Name: Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez un protocole avancé d'imagerie bioluminescente et de marquage GFP pour détecter les micrométastases dans un modèle orthotopique de cancer du sein. Cette méthode améliore l'évaluation de l'efficacité thérapeutique.

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Les auteurs aimeraient souligner le soutien du Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, de l’Institut national du cancer, de Bethesda MD, du Cancer and Inflammation Program et du Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, États-Unis.

L’analyse de la croissance tumorale a été effectuée à l’aide de protocoles approuvés par le Comité pour l’éthique des expériences animales du National Cancer Institute et a adhéré aux recommandations du « Guide for the Care and Use of of » du National Research Council des États-Unis Les animaux de laboratoire des États-Unis, le « Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire » du Service de santé publique des États-Unis et la « Politique sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire ».
1. Préparation des cellules pour l’implantation
REMARQUE : Les cellules humaines d’adénocarcinome de sein MDA-MB-231 (acquises commercialement) ont été transsagères de façon stable avec le gène de luciferase III et le marqueur amélioré de protéine fluorescente verte (GFP) par lentivirus et cultivé en présence de l’antibiotique de sélection (puromycine) .
<ol><li>Commencez la culture cellulaire avec 1 x 106 cellules MDA-MB-231-Luc/GFP et ajoutez 15 ml de RPMI 1640 pré-imminable (37 oC) moyen avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans un flacon de culture T75. Maintenir la croissance des cellules dans un incubateur de culture cellulaire à température contrôlée à 37 oC avec 5% de CO2. Remplacer le support complet au moins 2x par semaine. REMARQUE : Ne perturbez pas la croissance de la cellule et continuez à vérifier les conditions de croissance cellulaire quotidiennement. Les cellules doivent être sous-cultivées lorsqu’elles atteignent une confluence de 85 % à 90 % pour maintenir la phase de prolifération.</li>
	<li>Une semaine avant l’étape d’implantation cellulaire, retirer la puromycine du flacon de culture cellulaire en enlevant d’abord tout le milieu dans le flacon de culture, puis en rinçant 2x avec 10 ml de saline tampon de phosphate de 1x (PBS), et enfin en remplaçant le milieu par le milieu complet sans la puromycine. Pendant les étapes d’ajout et de rinçage, ne dérangez pas les cellules. N’oubliez pas de ne pas utiliser le support complet avec les antibiotiques de sélection à partir de maintenant pour toutes les étapes de réapprovisionnement moyen.</li>
	<li>Le jour de la préparation des cellules à l’implantation, retirez tout le milieu complet avant la trypsinisation pour éviter de désactiver la trypsine. Ajouter 5 ml de trypsine au flacon pour trypsiniser les cellules. Surveillez les cellules et vérifiez qu’elles se détachent du flacon de culture.</li>
	<li>Une fois que la majorité des cellules se détachent, ajouter 10 ml de milieu complet pour neutraliser l’activité de trypsine. Ensuite, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 50 ml et une centrifugeuse à 150 x g pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant après la centrifugation, puis ajoutez 10 ml de PBS 1x pour réanimer les cellules et se préparer au comptage cellulaire.</li>
	<li>Comptez les cellules avec un compteur cellulaire et ajustez la concentration cellulaire à 20 x 106 cellules/mL dans le PBS froid 1x contenant 25% de matrice de membrane de sous-sol. Injecter 2 x 106 cellules dans 0,1 mL 1x PBS avec 25% de matrice de membrane de sous-sol dans le quatrième coussin de graisse mammaire de chaque souris. Apportez des aiguilles et des seringues supplémentaires pour l’implantation cellulaire et conservez le mélange de matrice cellule-sous-sol sur la glace avant l’implantation. REMARQUE : Il y a de l’espace mort dans la seringue et l’aiguille. Selon le choix de la longueur, du type et de la taille de l’aiguille et de la seringue, une seringue tubrique avec une aiguille de 0,5 g sur 26 G peut avoir jusqu’à 70 l’espace mort10. Préparer 40 % à 50 % plus de mélange d’implantation cellulaire pour compenser l’espace mort et toute autre perte accidentelle.</li>
</ol>2. Modèle orthotopique de cancer du sein et mesure de la taille de tumeur
<ol><li>Permettre aux souris nues athymiques femelles de 6 semaines de s’acclimater à l’établissement d’habitation pendant au moins 1 semaine avant l’implantation cellulaire. REMARQUE : L’utilisation de souris du même âge réduira la variation des données.</li>
	<li>Pour chaque tour, anesthésiez cinq souris avec isoflurane à 4 % avec de l’air filtré (0,2 m) à un débit de 1 L/min pendant 3 à 4 min. Faites attention au taux respiratoire de la souris et au changement de modèle, et utilisez une pincée d’oeil pour s’assurer que les souris sont sous anesthésie appropriée. Une fois qu’ils ne bougent plus, retirer une souris et placer un cône de nez sur son nez et sa bouche avec la même anesthésie.</li>
	<li>Écouvillonner la 4e glande mammaire gauche avec de l’alcool. À l’aide de forceps de dents de rat fin, soulevez légèrement la4e glande mammaire pour insérer l’aiguille de 25 G. Assurez-vous que l’aiguille est biseautée, puis tirez légèrement sur le piston pour s’assurer que l’aiguille ne frappe pas les vaisseaux sanguins. Si aucun sang n’entre dans la seringue, continuez à injecter lentement 100 l de mélange de matrice de cellules-sous-sol-membrane dans le coussinet de graisse mammaire. REMARQUE : Une zone ronde surélevée apparaîtra sous la peau.</li>
	<li>Attendez que la matrice de membrane du sous-sol durcisse de 10 à 15 s, puis retirez l’aiguille. Répétez le processus avec les souris restantes dans la chambre d’induction. Placer toutes les aiguilles et les seringues usagées dans une boîte pointue.</li>
	<li>Utilisez le même site d’injection de glande mammaire pour toutes les souris. Surveillez de près le site d’injection et notez tout mélange d’implantation cellulaire qui fuit du site d’injection. REMARQUE : En quelques minutes, la souris commencera à reprendre conscience.</li>
	<li>Laissez le xénogreffe se développer librement sans interruption pendant 7 à 10 jours avant toute mesure de la taille de la tumeur.</li>
	<li>Examinez toutes les souris pour la taille de xénogreffe. Mesurer la taille de la tumeur avec un étalonneur. Déterminer le volume tumoral (mm3) avec l’équation suivante : <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg"> où L est la dimension la plus longue et W est la dimension la plus courte perpendiculaire à L.</li>
	<li>Identifier et supprimer les valeurs aberrantes dépassant une déviation standard de la moyenne. Utilisez uniquement des souris de tailles tumorales comparables pour des expériences. Divisez aléatoirement les souris en différents groupes de traitement et commencez les traitements.</li>
	<li>Mesurer la taille de la tumeur par caliper 2x par semaine. Tenez bon de tous les changements physiques des xénogreffes (c.-à-d. nécrose, lacération).</li>
</ol>3. Imagerie par bioluminescence in vivo et fluorescence ex vivo
REMARQUE : Dans cette étude, la bioluminescence bidimensionnelle et l’imagerie par fluorescence sont menées au point final de l’expérience. L’imagerie de bioluminescence (BLI) a été exécutée utilisant un scanner optique préclinique commercial équipé d’une caméra CCD refroidie 16 bits et d’un stade d’imagerie chauffé.
<ol><li>Avant l’imagerie, anesthésiez jusqu’à cinq souris porteuses de tumeurs dans la chambre d’induction en fixant l’isoflurane à 3 % avec de l’air filtré (0,2 m) à un débit de 1 L/min pendant 3 à 4 min. Déterminer l’anesthésie par une pincée d’enfant. Assurez-vous que la chambre d’induction est conservée à l’intérieur d’une hotte ventilée afin de minimiser l’exposition du personnel à l’isoflurane.</li>
	<li>Administrer la D-luciferine (150 mg/kg) aux souris anesthésiés par voie intraperitonéale à l’aide d’une aiguille de 27 G, et transférer une souris anesthésié à la chambre d’imagerie. À la chambre d’imagerie du scanner, maintenir l’isoflurane à 2% à 2,5% avec O2 comme porteur avec un débit de 1 L/min. REMARQUE : Maintenir la température corporelle de la souris à 37 oC pendant la procédure en gardant un tampon chauffé sous la chambre d’induction d’anesthésie, la table d’imagerie (si le stade n’est pas chauffé) et la cage de récupération postprocedure.</li>
	<li>Avant d’imaginer les souris de l’étude, obtenir la cinétique de luciferine en imagerie de trois souris porteuses de tumeurs supplémentaires (animaux non affectés à aucun groupe d’étude) à 2 minutes d’intervalle pour un total de 40 min en utilisant les paramètres suivants : excitation filtrée, filtre d’émission ouverte, f/stop 1, FOV-D, binning moyen (8 x 8), et exposition automatique. Utilisez le signal de bioluminescence de pointe mesuré pour définir la fenêtre de temps d’acquisition optimale d’image pour tous les points de temps suivants.</li>
	<li>Tout en effectuant l’imagerie métastase, protéger le signal BLI élevé de la tumeur primaire en le couvrant d’une manche découpée à partir d’un gant noir. Acquérir l’image en utilisant les mêmes paramètres décrits dans l’étape 3.3 avec le côté ventral de la souris face à la caméra pour l’imagerie des métastases pulmonaires et le côté dorsal de la souris face à la caméra pour l’imagerie métastase cérébrale. REMARQUE: Il est essentiel de tester quelques marques différentes de gants noirs pour choisir celui avec une luminescence automatique minimale.</li>
	<li>À l’aide d’un scanner et d’un logiciel d’analyse de données, dessinez une région d’intérêt standard sur la cavité thoracique ou le cerveau en veillant à ce que tout l’organe d’intérêt soit couvert pour évaluer le fardeau métastatique. Quantifier la production de bioluminescence (BL) sous forme de flux total (photons/seconde).</li>
	<li>Immédiatement après BLI, euthanasiez la souris par asphyxie de CO2 (conformément aux directives de l’ACUC et aux protocoles animaux approuvés par l’institution) et extrayez le poumon et le cerveau avec des ciseaux et des forceps disséquants pour l’imagerie ex vivo. REMARQUE : Le poumon extrait pour l’imagerie ex vivo et pour le comptage de nodule de métastase de poumon ne peut pas être exécuté sur la même souris en raison des procédures incompatibles.</li>
	<li>Rincer rapidement tous les organes avec 1x PBS pour enlever les taches de sang superficielles et placer les organes sur une plaque en plastique noir à faible autofluorescence. Transportez les organes vers un scanner de fluorescence multispectral équipé d’une capacité de mélange spectral (réglage de longueur d’onde liquide à l’état solide) avec une caméra CCD de 12 bits pour la détection de GFP.</li>
	<li>Acquérir des images GFP multispectrales (filtre d’excitation de 457 à 23 nm; filtre d’émission de 490 nm de long) des organes extraits et des souris témoins de roulement non tumorales en scannant à travers 500 à 720 nm à une échelle de 10 nm. Utilisez des organes excisés de souris témoins de roulement non tumorales pour corriger l’autofluorescence.</li>
	<li>Après l’imagerie multispectrale de GFP, déterminez les paramètres d’imagerie optimaux. Effectuez l’acquisition d’images de tous les organes cibles et effectuez l’analyse d’image (c.-à-d. générer une bibliothèque spectrale pour l’autofluorescence et le GFP pour la procédure de non-mélange spectral) selon le protocole du fabricant.</li>
</ol>4. Détection moléculaire des cellules métastatiques du cancer du sein
<ol><li>Après l’imagerie ex vivo, accrochez le cerveau entier dans de l’azote liquide et entreposez-le à -80 oC dans un congélateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’extraction de l’ADN.</li>
	<li>Pour l’extraction de l’ADN, mettre le cerveau entier dans un tube homogénéisant de 5 ml avec 2 ml de tampon de lyse d’ADN. Utilisez un homogénéisateur avec le réglage de puissance à 50 pour homogénéiser le tissu cérébral entier gelé. Une fois que le tissu cérébral est totalement homogénéisé, transférer la suspension de 1 ml (lysate) à un tube de microcentrifuge de 2 mL sans DNase et sans RNase et continuer à isoler l’ADN selon le protocole du fabricant. REMARQUE : Pour minimiser la contamination par l’ADN de report, nettoyez soigneusement l’homogénéisateur après chaque échantillon en le rinçant d’abord avec 75 % d’éthanol dans de l’eau exempte de DNase et sans RNase, puis en rinçant avec une solution de 1 M NaOH, suivie d’un rinçage avec 75 % d’éthanol dans l’eau sans DNase et Eau sans RNase pour réduire et détruire efficacement les résidus d’ADN.</li>
	<li>Ajouter 0,5 ml d’éthanol de 100 % de tampon de lyse d’ADN au lysate. Mélanger l’échantillon par inversion et conserver à température ambiante pendant 3 min. REMARQUE : Ne vous inversez pas trop de fois ou trop vigoureusement. L’ADN sera visible comme un précipité en laine.</li>
	<li>Utilisez une pointe de pipette pour transférer l’ADN dans un tube de microcentrifuge frais sans DNase et sans RNase. Laisser sécher l’échantillon d’air pendant 1 min. Ajouter 1 ml d’éthanol de 75 % et inverser le tube de microcentrifuge 3 à 6x pour laver l’échantillon d’ADN. Jeter l’éthanol après chaque lavage par tuyauterie. Répétez l’étape de lavage 2x.</li>
	<li>L’air sèche l’échantillon d’ADN pendant 10 s. Ajouter ensuite 52 L de NaOH de 8 mM pour dissoudre l’échantillon d’ADN. Pipet 2 L de l’échantillon d’ADN pour la quantitation de l’ADN, et utilisez les 50 L restants pour un essai en temps réel de PCR après ajustement de concentration. REMARQUE : NaOH aide à solubiliser complètement l’échantillon d’ADN.</li>
	<li>Quantifier 2 L de chaque échantillon d’ADN avec un spectrophotomètre et utiliser un rapport d’absorption entre A260/280 comme référence de contrôle de qualité. Calculez la concentration d’ADN avec cette formule : <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg">
</li>
	<li>Ajuster la concentration d’ADN à 50 ng/L. Pour chaque échantillon d’ADN, utilisez 50 ng d’ADN comme modèle de départ pour un essai PCR en temps réel. Utilisez la solution NaOH de 8 mM ou de l’eau exempte de DNase et sans RNase pour diluer l’échantillon d’ADN.</li>
	<li>Concevez la paire d’apprêt spécifique à la séquence exogène de protéine de fluorescence verte (GFP) en interne à l’aide d’un portail Web open source de conception d’amorce pour la détection en temps réel de PCR de l’étiquette GFP dans les cellules métastatiques qui ont envahi et colonisé les sites distal. NOTE: Cette étude a utilisé F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'.</li>
	<li>Utilisez un réactif PCR en temps réel rapide et une machine PCR en temps réel qui prend en charge un protocole PCR en temps réel rapide. En plus des étapes régulières d’amplification de cycle de 30, ajoutez une étape de courbe de dissociation à la fin de la course pour la détection de toute amplification non spécifique. REMARQUE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la détection moléculaire : 95 oC à 2 minutes de démarrage à chaud, 40 cycles de 95 oC 5 s, 60 oC 15 s, et enfin une analyse de la courbe de fusion. L’amplicon GFP est de 135 bp de taille.</li>
	<li>Utilisez un ADN naïf du cerveau de souris (pas un implant cellulaire MDA-MB-231) comme un contrôle négatif. Utilisez l’ADN extrait des cellules MDA-MB-231-GFP/Luc comme contrôle positif. Ajoutez tous les réactifs PCR sans aucun modèle d’ADN comme un contrôle sans modèle (CNT). REMARQUE : Un contrôle PCR est nécessaire pour chaque essai de PCR.</li>
</ol>5. Détection métastatique des cellules cancéreuses du sein dans les poumons
<ol><li>Pour le sous-groupe de souris choisi pour le comptage métastatique de nodule de poumon, anesthésiez les souris avec l’isoflurane (comme dans l’étape 2.2) immédiatement après la formation image d’ex vivo, exécutent une ponction cardiaque pour la collecte de sang, puis euthanasiez par la dislocation cervicale.</li>
	<li>Ouvrez la cavité thoracique avec des ciseaux disséquants et coupez au-delà du cœur et du thymus pour exposer la trachée.</li>
	<li>Insérez une seringue de 10 ml avec une aiguille de 22 G contenant la solution de Bouin dans la trachée. Poussez le piston de seringue jusqu’à ce que les poumons effondrés soient gonflés avec 2 ml de la solution du Bouin. Retirer la seringue et l’aiguille une fois que les poumons ont été gonflés.</li>
	<li>Placer le poumon entier dans un tube de 15 ml contenant la solution de Bouin, inverser doucement le tube à quelques reprises et laisser tremper 24 h à température ambiante.</li>
	<li>Après 24 h, retirer la solution du Bouin du tube, rincer le poumon avec de l’eau, puis le remettre dans le tube avec 70% d’éthanol. Comptez les métastases (taches blanches ou nodules) sur les surfaces des poumons à l’aide d’un microscope disséquant.</li>
</ol>6. Collecte et analyse de données
<ol><li>Enregistrez les données de volume de tumeur, ainsi que les données d’imagerie in vivo et ex vivo, sur une feuille de calcul électronique pour faciliter la saisie, la collecte et la gestion des données.</li>
	<li>À la fin de l’expérience, transférez toutes les données à la feuille de calcul électronique et aux logiciels statistiques pour l’intrigue des données et les analyses statistiques.</li>
</ol>

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<li>Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+augments+xenograft+transplantation+of+meningioma+cells+into+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice.</a> Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).</li>
<li>Mullen, P., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+in+the+establishment+of+ovarian+carcinoma+cell+lines+as+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).</li>
<li>Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+has+no+influence+on+tumor+development+or+PET+imaging+in+FaDu+human+head+and+neck+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts.</a> BMC Medical Imaging. 16, 5(2016).</li>
<li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Institute+for+Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour l’étude de TNBC chez les animaux, deux modèles murins ont été développés : les cellules humaines MDA-MB-231 d’adénocarcinome humain chez les souris immunodéprimées (c.-à-d. souris nues athymiques, souris NSG), et la 4T1 chez les souris BALB/c immunodéprimées. Les deux modèles ont leurs avantages. Le choix du modèle animal pour une étude dépend des objectifs de recherche. Par exemple, le modèle MDA-MB-231 est une lignée cellulaire humaine TNBC cultivée chez des souris immunodéprimées qui imite les patientes immunodéprimées du cancer du sein humain. D’autre part, le phénotype invasif des cellules cancéreuses du sein murine triple-négatives orthotopiques 4T1 chez les souris BALB/c imite étroitement le processus métastatique comme il se produit dans les patients atteints de cancer du sein humain de stade IV. Contrairement à l’approche d’injection de cellules intraveineuses, les cellules humaines de cancer du sein MDA-MB-231 ont été également injectées dans le coussin de graisse mammaire11,12 dans le modèle orthotopique de cancer du sein11,13. La croissance de tumeur plus longue et la capacité métastatique acquise est plus physiologiquement pertinente, ainsi ce n’est pas un modèle artificiel de cancer métastatique4,14. Un tel modèle spontané de métastase imite étroitement le développement humain de cancer du sein excepté l’étape d’initiation. Il s’agit d’un modèle crucial pour le dépistage des médicaments in vivo et l’évaluation de l’efficacité thérapeutique dans le cancer du sein métastatique.
Le site d’implantation de tumeur dans la souris joue un rôle crucial en fournissant un microenvironnement qui soutient la croissance de tumeur et la sélection du phénotype métastatique semblable à celui qui se produit dans l’homme. Le ganglion lymphatique proximale et la présence de tissu adipeux sont les facteurs clés affectant la progression de la maladie du cancer du sein15,16. Dans un patient humain, le ganglion lymphatique et le tissu adipeux sont tous deux des facteurs d’interaction clés affectant la malignité et l’incidence du cancer du sein17,18,19. Ainsi, la sélection de l’emplacement anatomique correct pour le site d’injection peut fortement impacter la pertinence du modèle de tumeur comparé à la maladie humaine. Cette étude a utilisé la quatrième glande mammaire comme site d’implantation principalement en raison des exigences susmentionnées et qu’il est anatomiquement plus accessible et plus facile à manipuler.
Différentes méthodes de calcul du volume tumoral sont disponibles, et un chercheur peut choisir tout ce qu’ils jugent bon. L’algorithme sélectionné pour cette étude est basé sur les résultats de Faustino-Rocha et al., qui a comparé différentes formules de calcul du volume tumoral et a conclu que la formule ci-dessous est la plus précise20.
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
La matrice de membrane de sous-sol est une matrice extracellulaire importante utilisée dans divers in vitro21 et in vivo22,23 essais. Il y a des rapports contradictoires22,24,25 concernant l’influence de la matrice de membrane de sous-sol sur la malignité de xénogreffe. Il semble affecter uniquement l’établissement initial de la xénogreffe et n’ont aucun effet supplémentaire sur la croissance de xénogreffe25. Pour l’implantation de xénogreffe décrite, la matrice de membrane de sous-sol a été mélangée avec les cellules cancéreuses pour augmenter la viscosité de solution de mélange de cellules/gel avant l’implantation. La présence de la matrice de membrane de sous-sol réduit la perte de solution de mélange du site d’injection et maintient la solution de mélange au site d’implantation, augmentant ainsi l’uniformité du volume implanté de xénogreffe.
La lignée cellulaire MDA-MB-231 est une lignée maligne de cellules humaines de sein immortalisée et est un outil populaire dans la recherche sur le cancer du sein en raison de son statut triple négatif. L’utilisation de la ligne cellulaire des doubles reporters (luciferase et GFP) permet une plus grande flexibilité dans la manipulation de l’imagerie in vivo et ex vivo. Il est bien établi que le signal de bioluminescence possède une plus grande sensibilité, une plus grande détectabilité de la profondeur et un contraste supérieur (rapport signal-bruit) que les signaux GFP. Pour cette raison, il s’agit d’une modalité d’imagerie largement utilisée pour l’imagerie du corps entier. Malheureusement, la détection de bioluminescence est limitée par une fenêtre de temps étroite (injection post-luciferine de 15 à 20 minutes) au cours de laquelle la détection du signal est linéaire. Le signal BLI diminue rapidement lorsque les animaux sont euthanasiés. Cela devient un problème de conception expérimentale si de nombreuses souris ont besoin d’être euthanasiées et la récolte de tissus ou d’organes multiples est nécessaire. Dans ces études, le sang a été récolté par la ponction directe de coeur, le cerveau, la tumeur primaire, le poumon, et le ganglion lymphatique affecté ont été examinés dans 40 souris. Au moment où les organes ont été récoltés et prêts pour la formation image ex vivo, le signal de bioluminescence était indétectable. Par conséquent, la détection GFP est plus appropriée dans ces situations. L’émission du signal GFP se situe dans la plage visible, et à ces longueurs d’onde, l’absorption du signal due au sang (c.-à-d. l’hémoglobine) est significativement plus élevée. En outre, l’autofluorescence dans la gamme visible due à NADH, lipo-pigments, et flavins donne dans un fond significatif qui le rend difficile de distinguer entre un signal GFP de bas niveau et le fond d’autofluorescence. L’utilisation d’une approche d’imagerie par fluorescence multispectrale au lieu de l’imagerie traditionnelle de la paire de filtres et l’utilisation d’algorithmes spectrals de mélange aident à identifier le signal GFP vrai dans l’organe d’intérêt. Par conséquent, en combinant les forces de l’imagerie de bioluminescence dans la détection in vivo du corps entier et l’imagerie multispectrale de GFP dans les évaluations d’organes/tissus ex vivo, les données quantifiables peuvent être maximisées dans une grande cohorte de souris.
Quelle que soit l’approche choisie pour une étude animale, l’extraction de tout le sang avant la récupération des organes et des tissus est fortement recommandée, en particulier pour les études ciblant le fardeau métastatique. Ce protocole détecte les signaux GFP provenant des échantillons de sang entiers prélevés sur les souris (données non montrées) dans le modèle orthotopique de cancer du sein par des essais EN temps réel de PCR. Minimiser le volume sanguin dans les organes/tissus réduira le signal faux positif dans les organes cibles.
En conclusion, le modèle orthotopique de cancer du sein utilisant les cellules MDA-MB-231-Luc/GFP est un modèle animal très pertinent qui imite étroitement l’état humain de patient de TNBC. Ce modèle est essentiel pour étudier, surveiller et évaluer l’efficacité thérapeutique dans un microenvironnement tumoral semblable aux êtres humains. L’utilisation de lignées cellulaires à double reporter améliore encore l’aspect pratique de ce modèle orthotopique de cancer du sein.

Environ une femme sur huit aux États-Unis développera un cancer du sein invasif au cours de sa vie, et 10 % à 20 % de ces femmes recevront un diagnostic de sous-type agressif triple négatif du cancer du sein (TNBC). Tandis que les lésions primaires peuvent être chirurgicalement enlevées dans la plupart des cas, la microméstase subclinique et la chimmoresistance en font une maladie insoluble. Fait important, la plupart des patients atteints de TNBC métastatique finissent par rechute, même s’ils ont subi un traitement au stadeprécoce 1. Ainsi, l’hétérogénéité de cancer, la microméstase, et la résistance thérapeutique sont trois défis principaux limitant les résultats cliniques réussis des patients de TNBC. Par conséquent, il est urgent de mieux comprendre le fond moléculaire polymorphe de TNBC et de développer des agents thérapeutiques efficaces qui limitent les maladies métastatiques.
La métastase tumorale est un processus multistep où la cellule tumorale contrôle et usurpe son microenvironnement pour favoriser sa propre dissémination par la dégradation de la membrane et l’évasion de cellules tumorales de la lésion primaire, par l’entrée dans (c.-à-d. l’intravasation) et la sortie de (c.-à-d., l’extravasation) la vascularisation, et finalement l’adaptation et la colonisation dans les lits tissulaires distal2. Des modèles animaux ont été développés pour étudier la métastase du cancer du sein, où deux méthodologies sont généralement mises en œuvre : l’injection directe de circulation sanguine et l’implantation orthotopique. Les méthodes couramment utilisées pour l’injection directe de circulation sanguine incluent l’injection de veine de queue, tandis que d’autres approches comprenant l’injection cardiaque directe3,l’injection directe de cerveau4,et l’injection directe de foie5 ont également été employées. L’injection directe de circulation sanguine est souvent appelée un modèle artificiel de métastase, qui est rapide et facile mais moins physiologiquement précis parce qu’il contourne l’évasion de tumeur de la lésion primaire et l’intravasation6,7,8. Par rapport aux modèles d’injection directe, le modèle orthotopique de cancer du sein prend plus de temps pour l’occurrence des lésions métastatiques détectables dans les organes éloignés tels que le poumon, mais il est plus physiologiquement pertinent parce qu’il imite étroitement le processus métastatique multistep pendant qu’il se produit chez l’homme. Fait important, une étude 20139 a comparé l’injection de veine de queue et les modèles orthotopiques et a constaté que les cellules cancéreuses du sein injectées dans la veine arrière et celles isolées des lésions métastatiques de poumon après injection de veine de queue ont montré des profils globaux semblables d’expression de gène. En revanche, le profil d’expression génétique mondial des cellules cancéreuses du sein orthotopiquement injectées était radicalement différent de celui des lésions métastatiques pulmonaires provenant des cellules orthotopiquement injectées9. Ces observations suggèrent que le modèle orthotopique soit plus physiologiquement pertinent, parce que les lésions métastatiques subissent un processus de sélection semblable au processus multistep de métastase pendant qu’elle se produit chez l’homme.
Ce travail décrit un modèle orthotopique de cancer du sein (MDA-MB-231-Luc/GFP) chez les souris nues qui a été optimisé dans notre laboratoire pour des techniques de détection d’imagerie ainsi que l’identification de nouveaux biomarqueurs et le développement d’agents chimiothérapeutiques ciblés.

<table><tbody><tr><td>Bouins Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132-1L</td><td>Poumon métastatique nodule coloration</td></tr><tr><td>D-Luciférine, Potassium Sel</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferase substrat</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>ThermoFisher</td><td>10503027</td><td>DNA Kit</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Tableur</td></tr> logiciel <tr><td>homogénéisateur</td><td>Virtis</td><td>Cyclone Virtishear</td><td>Pour l’homogénéisation des tissus</td></tr><tr><td>Scanner IVIS SPECTRUM</td><td>Système d’imagerie de fluorescence et BLI</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de fluorescence Maestro GNIR-FLEX</td><td>Système d’imagerie par fluorescence</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>MatriGel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Conserver à -20 °C et conserver à un âge avancé (4 °C) lors de l’utilisation.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Lignée cellulaire stable</td><td>GenTarget</td><td>SC044</td><td>Dual Reporter Lignée cellulaire du cancer du sein humain</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS</td><td>Capture d’images d’histologie</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>ThermoFisher</td><td>Tampon de</td><td>rinçage</td>10010049</tr><tr><td>Primer3</td><td>MIT</td><td></td><td>Primer Design</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Logiciel d’analyse statistique</td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Milieux RPMI 1640 Milieux</td><td>de culture ThermoFisher 61870127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeniFAST SYBR Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-94020</td><td>Réactif de PCR en temps réel rapide</td></tr><tr><td>StepOne Plus Système de PCR en temps réel</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Machine de PCR en temps réel</td></tr></tbody></table>

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type agressif de cancer du sein avec des options thérapeutiques limitées. Par rapport aux patients présentant des tumeurs mammaires moins agressives, le taux de survie de 5 ans des patients de TNBC est de 77% en raison de leur phénotype pharmacorésistant caractéristique et de leur fardeau métastatique. Vers cette fin, des modèles murins ont été établis visant à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques limitant la croissance tumorale de TNBC et la propagation métastatique. Ce travail décrit un guide pratique pour le modèle orthotopique de TNBC où les cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 suspendues dans une matrice de membrane de sous-sol sont implantées dans le quatrième coussin de graisse mammaire, qui imite étroitement le comportement de cellules cancéreuses chez l’homme. Mesure des tumeurs par caliper, évaluation de métastase de poumon par l’intermédiaire de la formation image in vivo et ex vivo, et la détection moléculaire sont discutées. Ce modèle fournit une excellente plate-forme pour étudier l’efficacité thérapeutique et est particulièrement approprié pour l’étude de l’interaction entre la tumeur primaire et les sites métastatiques distal.

La mesure du volume tumoral par caliper est une méthode bien établie pour évaluer l’efficacité du traitement(figure 1). Le nombre de cellules implantées, l’utilisation de la matrice de membrane de sous-sol, du microbiome, de la propreté des installations et du site d’injection sont les facteurs clés ayant une incidence sur le taux de croissance tumorale.
Contrairement à l’imagerie GFP, BLI a exigé l’administration du substrat de luciferase au moins 15-20 min avant l’imagerie BLI. En outre, la souche de souris, la ligne cellulaire, les traitements, et le journaliste de luciferase affectent tous les niveaux de signal de bioluminescence. Ainsi, pour obtenir des signaux comparables entre les groupes d’étude, une étude cinétique BLI avant l’imagerie doit être menée pour déterminer le meilleur délai d’imagerie(figure 2).
En raison du rapport signal-arrière supérieur26,27, l’imagerie de bioluminescence in vivo du corps entier était très sensible dans la détection du signal de métastase de bas niveau par rapport à l’approche GFP(figure 3). En outre, le signal de bioluminescence a fourni une pénétration plus profonde que GFP par quelques millimètres. Cependant, la production de signaux de bioluminescence nécessite l’ATP, qui est un facteur limitant dans l’évaluation des échantillons de tissus ex vivo. Si les animaux sont traités rapidement, alors BLI pourrait être une approche viable pour obtenir des résultats quantitatifs sur les métastases. Une façon d’y parvenir est de traiter un animal à la fois. Cependant, cette approche n’était pas faisable pour cette étude parce qu’une grande cohorte de souris a été utilisée. Le signal de BLI n’a pas été détecté quand les organes ont été photographiés autour de l’injection de poteau de luciferine de min. L’utilisation d’une ligne de cellule double reporter est utile dans cette situation. En raison de la nature stable de la molécule GFP, les chercheurs auraient suffisamment de temps pour traiter la carcasse avant de capter les signaux GFP des organes cibles(figure 4).
La figure 5 fournit un exemple réel de la façon dont les mesures de taille de tumeur de caliper pourraient déformer l’interprétation de données, parce que le xénogreffe a perdu la plupart de la teneur viable de cellules de tumeur mais a maintenu sa grande masse et forme. L’examen histopathologique de ces xénogreffes a indiqué la nécrose à l’intérieur de la masse(figure 5B).
Pour les chercheurs qui remettent en question les résultats d’imagerie concernant la métastase cérébrale dans le modèle orthotopique de cancer du sein, la détection moléculaire par PCR en temps réel peut fournir des preuves convaincantes(figure 6). Dans ce cas, la séquence exogène d’ADN de GFP était la meilleure manière de résoudre ce problème, parce que la séquence transfectede d’ADN de GFP n’existe pas naturellement chez l’homme ou les rongeurs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> Figure 1 : Mesure du volume tumoral. Le volume/la mesure de chargement de tumeur avec un étalonnage a commencé le jour 10 après l’implantation de xénogreffe et a été mesuré 2x par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les barres d’erreur sont calculées par valeur SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> Figure 2 : Détermination d’une fenêtre d’acquisition d’image optimale. Gauche : Une souris avec une grande xénogreffe et une souris avec un petit xénogreffe ont été sélectionnées pour la détermination optimale de la gamme cinétique de luciferin. Droite : courbe cinétique Luciferin obtenue en acquérant les images toutes les 2 minutes pendant 40 min. Un plateau a été observé entre 15-22 min, qui a été utilisé comme un temps optimal d’acquisition d’image pour toute imagerie ultérieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> Figure 3 : Imagerie BLI du corps entier. L: Image de BLI du corps entier. M: Vue ventrale avec le bas du corps recouvert d’une manche d’un gant noir. R: Vue dorsal avec le bas du corps recouvert d’une manche d’un gant noir. Une métastase axillaire de ganglion lymphatique est détectée dans la vue ventrale par la formation image de BLI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> Figure 4 : Détection du signal Ex vivo BLI/GFP. Des signaux de GFP ont été détectés dans le cerveau et le poumon de la même souris 20 min après que la souris ait été sacrifiée. Le signal de BLI n’a pas été détecté 45 min d’injection de luciferine de poteau. Aucun signal de GFP n’a été détecté dans le cerveau et le poumon naïfs de souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> Figure 5 : Avantages des techniques d’imagerie optique par rapport aux mesures de l’étalonnage. (A) Image représentative montrant la détection in vivo du signal de GFP dans une tumeur primaire. Seule une partie mineure du xénogreffe a montré le signal de GFP, suggérant qu’une partie significative de la masse était stroma. Cela ne peut pas être déterminé par des mesures traditionnelles d’étalonnage et peut conduire à une conclusion inexacte. Cet exemple souligne l’importance de l’imagerie optique pour l’étude du modèle animal. (B) Section histopathologique de la même souris montrant que la région nécrotique (c.-à-d., région intérieure) a également contribué au calcul de la taille de tumeur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> Figure 6 : Analyse de la courbe de fusion. La courbe de fonte montrant la spécificité des amplicons GFP. L’ADN du cerveau obtenu des souris MDA-MB-231-Luc/GFP-implantées et de l’ADN isolé des cellules MDA-MB-231-Luc/GFP cultivées en culture (contrôle positif) ont été analysés. L’essai en temps réel de PCR a été exécuté pour évaluer le contenu de GFP dans le tissu cérébral. (A,B) Les courbes de fusion du contrôle positif et de l’ADN extrait du cerveau de souris, respectivement. (C) Les courbes superposées des panneaux A et B, indiquant les signaux de pointe des DNA du cerveau de souris sont spécifiques pour la séquence exogène de GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce travail préséque un protocole avancé pour évaluer avec précision la charge tumorale par la détection de protéines fluorescentes vertes et de signaux de bioluminescence ainsi que l’intégration de la technique quantitative de détection moléculaire.

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Notre protocole surmonte la fenêtre d’imagerie par bioluminescence limitée en incluant une balise GFP qui facilite également la détection et la quantification de la micrométastase par analyse PCR. Étant donné que l’étiquette GFP contourne la fenêtre d’acquisition limitée de bioluminescence, plus de sujets peuvent être photographiés sans perte de signal et le potentiel de résultats faussement négatifs est limité. Cette étude sera utile aux chercheurs pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutique des agents anticancéraux.Cette méthodologie fournit un modèle utile pour les chercheurs intéressés par l’EMT, la résistance aux médicaments et les mécanismes des cellules souches cancéreuses liés au processus métastatique ainsi que pour le développement de médicaments anticancéraux. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, écouvillonnez la quatrième glande mammaire gauche avec de l’alcool et utilisez de fines forceps de dent de rat pour soulever légèrement la quatrième glande mammaire. S’assurer que la pointe est biseauté, insérer une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue d’un millilitre contenant 100 microlitres de mélange matricielle membranaire du sous-sol cellulaire et rétracter légèrement le piston pour s’assurer que l’aiguille ne contacte aucun vaisseau sanguin.Pour des résultats comparatifs, le site d’injection de cellules de tumeur doit être cohérent parmi tous les animaux destinataires. Si aucun sang n’entre dans la seringue, injectez lentement tout le volume de solution dans la graisse mammaire. Une masse surélevée ronde apparaîtra sous la peau.Attendez 10 à 15 secondes que la matrice membranaire du sous-sol durcisse avant d’enlever l’aiguille et de permettre à la xénogreffe de croître librement sans interruption pendant sept à dix jours avant d’effectuer une mesure de la taille de la tumeur. Ensuite, utilisez des étriers pour mesurer la taille de la xénogreffe chez toutes les souris et déterminer le volume tumoral en utilisant l’équation comme indiqué. Avant d’imaginer les animaux de l’étude, imagez trois souris porteuses de tumeurs supplémentaires pendant 40 minutes à intervalles de deux minutes en utilisant les paramètres indiqués pour obtenir la cinétique de la luciferine pour l’étude.Utilisez le signal de bioluminescence mesuré par pic pour définir la fenêtre de temps optimale d’acquisition d’image pour tous les points de temps suivants. Pour effectuer l’imagerie métastase, couvrez la tumeur primaire avec une manche coupée à partir d’un gant noir et placez une souris anesthésiée dans le scanner, puis imagez le signal luciferin en utilisant les mêmes paramètres que ce qui vient de le démontrer avec le côté ventral de la souris face à la caméra pour l’imagerie de métastase pulmonaire et le côté dorsal de la souris face à la caméra pour l’imagerie de métastase cérébrale. À l’aide d’un scanner et d’un logiciel d’analyse de données, dessinez une région d’intérêt sur la zone d’image pour vous assurer que l’ensemble de l’organe d’intérêt est couvert afin de permettre l’évaluation de la charge métastatique et de quantifier la production de bioluminescence comme flux total et photons par seconde.Immédiatement après la quantification du signal de bioluminescence, récoltez le cerveau et les tissus pulmonaires et rincez rapidement les organes dans PBS pour éliminer les taches de sang superficielles. Placez les organes sur une plaque de plastique noir à faible fluorescence automatique et transportez les échantillons à un scanner de fluorescence multispectrale équipé d’une capacité spectrale de désintoxication pour la détection du GFP. Pour acquérir des images gfp multispectrales des organes extraits, numérisez les organes de 500 à 720 nanomètres avec une taille d’étape de 10 nanomètres.Pour obtenir le profil d’auto fluorescence des tissus, numérisez les organes excisés des souris témoins non injectées. En outre, image GFP tissus positifs tels que la tumeur primaire pour acquérir la fluorescence automatique mixte profil GFP. Traiter ces spectres selon le protocole du fabricant afin d’établir une bibliothèque spectrale avec des profils de GFP purs et de fluorescence automatique.Après avoir confirmé l’exactitude de la bibliothèque spectrale et séparé le signal GFP de l’arrière-plan d’auto fluorescence tissulaire, utilisez la même bibliothèque pour démixer toutes les images à l’étude. Pour l’extraction de l’ADN après le gel instantané, placez le cerveau entier dans un tube homogénéisant de cinq millilitres contenant deux millilitres de tampon de lyse d’ADN et utilisez un homogénéisateur réglé à 50 pour homogénéiser le tissu. Lorsque le tissu a été entièrement homogénéisé, transférer un millilitre du lysate à un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres sans DNAse et RNAse et isoler l’ADN selon le protocole du fabricant.Ajouter 500 microlitres de 100% d’éthanol à l’isolat et mélanger l’échantillon par inversion. Après trois minutes à température ambiante, utilisez une pipette pour transférer l’ADN en laine dans un nouveau tube sans DNAse et RNAse de deux millilitres. Laissez sécher l’air de l’échantillon pendant une minute avant d’ajouter un millilitre de 75 % d’éthanol au tube et d’inverser le tube trois à six fois pour laver l’échantillon.Jetez l’éthanol après la dernière inversion avant de laver l’ADN deux fois de plus avec de l’éthanol frais par lavage comme nous venons de le démontrer. Après le dernier lavage, séchez l’échantillon pendant 10 secondes avant de dissoudre l’ADN dans 52 microlitres d’hydroxyde de sodium de huit millimlaires. Transférer un aliquot de deux microlitres d’ADN sur un flacon spectrophotomètre et quantifier la concentration d’ADN dans l’échantillon à l’aide d’un rapport d’absorption entre A260 et 280 selon la formule.Ajuster la concentration d’ADN de l’échantillon à 50 nanogrammes par microlitre avec l’hydroxyde de sodium supplémentaire de huit millimolaires et concevoir la paire d’amorce spécifique à la séquence de GFP vert exogène en interne à l’aide d’un portail Web de conception d’amorce open-source pour la détection pcr en temps réel de l’étiquette GFP et les cellules métastatiques qui ont envahi et colonisé les sites distal de la tumeur. Ensuite, utilisez un réaccérateur PCR rapide en temps réel et une machine PCR en temps réel qui prend en charge un protocole PCR rapide en temps réel pour l’analyse quantitative en temps réel pcr de l’échantillon. Pour la détection des cellules métastatiques de cancer du sein dans le poumon, utilisez des ciseaux disséquants pour ouvrir la cavité thoracique et couper au-delà du cœur et du thymus pour exposer la trachée.Insérer une aiguille de calibre 22 attachée à une seringue de 10 millilitres contenant la solution Bouin dans la trachée et déprimer le piston jusqu’à ce que les poumons effondrés deviennent gonflés avec environ deux millilitres de la solution. Retirer la seringue et l’aiguille une fois que les poumons ont été gonflés et transférer l’ensemble du poumon dans un tube de 15 millilitres contenant une solution Bouin fraîche. Inverser doucement le tube à quelques reprises avant de laisser tremper le tissu pendant 24 heures à température ambiante.Le lendemain, rincer le poumon à l’eau et placer l’échantillon dans un tube de 70% d’éthanol. Ensuite, utilisez un microscope disséquant pour compter le nombre de taches blanches métastatiques et de nodules sur les surfaces des poumons. La mesure du volume tumoral par étrier est une méthode bien établie pour évaluer l’efficacité du traitement.Pour obtenir des signaux comparables entre les groupes d’étude, une étude cinétique BLI de pré-imagerie doit être menée afin de déterminer le meilleur délai d’imagerie. En raison du rapport supérieur de signal-à-fond, le corps entier in vivo BLI est tout à fait sensible en détectant des signaux de métastase de bas niveau comparés à l’approche de GFP. Cependant, en raison de la nature stable de la molécule GFP, les chercheurs ont suffisamment de temps pour traiter la carcasse avant de capturer les signaux GFP à partir d’organes cibles dans le cadre d’études à double reporter.Cet exemple de la vie réelle démontre comment les mesures de taille de tumeur d’étrier peuvent déformer l’interprétation de données pendant que cette xénogreffe a perdu la majeure partie de la teneur viable de cellules de tumeur tout en maintenant sa grande masse et forme. La détection moléculaire par PCR en temps réel peut également fournir des preuves convaincantes de métastase cérébrale dans le modèle orthotopique de cancer du sein utilisant le séquençage exogène d’ADN de GFP car la séquence transfectée d’ADN de GFP n’existe pas naturellement chez l’homme ou les rongeurs. Le site d’implantation doit être physiologiquement et anatomiquement lié à la malignité de cancer.L’expression du gène tumoral et des protéines peut être évaluée à des emplacements primaires et distals et les cellules métastatiques peuvent être isolées pour une caractérisation plus approfondie.

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Recherche sur le cancer

La vidéo montre la technique d’inoculation orthotopique du cancer du sein dans un modèle murin. Cette technique produit un taux élevé de tumorigenèse avec moins de variabilité dans la taille et la forme de la tumeur par rapport à l’injection sous-cutanée ou non chirurgicale.

Injection orthotopique : implantation de cellules cancéreuses spécifiques à un tissu dans une souris adulte

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Un modèle de tumeur primaire du cancer du sein orthotopique et l'ablation chirurgicale de la tumeur primitive pour prolonger la vie de la souris pour générer des métastases spontanées sont décrites. La croissance et la progression tumorale sont surveillés et quantifiés par imagerie par fluorescence luciférase.

Un modèle de souris orthotopique du sein spontané Cancer Métastase

Nous introduisons un modèle de cancer du sein orthotopique murin et modèle de mastectomie radicale avec la technologie de la bioluminescence pour quantifier le fardeau tumoral pour imiter la progression du cancer du sein humain.

Génération d’un modèle de Cancer du sein métastatique orthotopique murin et effectuant une mastectomie radicale Murine

Ici, nous présentons un protocole visant à implanter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, façon invasive et facile à manipuler, moins et ce modèle murin orthotopique breast cancer avec un environnement approprié coussinets adipeux mammaire peut être utilisé pour étudier divers aspects de la cancer.

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles murins génétiquement modifiés transplantables récapitulent fidèlement les maladies humaines et sont des modèles préférés pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer du sein. Ici, une méthode est décrite pour transplanter orthotopiquement des fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire afin d’étudier la biologie tumorale et d’évaluer la réponse médicamenteuse.

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

Ici, nous décrivons une méthode de surveillance non invasive impliquant l’expression de la luciférase et de la protéine fluorescente verte dans diverses lignées cellulaires de cancer du sein. Ce protocole fournit une technique pour surveiller la formation de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel chez la souris.

Surveillance de la croissance du cancer du sein et de la formation de colonies métastatiques chez la souris à l’aide de la bioluminescence

Le présent protocole décrit l’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins portant des lésions d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires.

Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires

Ce protocole décrit une méthode efficace et non chirurgicale pour l’implantation orthotopique de xénogreffes dérivées de patientes atteintes d’un cancer du sein chez la souris. La technique implique une dissociation enzymatique de la tumeur suivie d’une injection directe dans les coussinets adipeux mammaires, permettant une implantation à haut débit. Une validation complète garantit la fidélité du modèle, ce qui facilite des études rigoureuses sur divers sous-types de cancer du sein.

Dissociation à haut débit et implantation orthotopique de xénogreffes dérivées de patientes atteintes d’un cancer du sein

L’identification de nouvelles cibles médicamenteuses qui passent des essais précliniques aux essais sur l’homme est une priorité scientifique. À cette fin, nous décrivons ici une approche de génomique fonctionnelle pour examiner l’impact de l’appauvrissement des gènes sur les sphéroïdes des lignées cellulaires cancéreuses, qui modélisent de manière plus appropriée les cancers humains in vivo.

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

Découvrez un protocole avancé d'imagerie bioluminescente et de marquage GFP pour détecter les micrométastases dans un modèle orthotopique de cancer du sein. Cette méthode améliore l'évaluation de l'efficacité thérapeutique.

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

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