Name: Transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia Solanacearum pour l’analyse génétique directe de la maladie bactérienne de wilt (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Apprenez la transformation des racines de tomate et l'inoculation avec Ralstonia solanacearum pour l'analyse génétique du flétrissement bactérien. Cette méthode simplifie l'étude de la pathologie végétale.

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Nous remercions tous les membres du laboratoire Macho pour des discussions utiles, Alvaro Lopez-Garcia pour des conseils statistiques, et Xinyu Jian pour l’assistance technique et administrative pendant ce travail. Nous remercions l’installation de base de biologie cellulaire de la CFP pour son aide à l’imagerie par fluorescence Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (subvention XDB27040204), le Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinois) Académie des sciences) et le programme chinois 1000 Talents.

REMARQUE : Des parties importantes de cette méthode impliquent la manipulation des matériaux végétaux in vitro, et il est donc important de maintenir des conditions stériles pendant toutes ces procédures, y compris la visualisation de la fluorescence DsRed. Pendant tout le processus de transformation, les semis de tomates poussent à 25 à 28 oC et à 16 h/8 h léger/foncé (130 photons demol m-2s-1 lumière). Les plaques sont scellées avec du ruban adhésif micropore afin de faciliter l’échange de gaz et la transpiration.
1. Préparation des plants de tomates et des rhizogenes Agrobacterium
<ol><li>Stériliser les graines de tomates (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) avec 5% (v/v) hypochlorite de sodium pendant 5 min. Laver 4-5 fois avec de l’eau stérile distillée et garder les graines trembler lentement dans l’eau stérile pendant la nuit pour faciliter la germination.</li>
	<li>Transférer les graines de tomate à murashige et Skoog (1/2 MS) moyen sans saccharose (2,21 g/L MS, 8% w/v agar). Maintenir les graines dans l’obscurité à 25 à 28 oC pendant trois jours(figure 1A). REMARQUE : Environ 40 graines sont habituellement nécessaires pour chaque construction.</li>
	<li>Autoclave 8,5 cm2 papiers filtres carrés. Placez les papiers filtres carrés à l’intérieur des boîtes de Petride 9 cm 2 cm 2 carrés contenant un milieu de 1/2 MS (placez le papier sur le dessus de l’agar) et placez six graines de tomates germées dans chaque assiette(figure 1B). Sceller la plaque avec du ruban adhésif micropore et incuber les graines germées à 25 à 28 oC pendant 3 à 4 jours.</li>
	<li>Cultivez Agrobacterium rhizogenes MSU440 en milieu LB solide (avec antibiotiques appropriés) à 28 oC deux jours avant la transformation des plantes. REMARQUE : A. rhizogenes est fourni par le Dr Juan Antonio Lepez Ràez, EEZ-CSIC, Grenade, Espagne. Dans l’expérience décrite dans cet article, A. rhizogenes contenant pK7GWIWG2_II-RedRoot : ::CESA6 ou un vecteur vide, comme contrôle, ont été utilisés. pK7GWIWG2_II-RedRoot contient un gène reporter, DsRed, entraîné par le promoteur Arabidopsis thaliana ubiquitin (pAtUBQ10), et confère une résistance à la spectinomycine (50 g/mL). Il est possible d’utiliser d’autres vecteurs pour la surexpression génétique, tel que rapporté avant5. Dans ce travail, l’amplification du fragment spécifique pour le silence SlCESA6 a été obtenue par transcription inverse (RT) PCR à l’aide d’ARN isolé de la tomate (S. lycopersicum cv. Moneymaker) et ligated en p-ENTR/D-TOPO vector (tableau 1). Par la suite, le fragment SlCESA6-RNAi a été cloné dans le vecteur binaire pK7GWIWG2_II-RedRoot.</li>
</ol>2. Transformation et sélection des plantes
<ol><li>À l’aide d’un scalpel stérile, couper le radicle et le fond de l’hypocotyl des semis de tomates(figure 1C,D).</li>
	<li>RécolteZ la biomasse de rhizogenes de la surface du milieu LB à l’aide de pointes en plastique ou d’une lame de scalpel et trempez soigneusement les semis coupés de tomates dans la biomasse bactérienne(figure 1E).</li>
	<li>Après l’inoculation avec A. rhizogenes, couvrir les semis de tomates avec un papier filtre semi-circulaire de 2 cm x 4 cm(figure 1F), afin de maintenir une humidité élevée et de faciliter la survie et le développement de nouvelles racines.</li>
	<li>Conserver les semis transformés de tomates pendant 6-7 jours. Ensuite, utilisez un scalpel stérile pour couper les nouvelles racines poilues émergentes(figure 1G,H; à cette étape, les racines ne sont pas encore transformées) et permettre aux semis de produire de nouvelles racines poilues.</li>
	<li>Une fois que la deuxième génération de nouvelles racines poilues apparaissent (figure 1I), retirez le papier filtre sur les semis, et scellez la plaque avec du ruban adhésif micropore à nouveau. REMARQUE : À ce stade, la présence du marqueur fluorescent DsRed dans le vecteur de transformation permet de visualiser l’efficacité de transformation dans les nouvelles racines.</li>
	<li>Pour visualiser la fluorescence DsRed, utilisez un stéréomicroscope ou tout autre équipement pour l’imagerie in vivo végétale(figure 1J). Marquez les racines positives (fluorescence rouge) transformées et enlevez les racines négatives non transformées (pas de fluorescence rouge) à l’aide d’un scalpel stérile.</li>
	<li>Transférer les semis montrant la fluorescence rouge dans une nouvelle plaque contenant un milieu de la SP 1/2, afin de faciliter le développement de la racine transformée comme racine principale(figure 1K). Conservez les semis qui ne montrent pas de fluorescence rouge dans la même plaque pour vérifier l’émergence de racines fluorescentes(figure 1L) dans les points de temps ultérieurs.</li>
	<li>Méthode alternative basée sur la sélection des antibiotiques<ol>
<li>Alternative à l’étape 2.5, préparer des plaques carrées demi-remplies de 9 cm2 contenant un milieu de 1/2 MS avec l’antibiotique approprié. Incliner les plaques à environ 5 degrés pendant le processus de préparation pour générer un espace vide sans milieu(figure 2A), permettant aux pousses de croître en évitant tout contact avec l’antibiotique.</li>
		<li>Alternative à l’étape 2.6, après avoir coupé les premières racines poilues non transformées émergé (étape 2.4), transférer les semis sans racines sur les plaques à moitié remplies à l’aide de papiers filtres avec la taille appropriée (figure 2B). REMARQUE : En tant que contrôle positif, il est recommandé de transformer plusieurs semis avec un plasmide contenant la même résistance aux antibiotiques et un gène reporter (dans ce protocole, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycine 50 g/mL).</li>
		<li>Alternative à l’étape 2.7, laissez les semis développer de nouvelles racines poilues et couper les racines qui ne sont pas en contact direct avec la surface des papiers de sandwich filtre, puisque ces racines peuvent éviter la sélection d’antibiotiques. REMARQUE : En raison de l’effet antibiotique, le développement des racines peut être plus lent que dans les plaques sans antibiotiques. De nouvelles racines poilues transformées apparaissent dans les 14 à 18 jours suivant le transfert des semis sans racines dans les assiettes à moitié remplies (étape 2.8.2) (figure 2C-E).</li>
	</ol></li>
	<li>Couvrir les semis d’un papier filtre semi-cercle de 2 cm x 4 cm, sceller la plaque et incuber les semis pour les laisser développer de nouvelles racines poilues. REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’éliminer les rhizogenes A. à l’aide d’antibiotiques. Le papier filtre sur le dessus du milieu de la SP et le manque de saccharose inhibent la propagation des rhizogenes A. sur la plaque5.</li>
	<li>Cinq à sept jours après la première sélection des racines, répétez le processus de sélection pour sélectionner de nouvelles racines transformées et enlever les racines non transformées. Transférer les semis contenant des racines transformées en une nouvelle plaque contenant un milieu de 1/2 MS.</li>
</ol>3. Transfert aux pots d’inoculation
<ol><li>Préparer des pots d’inoculation où la surface des racines sera exposée à l’inoculum bactérien : tremper les pots d’inoculation avec de l’eau, verser tout excès d’eau et les placer dans un plateau de plantation en plastique. Transférer les semis sélectionnés avec des racines transformées en pots d’inoculation à l’aide de pincettes (figure 3A).</li>
	<li>Couvrir le plateau d’une pellicule plastique ou d’un couvercle transparent et de les conserver à 25 à 28 oC et à 65 % d’humidité (16 h/8 h de lumière/obscurité; 130 photons demol m-2s-1 lumière), pour maintenir un niveau élevé d’humidité Figure 3B). Retirer le couvercle après cinq ou six jours. REMARQUE : Les plants de tomates transformés sont prêts pour l’inoculation deux à trois semaines après leur transfert dans le sol(figure 3C). Pendant la croissance sur le sol, les plants de tomates peuvent produire de nouvelles racines qui ne sont pas transformées. Pour déterminer l’étendue de ce phénomène, la fluorescence rouge a été visualisée dans les racines des plants transformés de tomate de 3 semaines. La plupart des racines (80%-100%) a montré la fluorescence rouge, indiquant qu’ils sont effectivement transformés (figure 3D,E).</li>
</ol>4. Inoculation d’arrosage des sols
<ol><li>Cultivez R. solancearum (souche GMI1000 dans ce protocole) en milieu liquide phi(tableau 211) dans un shaker orbital (200 tr/min) à 28 oC jusqu’à la phase stationnaire.</li>
	<li>Déterminer les nombres bactériens en mesurant la densité optique de la culture bactérienne à 600 nm (OD600). Diluer la culture bactérienne avec de l’eau à un OD600 de 0,1 (dans des conditions utilisées ici, cela correspond à environ10 8 unités de formation de colonies [CFU]/mL).</li>
	<li>Placer les pots d’inoculation 16-20 contenant des plants de tomates transformés dans un plateau d’inoculation (29 cm x 20 cm; Figure 4A).</li>
	<li>Verser 300 ml (15 ml par plante) d’inoculum bactérien(OD 600 de 0,1) dans le plateau contenant les pots d’inoculation. Laissez-les tremper dans l’inoculum pendant 20 min (figure 4B).</li>
	<li>Préparer un nouveau plateau avec une couche de terreau. Déplacez les pots inoculés dans le nouveau plateau(figure 4C) et placez les plateaux dans une chambre de croissance avec 75% d’humidité, 26 à 28 oC, et un photoperiod de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité (130 photons demol m-2s-1 lumière).</li>
</ol>5. Détermination des paramètres d’infection et analyse statistique
<ol><li>12 ,13,13en utilisant une échelle allant de 0 (pas de symptômes) à 4 (flétrissement complet)(figure 4D-H), chaque jour après l’inoculation de Ralstonia pendant deux semaines. REMARQUE : Les données de l’indice de la maladie sont recueillies à partir de la même unité expérimentale (chaque plante) au fil du temps.</li>
</ol>6. Analyse de l’expression génique
REMARQUE : L’expression du transgène ou le silence du gène cible peut être déterminée par RT-PCR ou par RT-PCR quantitatif (qRT-PCR).
<ol><li>Recueillir des échantillons et extraire l’ARN d’une partie représentative du système racinaire transformé (pour évaluer l’effet sur le gène cible) et les feuilles (comme contrôle interne).</li>
	<li>Synthèse cDNA à l’aide de 1 g d’ARN traité par DNase.</li>
	<li>Analyser l’expression génique des gènes cibles par qRT-PCR. Calculez les niveaux de transcription relatifs à l’aide de la méthode 2-CT 14, en utilisant SlEF-1 comme gène d’entretienménager 15. REMARQUE : Les séquences d’introduction sont répertoriées dans le tableau 1.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
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<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
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<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ralstonia solanacearum représente une menace importante pour l’agriculture; cependant, son interaction avec les hôtes naturels d’importance agricole est encore mal comprise par rapport à d’autres agents pathogènes bactériens, en particulier chez les espèces végétales. Dans la plupart des cas, l’analyse génétique est entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour modifier génétiquement les plantes hôtes. Pour résoudre ce problème et faciliter l’analyse génétique de l’infection à R. solanacearum d...

Ralstonia solanacearum, l’agent causal de la maladie bactérienne de flétrissement, est un agent pathogène vasculaire dévastateur transmis par le sol avec une distribution mondiale qui peut infecter une grande gamme d’espèces végétales, y compris la pomme de terre, la tomate, le tabac, la banane, le poivre et l’aubergine, entre autres1,2. Les pertes de rendement causées par Ralstonia peuvent atteindre 80-90% de la production de tomates, de pommes de terre ou de bananes, selon le cultivar, le climat, le sol et d’autres facteurs3. Cependant, le modèle Ralstonia est considérablement sous-exploré par rapport à d’autres modèles impliquant des pathogènes végétaux bactériens, tels que pseudomonas syringae ou Xanthomonas spp. En outre, la plupart des études sur les interactions plantes-microbe sont axées sur la plante modèle Arabidopsis thaliana. Bien que la recherche utilisant ces modèles ait largement contribué à notre compréhension des interactions plante-bactérie, elles ne répondent pas à la nécessité actuelle de comprendre ces interactions dans les plantes cultivées. La recherche visant à comprendre l’interaction entre Ralstonia et les plantes cultivées est essentielle pour développer des solutions durables pour lutter contre la flétrie bactérienne, mais elle est actuellement entravée par l’absence d’essais expérimentaux simples pour caractériser les différentes composantes de l’interaction. En particulier, la tomate, un hôte naturel pour Ralstonia, est la deuxième culture végétale la plus importante dans le monde et est affectée par une pléthore de maladies4, y compris la maladie bactérienne de flétrissement. Dans ce travail, nous avons développé une méthode facile pour effectuer l’analyse génétique de l’infection de Ralstonia de la tomate. Cette méthode est basée sur Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée des racines de tomate, en utilisant la fluorescence DsRed comme marqueur de sélection5, suivie par l’inoculation du sol Ralstonia des plantes résultantes, contenant des racines transformées exprimant la construction de l’intérêt. La polyvalence de l’essai de transformation des racines permet d’effectuer soit la surexpression génétique ou le silençage génétique médié par les ARNi.
Une limitation potentielle de cette méthode consiste en la croissance résiduelle des racines non transformées. Ceci est particulièrement important dans les cas où le plasmide utilisé n’a pas de gène reporter qui permet la sélection des racines transformées. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode alternative basée sur la sélection des antibiotiques, qui inhibe la croissance de racines non transformées tout en permettant la croissance de racines transformées résistantes aux antibiotiques saines. Étant donné que A. rhizogenes n’induit pas la transformation des pousses, ils sont sensibles à l’antibiotique, et, par conséquent, ils doivent être tenus séparés du milieu antibiotique contenant.
Bien que la résistance des plantes contre Ralstonia ne soit pas bien comprise, plusieurs rapports ont associé des altérations de la paroi cellulaire à une résistance accrue au flétrissement bactérien6,7,8,9. Il a été suggéré que ces altérations de mur cellulaire affectent le développement vasculaire, un aspect essentiel pour le mode de vie de Ralstonia à l’intérieur de la plante10. Les mutations dans les gènes codant les synthases de cellulose CESA4, CESA7 et CESA8 dans Arabidopsis thaliana ont été montrés pour altérer l’intégrité secondaire de mur de cellules, causant une résistance accrue à Ralstonia, qui semble être liée à la signalisation ABA8. Par conséquent, comme une preuve de concept pour notre méthode, nous avons effectué le silençage génétique RNAi-négocié de SlCESA6 (Solyc02g072240), une synthase de cellulose cellule-mur secondaire secondaire, et orthologue de AtCESA8 (At4g18780). L’inoculation subséquente de sol-drenching avec Ralstonia a prouvé que le silence SlCESA6 a augmenté la résistance aux symptômes bactériens de flétrissement, suggérant que la résistance mur-négociée de cellules à Ralstonia est probablement conservée dans la tomate, et validant notre méthode pour effectuer l’analyse génétique de la résistance bactérienne de flétrie dans les racines de tomate. Ici, nous décrivons cette méthode en détail, permettant aux approches génétiques de comprendre la maladie bactérienne de flétrissement dans un temps relativement court et avec de petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td></td><td></td><td></td>carrées de 90 mm</tr><tr><td>Poudre</td><td>d’agar Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD (Becton et Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td><td></td>filtre</tr><tr><td>Système d’imagerie végétale In Vivo NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pots Jiffy</td><td>Jiffy Products International A.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ruban microporeux</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige et Skoog medium (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat Pindstrup</td><td>Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel et lame</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banc</td><td></td><td></td><td></td> propre stérile</tr><tr><td>Pince à épiler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahtman paper</td><td>Wahtman International Ltd. Extrait de levure Maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec ralstonia solanacearum pour l’analyse génétique directe de la maladie bactérienne de wilt

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum est un agent pathogène vasculaire dévastateur transmis par le sol qui peut infecter un large éventail d’espèces végétales, ce qui constitue une menace importante pour l’agriculture. Cependant, le modèle Ralstonia est considérablement sous-exploré par rapport à d’autres modèles impliquant des pathogènes végétaux bactériens, tels que les seringues Pseudomonas dans Arabidopsis. La recherche visant à comprendre l’interaction entre Ralstonia et les plantes cultivées est essentielle pour développer des solutions durables pour lutter contre la flétrie bactérienne, mais elle est actuellement entravée par l’absence d’essais expérimentaux simples pour caractériser les différentes composantes de l’interaction dans les plantes hôtes indigènes. Dans ce scénario, nous avons développé une méthode pour effectuer l’analyse génétique de l’infection Ralstonia de la tomate, un hôte naturel de Ralstonia. Cette méthode est basée sur Agrobacterium rhizogenes- transformation médiatisée des racines de tomate, suivie par l’inoculation du sol Ralstonia des plantes résultantes, contenant des racines transformées exprimant la construction de l’intérêt. La polyvalence de l’essai de transformation des racines permet d’effectuer soit la surexpression génétique ou le silençage génétique médié par les ARNi. Comme preuve de concept, nous avons utilisé cette méthode pour montrer que le silence par médiation RNAi de SlCESA6 dans les racines de tomate confère une résistance à Ralstonia. Ici, nous décrivons cette méthode en détail, permettant aux approches génétiques de comprendre la maladie bactérienne de flétrissement dans un temps relativement court et avec de petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes.

La figure 5 montre le développement des symptômes de la maladie des plants de tomates avec des racines transformées avec un vecteur vide (EV), et les plantes avec des racines transformées avec une construction d’ARNi ciblant SlCESA6 (Solyc02g072240). Les données de l’indice de la maladie(figure 5A) sont recueillies à partir de la même unité expérimentale (chaque plante) au fil du temps selon une...

Ici, nous présentons une méthode polyvalente pour la transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia solanacearum pour effectuer l’analyse génétique simple pour l’étude de la maladie bactérienne de flétrir.

Transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia Solanacearum pour l’analyse génétique directe de la maladie bactérienne de wilt

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet aux scientifiques d’effectuer une analyse génétique simple de la maladie bactérienne du flétrissement dans la tomate. Le principal avantage de cette technique est que la manipulation de l’expression des gènes et des analyses subséquentes peut être effectuée en peu de temps et avec les petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes. Il s’agit d’une méthode très polyvalente, et elle peut être appliquée à d’autres plantes cultivées pour effectuer à la fois l’inoculation des pathogènes et d’autres analyses physiologiques.Pour maintenir la stérilité lors de la manipulation des semis in vitro, il est important de garder les plaques fermées lorsqu’elles sont à l’extérieur du capot d’écoulement. Il s’agit d’une technique facile, mais il nécessite plusieurs étapes pour la manipulation. La visualisation de cette méthode aidera à voir de petits trucs qui sont difficiles à expliquer dans le manuscrit, aidant d’autres chercheurs à mettre en œuvre la méthode dans leurs laboratoires.Achen Zhao, étudiante diplômée, aidera à démontrer cette procédure. Après stérilisation et lavage des graines de tomate, les transférer à mi-force Murashige et Skoog moyen sans saccharose. Gardez les graines dans l’obscurité à une température comprise entre 25 et 28 degrés Celsius pendant trois jours.Placez des filtres autoclavés de 8,5 centimètres carrés à l’intérieur de boîtes Petri de neuf centimètres carrés contenant du murashige mi-résistance et du milieu Skoog, et placez six graines de tomates germées dans chaque assiette. Sceller l’assiette avec du ruban micropore et incuber les graines germées à 25 à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Cultivez l’Agrobacterium rhizogenes MSU440 dans un milieu LB solide avec des antibiotiques appropriés pendant deux jours à 28 degrés Celsius avant la transformation des plantes.À l’aide d’un scalpel stérile, couper le radicle et le fond de l’hypocotyle des semis de tomates. Utilisez des pointes en plastique ou une lame de scalpel pour récolter la biomasse A.rhizogenes à la surface du milieu LB, et trempez soigneusement les semis de tomates coupées dans la biomasse bactérienne. Après cela, couvrir les semis de tomates avec un papier filtre semi-circulaire de deux centimètres par quatre centimètres afin de maintenir une humidité élevée et de faciliter la survie et le développement de nouvelles racines.Il est important de maintenir les semis dans une humidité élevée dans un environnement qui permet la transpiration. Pour ce faire, couvrir les semis de papier filtre et fermer la plaque avec du ruban Micropore. Conserver les semis de tomates transformés de six à sept jours dans une chambre de croissance à une température comprise entre 25 et 28 degrés Celsius.Ensuite, utilisez un scalpel stérile pour couper les nouvelles racines poilues émergentes, et permettre aux semis de produire de nouvelles racines poilues. Une fois que la deuxième génération de nouvelles racines poilues apparaît, retirez le papier filtre sur les semis et scellez à nouveau la plaque avec du ruban Micropore. Pour visualiser la fluorescence DsRed ou tout autre équipement pour l’imagerie in vivo végétale, marquez les racines transformées positives, qui peuvent être identifiées par la fluorescence rouge.Utilisez un scalpel pour éliminer les racines négatives non transformées, qui peuvent être identifiées par leur manque de fluorescence rouge. Transférer les semis qui présentent la fluorescence rouge dans une nouvelle plaque contenant des mi-résistances murashige et skoog moyen afin de faciliter le développement de la racine transformée comme racine principale. Gardez les semis qui ne montrent pas la fluorescence rouge dans la même plaque pour vérifier l’émergence des racines fluorescentes dans les points de temps ultérieurs.Couvrir les semis d’un papier filtre semi-cercle de deux centimètres par quatre centimètres, sceller l’assiette et incuber les semis pour les laisser développer de nouvelles racines poilues. Préparer les pots d’inoculation où la surface des racines sera exposée à l’inoculum bactérien en trempant d’abord les pots d’inoculation avec de l’eau, en versant tout excès d’eau, puis en les plaçant dans un bac de plantation en plastique. À l’aide d’une pince à épiler, transférer les semis sélectionnés avec des racines transformées dans les pots d’inoculation.Couvrez le plateau d’une pellicule plastique ou d’un couvercle transparent, et gardez-les à 25 à 28 degrés Celsius avec 65% d’humidité. Retirer le couvercle après cinq ou six jours. Cultivez Ralstonia en cinq LB liquide moyen dans un shaker orbital à 28 degrés Celsius, avec secousses à 200 rpm, jusqu’à la phase stationnaire.Mesurez la densité optique à 600 nanomètres pour déterminer les nombres bactériens. Diluer la culture bactérienne avec de l’eau à un OD600 de 1. Placer 16 à 20 pots d’inoculation contenant des plants de tomates transformés en plateau d’inoculation.Verser ensuite 300 millilitres d’inoculum bactérien dilué dans le plateau et laisser tremper les plantes dans l’inoculum pendant 20 minutes. Après cela, préparer un nouveau plateau avec une couche de terre mise en pot. Déplacez les pots inoculés dans le nouveau plateau, et placez les plateaux dans une chambre de croissance avec 75% d’humidité, une température comprise entre 26 et 28 degrés Celsius, et une photopériod de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité.Ici, les racines de tomates sont transformées et inoculées avec Ralstonia pour effectuer une analyse génétique simple pour l’étude de la maladie bactérienne du flétrissement. Le développement des symptômes de la maladie est suivi dans les plants de tomates dont les racines sont transformées avec un vecteur vide et ceux transformés avec une construction rai ciblant la tomate CESA6. Les données de l’indice de la maladie sont recueillies à partir de la même unité expérimentale au fil du temps selon une échelle arbitraire de zéro à quatre et ne suivent pas une distribution gaussienne, excluant l’utilisation de tests standard pour les données paramétriques.Comme approche standard, un test non paramétrique à deux queues U Mann-Whitney pour comparer les courbes de contrôle et d’infection est utilisé. Selon cette analyse, la différence entre les médianes des deux courbes semble non significative. Il est également possible de quantifier la zone sous la courbe de progression de la maladie, ce qui permet de combiner de multiples observations du progrès de la maladie en une seule valeur.La zone sous la courbe de progression de la maladie montre une valeur plus élevée pour les plantes de contrôle par rapport aux plants de tomates CESA6 RNAi à la fin du processus d’infection, ce qui indique que les plantes tomate cesa6-réduits au silence sont plus résistants à l’infection ralstonia que les plantes de contrôle. Les intervalles de confiance offrent un moyen d’estimer, avec une forte probabilité, une gamme de valeurs dans lesquelles la valeur de la population d’une variable donnée se trouve. Comme on le voit ici, la zone de l’intervalle de confiance de 95 % pour les courbes de contrôle et d’infection estime un risque plus élevé de résistance lorsque le CESA6 est réduit au silence.Les valeurs de l’indice de la maladie peuvent être transformées en données binaires, compte tenu d’un indice de la maladie inférieur à deux correspondant à zéro et d’un indice de maladie égal ou supérieur à deux correspondant à un. Cela permet la représentation d’une courbe de survie après l’inoculation de Ralstonia. Les différences dans le taux de survie entre le contrôle et les plantes infectées ne sont pas statistiquement significatives selon le test statistique de Gehan-Breslow-Wilcoxon.L’expression de CESA6 est ensuite analysée dans deux racines transformées choisies au hasard avant l’étape d’inoculation, montrant que la résistance accrue à Ralstonia est corrélée avec l’expression réduite de CESA6. Après deux tours de sélection, un taux de transformation de 35 à 40% peut être obtenu, et cette valeur peut être augmentée en effectuant des tours de sélection supplémentaires. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de garder les semis couverts d’un morceau de papier filtre pour maintenir une humidité élevée et sceller les plaques avec Micropore pour assurer l’échange de gaz.Après la transformation des racines, de nombreux traitements peuvent être appliqués pour étudier la réponse des plantes en observation de la physiologie des racines ou en utilisant la biologie moléculaire, la biologie cellulaire ou la biochimie. Principalement, cette technique permettra aux chercheurs aux ressources limitées d’effectuer une analyse génétique de l’infection bactérienne dans les racines des tomates.

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

Source : Hassan, J. A., et al. Identification à haut débit de la résistance à Pseudomonas syringae pv. Tomate dans la tomate à l’aide d’un test d’inondation de semis. J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo fait la démonstration d’une méthode de dépistage de la résistance bactérienne dans différentes souches de tomates à l’aide de semis âgés de dix jours inoculés avec une suspension bactérienne. Il explique comment les bactéries envahissent les stomates, délivrent des protéines effectrices pour...

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Source : Matthysse, A. G. Adhérence des bactéries aux surfaces végétales mesurée en laboratoire. J. Vis. Exp., (2018)Cette vidéo illustre un protocole pour mesurer la colonisation racinaire des semis de tomates par des bactéries pathogènes sauvages et déficientes en cellulose. Les décomptes viables de bactéries fortement adhérentes montrent une meilleure adhésion et formation de microcolonies par la souche sauvage, soulignant le rôle de la cellulose dans la colonisation racinaire stable.

Évaluation de la colonisation des racines de semis de tomates par une bactérie pathogène à l’aide de comptages cellulaires viables

Utilisation de l'assemblage de l'ADN, de multiples vecteurs de CRISPR peuvent être construits en parallèle dans une réaction de clonage unique, ce qui rend la construction d'un grand nombre de vecteurs CRISPR une tâche simple. Tomate racines chevelues sont un excellent modèle pour valider des vecteurs CRISPR et de générer des matériaux mutantes.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.

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Nous présentons ici deux protocoles pour transformer les plantes de pomme de terre. La transformation par Agrobacterium tumefaciens mène à une plante transgénique complète tandis que l' Agrobacterium rhizogenes produit transgéniques racines velues lors d’un shooting de type sauvage pouvant être autonome propagés. Ensuite, nous détectons activité du promoteur par GUS coloration dans les racines transformées.

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Apprenez la transformation des racines de tomate et l'inoculation avec Ralstonia solanacearum pour l'analyse génétique du flétrissement bactérien. Cette méthode simplifie l'étude de la pathologie végétale.

Transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia Solanacearum pour l’analyse génétique directe de la maladie bactérienne de wilt (Vidéo) | JoVE Journal

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