Infection de Pneumococcus des cellules endothéliales humaines primaires dans le flux constant

L’utilisation de ce système de culture cellulaire endothéliale permet l’assimilation de la situation dans le flux sanguin. Et avec cette situation, nous pouvons analyser les processus d’infection bactérienne, y compris l’identification des vecteurs bactériens et aussi des vecteurs cellulaires qui sont impliqués dans ce processus. Cette technique ouvre la voie à l’exploration de l’impact des infections bactériennes sur l’intégrité vasculaire, y compris l’impact sur les mécanismes de morphogenèse, sur les réponses à l’inflammation et la régulation immunitaire.

Cette technique nécessite une manipulation spéciale des cellules endothéliales et donc une description visuelle est mieux qu’une simple explication verbale. Cette méthode donne un aperçu de plusieurs autres domaines de recherche corrélés avec des systèmes vasculaires perfusés tels que la différenciation des cellules endothéliales, la cicatrisation des plaies, la genèse tumorale et l’angiogenèse. L’une des étapes clés est la culture normalisée des cellules ainsi que la manipulation précise des cellules endothéliales primaires.

Cette technique nécessite une manipulation spéciale de la culture cellulaire qui ne pouvait pas être claire par une simple explication verbale. Pour commencer, travaillez dans un environnement stérile à l’aide d’un banc propre. Utilisez une pipette pour injecter 100 microlitres d’une solution de gélatine porcine filtrée stérile PBS de 2 % dans un seul réservoir d’une glissière de canal équilibrée à température.

Placez la glissade du canal recouverte de gélatine sur une mince plaque de polystyrène ou de polystyrène pour éviter une baisse de la température de la glissière avec une seringue Luer d’un millilitre pour ajouter 100 microlitres des quatre fois 10 à la cinquième suspension HUVEC par millilitre dans la glissière pour semer et cultiver le HUVEC. Incuber la glissade du canal avec le HUVEC pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après cela, remplissez chaque réservoir moyen aux deux extrémités de la glissière du chenal avec 60 microlitres de milieu ECGMS.

Incuber encore une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, pour régler la pompe microfluidique, connectez d’abord la perfusion équilibrée réglée à l’unité de pompe, remplissez avec 13,6 millilitres de milieu ECGMS et démarrez le logiciel de commande de la pompe. Dans le menu de la configuration fluidique de l’unité, sélectionnez l’ensemble de perfusion adéquat et le type de glissière de chambre à l’aide du parchemin vers le bas des fenêtres.

Choisissez 0,007 dyne seconde par centimètre carré dans le logiciel pour la viscosité moyenne. À l’extérieur de l’incubateur, connectez une bouteille en verre remplie de perles de silice de séchage au tube de pression d’air. Sélectionnez les paramètres d’écoulement dans le menu logiciel, réglez la pression à 40 millibar et rincez les tubes de pompe avec le milieu liquide en commençant le flux moyen continu.

Nous assurons un attachement cellulaire serré en utilisant des HUVECs cultivés sous-influencés et nous nous concentrons en outre sur l’obtention de bulles d’air hors du système ainsi que sur l’utilisation d’une alimentation électrique indépendante pour le système de pompe. Appuyez sur les connexions de tubes pour enlever les bulles d’air et assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne circule dans le système de pompe. Pour connecter la glissière du canal, arrêtez la circulation du flux dans le logiciel de commande de la pompe et maintenez le flux moyen et le tube de perfusion en serrant les tubes près de la connexion Luer.

Connectez la glissière du canal en évitant ainsi les bulles d’air. Dans l’onglet avancé du logiciel de contrôle de la pompe, utilisez le créateur du cycle d’outils logiciels pour programmer les cycles de stress de cisaillement souhaités pour la culture du débit. Programmez les niveaux de stress de cisaillement pour la circulation du débit et commencez la perfusion à long terme.

Commencez par cinq dyne par centimètre carré qui correspond à un débit de 5,44 millilitres par minute pendant 30 minutes suivi d’un débit continu à un stress de cisaillement de 10 dyne par centimètre carré qui correspond à un débit de 10,85 millilitres par minute. Contrôlez le pompage équilibré du réservoir. Placez l’unité fluidique avec la glissière du canal connecté dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Démarrez le contrôle logiciel microscope et ajustez les paramètres principaux pour la surveillance microscopique de fluorescence en sélectionnant les paramètres de filtre appropriés. Pour la visualisation microscopique, placez l’unité fluidique dans la chambre chauffante de 37 degrés Celsius. Placez la glissière du canal sur la scène d’un microscope préchauré.

Contrôler la morphologie cellulaire et l’intégrité de la couche HUVEC avant l’injection d’histamine et de bactéries à la circulation sanguine. Maintenez le réglage du débit. Induire la libération de VWF à partir de corps palade viables endothéliales en injectant 136 microlitres d’une solution de stock d’histamine de 100 millimlaires par un port d’injection dans le milieu ECGMS circulant dans le tube de perfusion.

Pour la détection d’immunofluorescence des cordes multimérisées de VWF, injectez 20 microgrammes d’un anticorps conjugué FITC spécifique de VWF dans un volume de 200 microlitres de PBS dans les 13,6 millilitres circulants du milieu d’ECGMS. Pour quantifier l’attachement pneumococcique aux chaînes VWF générées sur les surfaces cellulaires HUVEC, injectez 1,35 fois 10 à la huitième CFU par fpR millilitre exprimant Pneumococci dans un volume maximum d’un millilitre dans le milieu ECGMS à l’aide du port d’injection. Sélectionnez un objectif d’immersion d’huile 63X pour le grossissement au microscope et ajustez les paramètres du filtre de fluorescence dans le logiciel de microscope au canal de DP avec un filtre de détection de 540 nanomètres pour la détection de la DP exprimant Pneumococci.

Pour quantifier l’attachement bactérien aux chaînes VWF, créez des instantanés de piles Z d’au moins 30 vues de champ représentatives contenant chacune environ 10 HUVEC morphologiquement intacts et comptez la quantité de Pneumococci. Pour évaluer l’attachement bactérien après fixation avant la coloration immunofluorescente, arrêtez le flux, enlevez 10 millilitres de milieu ECGMS des réservoirs de pompe, et ajoutez 10 millilitres de PBS complétés avec 5% de paraformaldéhyde et procédez selon le manuscrit. Dans ce protocole, les principales étapes expérimentales commencent par une pré-culture des cellules endothéliales primaires à la sous-influence dans les flacons de culture cellulaire.

Les cellules sont ensuite ensemencées dans une glissade de canal recouverte de gélatine. Les bactéries sont cultivées sur des plaques d’agar suivies d’une culture dans une phase complexe de grumes moyennes à moyennes liquides. Pour la culture cellulaire microfluidique, une glissade de canal avec des cellules endothéliales est reliée aux tubes de perfusion d’une unité fluidique du système de pompe et soumise à un débit constant pour la différenciation cellulaire.

La génération des cordes VWF a été induite par l’injection d’histamine à un stress de cisaillement de 10 dyne seconde par centimètre carré et microscopiquement surveillée par détection d’immunofluorescence utilisant des anticorps spécifiques de VWF fitc-étiquetés. Après injection de protéine de fluorescence rouge exprimant des bactéries au milieu circulant, l’attachement de Pneumococcus aux cordes de VWF a été microscopiquement visualisé en temps réel par l’émission de fluorescence à 450 nanomètres. Après fixation des cellules utilisant pfa, la coloration différentielle d’immunofluorescence fournit la visualisation de l’attachement bactérien aux points spécifiques de temps d’infection.

L’étape la plus importante de cette procédure est d’assurer un attachement cellulaire serré sur la surface de la glissière en ajustant les niveaux physiologiques de stress de cisaillement et en évitant les fluctuations extrêmes de pression de la pompe. En plus de la visualisation microscopique, cette technique peut être appliquée pour étudier les effets pharmacologiques de nouveaux anti-infectieux et aussi pour analyser les conséquences à long terme des processus d’infection vasculaire. Ce système de pompe imprègne les pathogènes bactériens par la pression atmosphérique pour empêcher toute transmission par aérosols.

Il est recommandé de suivre les précautions de biosécurité.