Fibroblast-Dérivé 3D Matrix System Applicable à Endothelial Tube Formation D'Assay
26 décembre 2019
Le but de cette méthode est d'obtenir des matrices 3D dérivées du fibroblaste comme échafaudage naturel pour les essais cellulaires ultérieurs. Les fibroblastes sont enseventdanss dans une plaque de culture prétraitée et stimulés avec de l'acide ascorbique pour la génération de matrices. Les matrices sont décellularisées et bloquées aux cellules pertinentes à la culture (p. ex., les cellules endothéliales).
Ce protocole permet de voir différents types de cultures et d’observer leurs interactions avec la matrice extracellulaire. Le principal avantage de cette méthode est que la matrice que vous obtenez est régénérée par fibroblaste et il sera assez similaire à ceux générés in vivo. Nous croyons que cette maladie n’est pas pertinente lors de l’utilisation de fibroblaste obtenir des plats de cuisson.
L’établissement d’une matrice à partir de ces cellules pourrait nous éclairer sur la façon dont elle peut entraîner, par exemple, une situation persistante. Ces méthodes peuvent également être appliquées, par exemple, aux études physiques aux survivants des bienséances matricielles. Visualisation de ce protocole, il est important d’observer une technique de pipetage des étapes que vous avez à régent.
Lorsque vous essayez ces méthodes pour la première fois, il faudra probablement plus de temps que prévu. Notre conseil est de préparer autant que vous le pouvez à l’avance et d’utiliser les périodes de durée pour se préparer pour les prochaines étapes. Commencez par préparer 0,2% de gélatine, 1% de glutaraldehyde et une solution d’éthanolamine molaire selon les directives manuscrites.
S’assurer d’exécuter chaque solution à travers un filtre de 0,22 micromètre avant utilisation. Ensuite, préparez l’acide ascorbique et le tampon de lyse. Diluer le stylo-strep PBS tel que décrit dans le manuscrit et préparer DMEM avec 10%FBS.
Préparer 2%BSA dénaturé par la chaleur en ajoutant 2 grammes de BSA à 100 millilitres d’eau stérile et en la réchauffant dans un bain d’eau bouillante pendant sept minutes. Puis, compléter FBS avec de la pénicilline, streptomycine, gentamicine, et amphotericine B.Culture télomères recombinants transfecté immortalisé fibroblastes de prépuce humaine et DMEM avec 10%FBS et les a maintenus à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone. Pour établir la culture primaire de fibroblaste, coupez les échantillons de tissu en petits morceaux d’environ deux à trois millilitres en cubes et ensemencez-les dans fps avec une forte concentration d’antibiotiques.
Lorsque les premiers fibroblastes apparaissent, remplacez le milieu par un milieu FBM pour l’entretien cellulaire. Ajouter deux millilitres de solution gélatineuse de 0,2 % à chaque puits d’une plaque de six puits et l’incuber pendant une heure pendant 37 degrés Celsius ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, aspirer la gélatine et bien laver avec deux millilitres de PBS.
Ajouter deux millilitres de 1% de glutaraldehyde à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant trente minutes, ce qui reliera la gélatine. Aspirer le glutaraldehyde et laver les puits en deux millilitres de PBS pendant cinq minutes. Pour bloquer le reste du glutaraldehyde, ajouter deux millilitres d’une éthanolamine molaire et incuber la plaque à température ambiante pendant trente minutes.
Aspirer l’éthanolamine et répéter les lavages avec PBS. Ajouter un millilitre de DMEM avec 10% fps. Si le milieu devient immédiatement rose, retirez-le, lavez les puits une fois avec deux millilitres de PBS et ajoutez un millilitre de DMEM.
Graine un millilitre de suspension fibroblaste avec 5 x 10 à la cinquième cellule dans chaque puits et la culture des cellules jusqu’à ce que 100% confluence est atteint. Retirez ensuite le milieu et remplacez-le par du DMEM avec 10 % de FBS et 50 microgrammes par acide ascorbique millilitre. Remplacer le milieu tous les deux jours pendant six jours.
Deux jours après le dernier traitement à l’acide ascorbique enlever le milieu et laver les puits avec deux millilitres de PBS. Après les lavages, ajouter lentement un millilitre de tampon de lyse préchauffé et incuber la plaque à température ambiante pendant cinq à dix minutes jusqu’à ce que les fibroblastes soient lysés. Sans enlever le tampon de lyse, ajouter soigneusement deux millilitres de PBS à chaque puits, puis aspirer environ 2,5 millilitres.
Répétez ce processus deux fois pour un total de trois lavages. Après le lavage final, ajouter deux millilitres de PBS avec pen-strep. Sceller la plaque avec du film et la garder à quatre degrés Celsius jusqu’à trois mois.
Cultivez les cellules HUVEC et EMB-2 avec 2%FBS jusqu’à la confluence maximale. Ensuite, remplacez le milieu par EBM-2 sans FBS pendant huit heures. Pour préparer les matrices pour l’ensemencement cellulaire, retirez-les du réfrigérateur et laissez-les à température ambiante pendant une heure.
Bloquer les matrices en y ajouter deux millilitres de 2%BSA dénaturés par la chaleur et les incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, aspirez le BSA et lavez-les avec deux millilitres de PBS. Graine 2 x 10 à la cinquième cellule HUVEC à chaque puits de la plaque recouverte de matrices dérivées du fibroblaste.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, puis examiner les structures en forme de tube sous un microscope standard à champ lumineux à 20-40x grossissement. Ce protocole a été employé pour examiner les effets du traitement de PDGF sur la formation fibroblaste-dérivée de matrice. Les troisièmes fibroblastes de BGH qui ont été incubés avec PDGF ont montré une distribution cellulaire plus alignée dans les matrices que ceux incubés sans PDGF.
L’expression de protéine de collagène 1 et de fibronectin a été augmentée dans les matrices dérivées des fibroblastes PDGF-stimulés et par conséquent l’épaisseur de matrice a été augmentée. En outre, les histogrammes de directionnalité démontrent que le collagène 1 et la fibronectine montrent des modèles parallèles. Lorsque les cellules HUVEC ont été ensemencées sur des matrices décellularisées dérivées de fibroblastes stimulés par la PDGF, elles ont développé des structures plus capillaires que dans aucune condition stimulée.
Confirmant que les matrices dérivées des fibroblastes stimulés par PDGF-BB favorisent l’activation des cellules endothéliales. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de préparer des solutions à l’avance et de s’assurer que les cellules sont prêtes avant de commencer. Outre les études des cellules endothéliales matrices peuvent également être ensemencés avec des cellules épithéliales et la réaction à des facteurs externes comme l’état dans les médias ou les médicaments cytotoxiques peuvent être observés.
La génération de matrice extracellulaire est cruciale dans la conception des expériences de macroenvironnement de tumeur.
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Aperçu
Ce protocole permet l'observation de diverses cultures cellulaires et de leurs interactions avec les matrices extracellulaires. Les matrices dérivées des fibroblastes ressemblent étroitement à celles présentes in vivo, offrant un support pertinent pour les tests cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Culture cellulaire
- Recherche sur la matrice extracellulaire
- Biologie des fibroblastes
Contexte
- Les fibroblastes sont des cellules clés dans la formation des matrices extracellulaires.
- La compréhension des interactions entre les cellules et la matrice est essentielle pour diverses études biologiques.
- Les matrices régénérées peuvent fournir des informations sur les conditions physiologiques et pathologiques.
- Cette méthode permet la visualisation des techniques de pipetage indispensables au protocole.
Objectif de l'étude
- Créer un support naturel pour les tests cellulaires à l’aide de matrices dérivées de fibroblastes.
- Étudier les effets de ces matrices sur différents types cellulaires.
- Approfondir la compréhension des affections persistantes grâce à l’analyse des matrices.
Méthodes utilisées
- Les fibroblastes sont ensemencés dans des plaques de culture prétraitées.
- L'acide ascorbique est utilisé pour stimuler la production de matrice.
- La décellularisation des matrices est réalisée afin de préparer la culture cellulaire.
- Des cellules pertinentes, telles que les cellules endothéliales, sont cultivées sur les matrices.
Résultats principaux
- Les matrices générées sont similaires à celles observées in vivo.
- Les interactions cellulaires avec les matrices peuvent être efficacement observées.
- La méthode offre une approche fiable pour étudier le comportement cellulaire dans un environnement pertinent.
- Les techniques de visualisation améliorent la compréhension de l'exécution du protocole.
Conclusions
- Les matrices dérivées des fibroblastes servent de supports efficaces pour les essais cellulaires.
- Cette méthode peut être appliquée à diverses études biologiques, notamment à l'analyse physique des propriétés de la matrice.
- Comprendre les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire est essentiel pour faire progresser la recherche en biologie cellulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette méthode fournit un modèle physiologiquement pertinent de matrice extracellulaire tridimensionnelle dérivé de fibroblastes, permettant une évaluation plus prédictive des phénotypes angiogéniques et tumorigéniques en recherche fondamentale. En imitant la composition et la structure de la matrice in vivo, elle soutient la validation de cibles thérapeutiques et la réduction des risques mécanistiques dans les programmes de développement de médicaments axés sur l'oncologie et l'angiogenèse. Le système améliore la continuité translationnelle en permettant l'étude des comportements cellulaires médiés par la matrice dans des conditions contrôlées et reproductibles.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les effets du remodelage matriciel médié par les fibroblastes sur la formation de tubes endothéliaux, un indicateur fonctionnel du potentiel angiogénique.
- Valeur opérationnelle : Permet de tester l'hypothèse selon laquelle des facteurs pro-angiogéniques comme le PDGF-BB influencent la composition de la matrice et les réponses endothéliales en aval.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des matrices décellularisées standardisées avec un dépôt quantifiable de collagène et de fibronectine, permettant un ensemencement reproductible de cellules endothéliales.
- Valeur opérationnelle : Permet la préparation reproductible de supports bioactifs pour l'imagerie à haut contenu de structures en forme de tube en microscopie champ clair.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Modélise les altérations du matrice extracellulaire induites par les fibroblastes associés au cancer (CAF) qui favorisent l'angiogenèse associée à la tumeur.
- Valeur opérationnelle : Permet l'évaluation des effets des médicaments dépendants de la matrice sur la morphogenèse des cellules endothéliales dans un système pertinent pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test de matrice dérivée des fibroblastes s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'au criblage phénotypique, établissant un lien entre les succès moléculaires et la réponse fonctionnelle angiogénique avant l'engagement préclinique.
- Biologie de la découverte : Étudie comment les états d'activation des fibroblastes modulent l'architecture de la matrice extracellulaire afin d'influencer le comportement des cellules endothéliales.
- Criblage : Fournit des lectures quantitatives fondées sur l'imagerie de la formation de tubes pour comparer les conditions matricielles entre différents groupes expérimentaux.
- Analytique : Permet une analyse par histogramme de la directionnalité de l'alignement du collagène et de la fibronectine afin d'évaluer les phénotypes de remodelage matriciel.
- Recherche translationnelle : Relie les propriétés matricielles dérivées des fibroblastes aux voies de signalisation angiogénique pertinentes pour la modélisation du microenvironnement tumoral.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour évaluer des composés pro- ou anti-angiogéniques dans un test contextualisé sur le plan physiologique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles angiogéniques en utilisant une matrice qui ressemble étroitement à la composition et à la structure de la MEC in vivo.
- Valeur opérationnelle : Offre une méthode normalisée et évolutible pour générer des matrices tridimensionnelles bioactives, applicable à plusieurs types cellulaires et conditions expérimentales.
- Valeur stratégique : Réduit les faux positifs biologiques dans le criblage de l'angiogenèse en intégrant dès le début de la cascade de découverte les effets matriciels médiés par le stroma.
- Impact sur le portefeuille : Guide la priorisation ajustée au risque des modulateurs angiogéniques en fonction de leurs effets sur les matrices remodelées par les fibroblastes et les réponses endothéliales ultérieures.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de fibroblastes primaires, en biochimie de la matrice extracellulaire et en techniques de décellularisation.
- Dépend d'une stimulation contrôlée par l'acide ascorbique, d'un réticulage au glutaraldéhyde et d'une inhibition par l'éthanolamine pour la stabilisation de la matrice.
- Exige un blocage standardisé à l'aide de BSA dénaturée par la chaleur et des protocoles de semis cellulaires reproductibles pour des essais de formation de tubes endothéliaux fiables.
- Implique l'optimisation de la densité cellulaire et des durées d'incubation pour les HUVEC ou d'autres types cellulaires endothéliaux afin d'obtenir des phénotypes angiogéniques quantifiables.
- Est limité par le processus long de génération de la matrice (plus de 6 jours de traitement à l'acide ascorbique) et par la nécessité d'utiliser des réactifs stériles et filtrés afin d'éviter toute contamination.
