Name: A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez une méthode simple pour mesurer l'activité NF-kappa-B/AP-1 dans des macrophages rapporteurs sur couches protéiques adsorbées. Cette technique permet d'évaluer rapidement les voies de signalisation Toll-like receptor sur surfaces polymères.

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Les auteurs remercient le financement opérationnel du Projet de recherche des Instituts de santé du Canada (PTJ 162251), du Comité consultatif du Sénat de l'Université Queen's et du soutien à l'infrastructure du Fonds de leadership de la Fondation canadienne pour l'innovation John Evan (projet 34137) et du Fonds de recherche du ministère de la Recherche et de l'Innovation de l'Ontario (projet 34137). L.A.M. a reçu l'appui d'une bourse R. Samuel McLaughlin de l'Université Queen's, d'une maîtrise en études supérieures du Conseil canadien des études supérieures en sciences naturelles et en génie du Canada et d'une bourse d'études supérieures de l'Ontario. Les auteurs tient à remercier le Dr Myron Szewczuk pour son généreux don de la lignée de cellules macrophages journaliste NF-B/AP-1 et les Drs Michael Blennerhassett et Sandra Lourenssen pour l'utilisation de leur système d'imagerie gel et lecteur de plaques.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'un des principaux objectifs de notre laboratoire est la réponse de l'hôte aux implants solides de tissus mous biomatériaux, et en particulier comment les dommages cellulaires encourus pendant la procédure d'implantation influe sur la réponse de l'hôte. Les travaux présentés ici décrivent des expériences préliminaires utilisant une lignée de cellules macrophages reporter et du lysate cellulaire contenant du DAMP généré sin in vitro, afin d'étudier l'influence des molécules libérées lors de dommages cellulaires (c.-à-d. ...

La réaction du corps étranger (FBR) est une réponse chronique de l'hôte qui peut avoir un impact négatif sur la performance d'un matériau ou d'un dispositif implanté (p. ex. dispositifs d'administration de médicaments, biocapteurs), par la libération persistante de médiateurs inflammatoires et en empêchant l'intégration entre le matériau implanté et le tissu environnant1. Cette réponse immunitaire innée est initiée par la procédure d'implantation et se caractérise par la présence à long terme de cellules immunitaires innées et la formation de capsules fibreuses autour de l'implant1. Dans le contexte des réponses matérielles de l'hôte, les interactions macrophage-matérielle ont un impact significatif sur la progression de la réponse de l'hôte et le développement d'un FBR1. Les macrophages sont une population de cellules immunitaires innées diversifiées, recrutées au site de l'implant soit à partir de populations de macrophages résident de tissus ou du sang comme macrophages dérivés de monocytes. Ils commencent à s'accumuler sur le site de l'implant peu de temps après l'implantation, et en quelques jours deviennent la population cellulaire prédominante dans le microenvironnement implantaire. Les macrophages matériels, ainsi que les cellules géantes du corps étranger (FBGC) formées par la fusion des macrophages, peuvent persister à la surface du matériau pendant toute la durée de vie de l'implant2,3. Par conséquent, les macrophages sont considérés comme des acteurs clés dans la réponse du corps étranger en raison de leurs rôles orchestrant les étapes caractéristiques de la FBR: réponse inflammatoire aigue, remodelage des tissus, et la formation de tissu fibrotique1.
Les récepteurs de péage-comme (TLRs) sont une famille des récepteurs de reconnaissance de modèle qui sont exprimés par beaucoup de cellules immunitaires, y compris des macrophages, et ont été montrés pour jouer un rôle significatif dans l'inflammation et la guérison de blessure. En plus des ligands dérivés d'agents pathogènes, les TLR sont capables de lier les molécules endogènes, connues sous le nom de modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), qui sont libérés pendant la nécrose cellulaire et d'activer les voies de signalisation inflammatoires entraînant la production de cytokines proinflammatoires4. Nous et d'autres avons proposé que les dommages encourus pendant les procédures d'implantation de biomatériaux mous libèrent des DAMPs, qui adsorbent alors aux surfaces de biomatériaux en plus des protéines de sang et modulent les interactions suivantes de cellules-matériel5,6. Lorsque les macrophages interagissent avec la couche protéique adsorbed sur un implant, leurs TLR de surface peuvent reconnaître les DAMP adsorbés et activer les cascades de signalisation pro-inflammatoire, conduisant à nf-B et AP-1 transcription facteur d'activation et de production de cytokines proinflammatoires. Nous avons précédemment montré que les macrophages murines ont considérablement augmenté l'activité de NF-B/AP-1 et le facteur de nécrose de tumeur (TNF-, cytokine proinflammatoire) sécrétion en réponse à DAMP-contenant des couches de protéines adsorbed sur une variété de surfaces polymères par rapport aux surfaces avec sérum adsorbed ou plasma seulement (c.-à-d., pas de DAMPs présents), et que cette réponse est largement médiée par TLR2, tandis que TLR4 joue un rôle moindre5.
La lignée de cellules macrophages de reporter NF-B/AP-1 (Tableau des matériaux) utilisée dans ce protocole est une méthode pratique pour mesurer l'activité relative de NF-B et d'AP-1 dans les macrophages5,7,8. En combinaison avec les inhibiteurs de voie de TLR, cette ligne de cellules est un outil utile pour étudier l'activation de TLR et son rôle dans l'inflammation en réponse à une série de stimulus5,7,8. Les cellules de journaliste sont une ligne cellulaire macrophage-like de souris modifiée qui peut produire de façon stable la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) sur l'activation de facteur de transcription NF-B et AP-19. L'analyse colorimétrique enzymatique de phosphatase alcaline(tableau des matériaux)peut alors être utilisée pour quantifier les quantités relatives d'expression SEAP comme mesure indirecte de l'activité NF-B/AP-1. Comme nf-B et AP-1 sont en aval de nombreuses voies de signalisation cellulaire, neutraliser les anticorps et les inhibiteurs ciblant des TLR spécifiques (p. ex. TLR2) ou des molécules adaptatrices TLR (p. ex. MyD88) peuvent être utilisés pour vérifier le rôle d'une voie spécifique. La méthodologie décrite dans cet article fournit une approche simple et rapide pour évaluer la contribution de la signalisation de TLR dans les réponses de macrophage murine à une série de surfaces polymères avec des couches de protéine adsorbées contenant des protéines de sang et des DAMPs comme modèle in vitro des biomatériaux implantés.

<table><tbody><tr><td>Réactifs de culture cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-souris/humain CD282 (TLR2)</td><td>Biolegend</td><td>121802</td><td></td></tr><tr><td>CLI-095 (inhibiteur de TLR4)</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-CLI95</td><td></td></tr><tr><td>C57 complément plasma K2 EDTA 10ml, grade innovant origine américaine</td><td>InnovativeResearch</td><td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td><td>Plasma de souris</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Sans calcium, sans magnésium</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), qualité recherche</td><td>Wisent</td><td>98150</td><td></td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-EKLPS</td><td>Lipopolysaccharide d’Escherichia coli K12</td></tr><tr><td>Fibroblastes NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>Lipopeptide synthétique triacylé - TLR1/2 ligand</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-MPP</td><td>Réactif d’élimination des mycoplasmes</td></tr><tr><td>RAW-Blue cells</td><td>Invivogen</td><td>raw-sp</td><td>NF-&kappa ; B/AP-1 lignée cellulaire de macrophage rapporteur</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme d’expression TrypLE (1X)</td><td>Enzyme</td><td>de</td><td>dissociation cellulaire recombinante sans origine animale</td>Fisher Scientific 12604021</tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-ZN-1</td><td></td></tr><tr><td>Kits et dosages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaques pré-enrobées ELISA, souris IL-6</td><td>Biolegend</td><td>B213022</td><td></td></tr><tr><td>plaques pré-enrobées ELISA, souris TNF-&alpha ;</td><td>Biolegend</td><td>B220233</td><td></td></tr><tr><td>Endotoxine (Escherichia coli) - Endotoxine standard de contrôle (CSE)</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>E0005-5</td><td>Endotoxine pour courbe standard dans l’eau LAL d’essai d’endotoxine chromogène</td></tr><tr><td>, 100 mL</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>WP1001</td><td>Utilisé avec le dosage des endotoxines chromogènes</td></tr><tr><td>Dosage des protéines Micro BCA</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23235</td><td></td></tr> Kit <tr><td>de test du lysat d’amébocytes Limulus (LAL) Associates</td><td>of Cape Cope Inc.</td><td>C1500-5</td><td>Réactif de dosage des endotoxines chromogènes</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue milieu de détection de la phosphatase alcaline</td><td>Invivogen</td><td>rep-qb2</td><td>Dosage de la phosphatase alcaline pour mesurer indirectement NF-&kappa ; Activité B/AP-1</td></tr> <tr><td>Réactifs d’enrobage polymère</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme anhydre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique anhydre</td><td>Alcools commerciaux</td><td>P006EAAN</td><td>Sigma : Alcool réactif, anhydre, 676829-1L</td></tr><tr><td>Pince à pointe fine droite effilée</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-113</td><td></td></tr><tr><td>Solvant fluoré FC-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9755-100ML</td><td>Solvant fluoré pour fPTFE</td></tr><tr><td>Eau de culture cellulaire (sans endotoxines)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30529LS</td><td></td></tr><tr><td>Poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182230-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit élastomère Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822180</td><td></td></tr><tr><td>Téflon-AF (fPTFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>469610-1G</td><td>Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorométhyl)-1,3-dioxole-co-tétrafluoroéthylène]</td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Joints adhésifs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes Axygen, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à scintillation en verre borosilicaté, avec bouchons en polypropylène blanc</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PS 48 puits transparent</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-52</td><td></td></tr><tr><td>Plaque TCPS 96 puits Fisher</td><td>Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>Plaque TCPS 48 puits Fisher</td><td>Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Verres de couverture, cercles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Fioles traitées pour culture tissulaire Falcon, T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-Slide 8 Well</td><td>Ibidi</td><td>80828</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fioles traitées pour culture tissulaire, T150</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr></tbody></table>

a macrophage reporter cell assay to examine toll-like receptor-mediated nf-kb/ap-1 signaling on adsorbed protein layers on polymeric surfaces

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

La réponse inflammatoire persistante d'hôte à un biomatériau implanté, connu sous le nom de réaction de corps étranger, est un défi significatif dans le développement et la mise en œuvre des dispositifs biomédicaux et des constructions d'ingénierie de tissu. Les macrophages, une cellule immunitaire innée, sont des acteurs clés dans la réaction du corps étranger parce qu'ils restent au site de l'implant pendant toute la durée de vie de l'appareil, et sont couramment étudiés pour acquérir une compréhension de cette réponse néfaste de l'hôte. De nombreux chercheurs en biomatériaux ont montré que les couches de protéines adsorbées sur les matériaux implantés influencent le comportement des macrophages, et par la suite ont un impact sur la réponse de l'hôte. Les méthodes de cet article décrivent un modèle in vitro utilisant des couches de protéines adsorbed contenant des molécules de dommages cellulaires sur les surfaces de biomatériaux polymères pour évaluer les réponses macrophages. Une lignée de cellules macrophages de journaliste de NF-B/AP-1 et l'essai colorimétrique associé de phosphatase alkaline ont été employés comme méthode rapide pour examiner indirectement l'activité de facteur de transcription de NF-B/AP-1 en réponse aux couches complexes de protéine adsorbée contenant des protéines sanguines et des modèles moléculaires dommages-associés, comme modèle des couches complexes de protéine adsorbed formées sur des surfaces de protéine de biomatériau in vivo.

Des méthodes de nettoyage des surfaces recouvertes de polymères ont été testées pour s'assurer qu'il n'y avait pas de perturbation du revêtement, ce qui serait considéré comme un changement dans l'angle de contact avec l'eau à un bordereau de verre non couché (Figure 2). Des lames de microscope recouvertes de PMMA dans 70 % d'éthanol pendant 1 h ont été trouvés pour enlever le revêtement PMMA(figure 2, panneau gauche), probablement en raison de la solubilité de ...

Ce protocole fournit aux chercheurs une méthode rapide et indirecte de mesure de l'activité du facteur de transcription NF-B/AP-1, dépendante de TLR, dans une lignée de cellules macrophages murines en réponse à une variété de surfaces polymères et de couches protéiques adsorbées qui modélisent le microenvironnement de l'implant biomatériau.

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

Ce protocole permet l’évaluation rapide de l’activité NF-kappa-B et AP-1 chez les macrophages de journalistes cultivés sur des couches de protéines adsorbed et la contribution des voies de signalisation cellulaire, comme les récepteurs toll-like, à cette réponse. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité, permettant aux supernatants de culture cellulaire d’être rapidement analysés pour l’activité NF-kappa-B et AP-1 à l’aide d’un essai enzymatique simple. Commencez par dissoudre la PMMA en chloroforme à une concentration finale de 20 milligrammes par millilitre dans un flacon de scintillation en verre de 20 millilitres dans un capot de fumée.Placer une barre magnétique dans le flacon et remuer le mélange pendant au moins deux heures. Lorsque tous les solides ont été dissous, transférez 400 microlitres de la solution PMMA au centre de chaque glissière de microscope en verre borosilicate par condition planifiée sur un revêtement de spin, et faites tourner la PMMA sur la lame pendant deux minutes à 3000 rotations par minute. Rangez ensuite les glissières enduire de spin dans une boîte propre pulvérisée à 70 % d’éthanol.Ensuite, dans une armoire de sécurité biologique,

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Le dosage de la sialidase est une approche simple technique qui élucidera roman mécanisme moléculaire (s) de capteurs TLR des infections microbiennes et leur implication dans les maladies inflammatoires au niveau des récepteurs à la surface cellulaire de macrophages vivre.

Détection de Neu1 activité sialidase dans la régulation activation du récepteur Toll-like

Source : Barbero, A. M., et.al. Analyses de fluorescence pour l’étude de l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Cette vidéo présente un test basé sur la fluorescence pour étudier l’interaction entre un récepteur macrophage et les antigènes Mycobacterium tuberculosis . Les antigènes marqués fluorescentement sur une couche de couverture sont incubés avec des extraits de protéiques de macrophages, réticulés, marqués par anticorps, et...

Essai à base de fluorescence pour étudier les interactions des récepteurs des macrophages avec les antigènes bactériens

Cette vidéo présente un test visant à examiner l’activité dépendante du récepteur de type Toll (TLR) des facteurs de transcription Nuclear Factor-kappa-B (NF-κB) et activator protein-1 (AP-1) dans les macrophages. Les TLR déclenchent une cascade de signalisation pro-inflammatoire lors de la reconnaissance des motifs moléculaires associés aux dommages (DAMPs), activant NF-κB et AP-1. Les macrophages rapporteurs modifiés produisent l’enzyme phosphatase alcaline embryonnaire (SEAP) sécrétée lors...

Un test pour la signalisation du facteur de transcription NF-&kcy ;B/AP-1 dépendante du TLR dans les macrophages

Cette vidéo présente un test basé sur des cellules rapporteures pour le criblage de nanoparticules bioactives potentielles qui inhibent la signalisation du récepteur de type Toll (TLR). Le test consiste à introduire des lipopolysaccharides (LPS) mélangés à des hybrides de nanoparticules peptide-or dans des macrophages rapporteurs exprimant les protéines rapporteures - phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) et luciférase. La réduction du signal TLR induit par le LPS médié par les...

Un test pour cribler des nanoparticules bioactives pour l’inhibition de la signalisation des récepteurs de type Toll

Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l'IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l'IL-1β peut être utilisé pour mesurer l'activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l'activation par l'IL-1β expression.

Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l&#39;IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour transfecter efficacement des lignées cellulaires de macrophages murins avec des siRNA à l’aide du système de navette Amaxa Nucleofector à 96 puits, stimuler les macrophages avec des lipopolysaccharides et surveiller les effets sur la production de cytokines inflammatoires.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Nous présentons ici un protocole pour quantifier la phagocytose des particules fluorescentes par la lignée cellulaire de macrophages adhérents à l’aide d’une méthode fluorométrique. Cette méthode facilite une quantification à haut débit de l’internalisation des particules ainsi que la polymérisation de l’actine qui en résulte.

Haut Débit Fluorometric Technique pour l&#39;évaluation de phagocytose des macrophages et l&#39;actine polymérisation

Nous décrivons un dispositif expérimental permettant de visualiser avec une haute résolution sans précédent la formation et la fermeture de phagosomes en trois dimensions dans des macrophages vivants, en utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Il permet de surveiller la base de la cupule phagocytaire, les pseudopodes en extension, ainsi que le site précis de scission du phagosome.

&quot;Phagosome Clôture Assay&quot; pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)

La signalisation des récepteurs à péage (TLR) joue un rôle important dans la pathophysiologie de nombreuses maladies inflammatoires humaines et la régulation des réponses TLR par nanoparticules bioactives devrait être bénéfique dans de nombreuses conditions inflammatoires. Les cellules rapporteurs à base de cellules THP-1 fournissent une plate-forme de dépistage polyvalente et robuste pour identifier de nouveaux inhibiteurs de la signalisation TLR.

Criblage de nanoparticules bioactives dans des cellules immunitaires phagocytaires pour les inhibiteurs de la signalisation des récepteurs de type péage

Découvrez une méthode simple pour mesurer l'activité NF-kappa-B/AP-1 dans des macrophages rapporteurs sur couches protéiques adsorbées. Cette technique permet d'évaluer rapidement les voies de signalisation Toll-like receptor sur surfaces polymères.

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces (Vidéo) | JoVE Journal

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

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