau à leur cage d’origine. Après l’injection du groupe témoin, injectez les groupes de test en utilisant la même procédure. Une fois toutes les injections terminées, retournez les souris dans la salle d’habitation et nettoyez l’aire de travail avec des lingettes désinfectantes.

Pour imager les animaux, préparez le système d’imagerie en définissant les paramètres de la caméra et en chauffant la scène. Réglez le flux d’oxygène à 1,5 litres par minute et isoflurane à 3,5% et déplacez la souris vers la chambre anesthésique, puis au stade stabilisé de température, après anesthésie. Placez la souris sur son dos avec les bras tendus et adaptez un cône de nez pour l’administration de 2,5% d’isoflurane pendant l’imagerie.

Fermez la porte et prenez des images bioluminescentes et des rayons X de la souris. Lorsque l’imagerie est terminée, retournez la souris dans sa cage et surveillez-la. Il devrait reprendre conscience dans les trois à cinq minutes.

Les suppressions génomiques ciblées ont été confirmées par la colonie PCR avec des amorces spécifiques qui ont amplifié la région d’intérêt. Les colonies dont la suppression génomique donne une bande PCR plus courte que les colonies de type sauvage. L’injection intraperitoneal de la souche atténuée de P aeruginosa, PGN cinq, a eu comme conséquence la mortalité de 0%, équivalente à la mortalité observée avec E.coli BL 21.

L’injection de la souche parente, cependant, était mortelle à 80% des souris. La progression de l’infection a été suivie à l’aide de souches mères marquées par la bioluminescence et atténuées. La souche atténuée est restée localisée au site d’injection jusqu’à ce que la bioluminescence s’estompe, ce qui a probablement coïncidé avec le dégagement de l’infection.

La méthode présentée n’a examiné que la mortalité produite par la souche. Des aspects immunologiques et toxicologiques plus approfondis pourraient être utilisés pour déterminer la dynamique de l’infection et l’effet final de l’infection qui n’entraîne pas la mort. La chose la plus importante dans la procédure est la validation approfondie effectuée, entre les différentes étapes de l’identification initiale à l’expérimentation animale.

L’absent de certaines étapes de validation pourrait potentiellement conduire à un mauvais résultat, car les souches testées peuvent subir une mutation et une sélection, ou être contaminées. Avec le développement de ces deux techniques, nous pensons que cela permettra à nos chercheurs dans le domaine de l’immunologie de l’infection d’étudier plus efficacement comment l’interaction de paquet puissant conduit au phénotype extrême, la septicémie et la mortalité. Différents éléments nutritifs’impact sur les variantes peuvent être comparés par le dosage de taille des bactéries.