Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

Ce protocole facilite la détermination réussie de la structure du domaine de liaison IKK de NEMO, dans sa forme non lécée. Et les détails de sa production et de sa cristallisation. Le protocole, tire parti de cette stabilisation de la confirmation native du fragment de domaine de liaison IKK de NEMO, à travers des adaptateurs bobines en bobines, qui facilitent la cristallisation et la détermination de la structure.

La biologie structurale de NEMO, en tant que cible, fournit un avantage important dans le développement des inhibiteurs de NEMO pour le traitement des maladies inflammatoires et auto-immunes et du cancer. Ce protocole peut être étendu à la détermination de la structure des complexes NEMO, avec des inhibiteurs du peptide ou de petites molécules pour la découverte ou l’optimisation de médicaments. Le refolding et la concentration de protéine, pendant le stade de production de protéine, sont fondamentaux pour obtenir un dimère pur de NEMO.

Limiter l’agrégation et assurer la solubilité dans des conditions de cristallisation. Tamar et Amy, étudiants diplômés de notre laboratoire, démontreront les procédures. Commencez par ajouter 20 millilitres de solution de bouillon formidable.

Et 20 microlitres d’une solution de stock de 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline. À un flacon Erlenmeyer de 125 millilitres. Suivi de quelques microlitres de stock de glycérol cellulaire, à partir de stockage de 80 degrés Celsius, de cellules compétentes BL21DE3.

Transformé avec vecteur. Après avoir secoué la culture de démarrage pendant la nuit, à 37 degrés Celsius et 220 rotations par minute, diluer les cellules à un OD600 de 0,1 et 250 millilitres de bouillon formidable. Et ajouter de l’ampicilline à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre.

Lorsque l’OD600 de la culture atteint 0,8 à 1, ajouter iPTG à la culture, à une concentration de 500 micromolaires. Et faire pousser les cellules pendant quatre heures, à 37 degrés Celsius, jusqu’à ce que l’OD600 atteigne six à dix. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules par centrifugation.

Et re-suspendre la pastille en 40 millilitres de tampon de lyse. Divisez les cellules re-suspendues en deux aliquots de 20 à 25 millilitres. Et utilise une presse Français pour appliquer environ 25 000 livres par pouce carré de pression sur les cellules, deux à trois fois par aliquot, dans une pièce froide.

Ensuite, ajouter de l’urée aux lysates cellulaires, à une concentration finale de huit molaire. Et incuber la solution cellulaire sur une plate-forme de basculement pendant deux à 16 heures, à température ambiante. Le lendemain matin, transférer les lysates dans des tubes d’ultra-centrifugeuse, à au moins les trois quarts pleins, par tube.

Et ulrta centrifugeuse les lysates, pendant 45 minutes. Décanter les supernatants dans un tube conique de 50 millilitres. Et chargez le supernatant incubé à l’urée sur une colonne IMAC, à trois millilitres par minute.

Lorsque tout le supernatant a traversé la colonne, lavez la colonne pour 10 volumes de colonnes, avec tampon de liaison, à trois millilitres par minute. Et effectuer l’élitution de gradient de la protéine NEMO-EEAA de 10 à 500 millimolar imidazole, sur un gradient de volume de 12 colonnes. Collecte d’un millilitre aliquots de l’éliuate, dans une plaque de collecte fractionnée.

Après l’analyse de la page SDS, tirez les fractions contenant la protéine cible pure et mesurez la concentration de protéines par essai de Bradford, selon le protocole standard. Sélectionnez les fractions échappées, contenant des protéines. Pour couper l’étiquette HIS6 et éliminer l’excès d’imidazole de l’échantillon, ajoutez la protéase TEV, à un rapport de poids de un à 10, de protéine fendée TEV, à l’échantillon de protéines cible.

Et dilater l’échantillon pendant la nuit en quatre litres de Tris de 20 millimlaires. Chlorure de sodium de 150 millimlaires et solution de TNT de deux millimolaires. Le lendemain matin, chargez l’échantillon NEMO-EEAA fendue TEV sur une deuxième colonne IMAC, à un millilitre par minute.

Collecte du flux à travers en une fraction millilitre, dans une plaque de collecte fraction bol 96. Lavez la colonne avec cinq volumes de Tris de 20 millimolaires, de chlorure de sodium de 150 millimlaires et de solution d’imidazole de 10 millimlaires, à un millilitre par minute. Après le dernier lavage, elute le TEV et oncleaved HIS6 NEMO-EEAA, avec trois volumes de colonne de Tris millimolar, chlorure de sodium de 150 millimlaires, imidazole millimolaire et deux millimolar DTT solution, dans un flacon de 50 millilitres.

Tirez le flux à travers les fractions, contenant cleaved NEMO-EEAA construire et concentrer l’échantillon avec un concentrateur de cellules agitées, à cinq millilitres. Après la dialyse de nuit comme démontré, chargez cinq millilitres de l’échantillon sur des colonnes de chromatographie d’exclusion de taille de 16 millimètres par 60 centimètres. Répéter au besoin, selon le volume de l’échantillon.

À un millilitre par minute, et à deux millimolaires Tris, chlorure de sodium de 100 millimlaires et solution DDT de deux millimolaires. Après avoir tiré les fractions, correspondant à la nemo-EEAA dimérique, concentrer l’échantillon dans le concentrateur de cellules agitées, avec un poids moléculaire coupé membrane de trois kilodalton, à une concentration finale de 113 micromolaires. Ensuite, aliquot la protéine pour le stockage à quatre degrés Celsius, pour un mois.

Pour le criblage matriciel clairsemé, ajoutez 60 microlitres de solution matricielle clairsemée dans chacun des 96 puits d’une plaque de cristallisation de chambre à deux gouttes. Pour s’asseoir et laisser tomber la diffusion de vapeur. Et ajoutez la solution protéique à un drop setter robotique.

Ensuite, utilisez un setter de chute robotique, pour distribuer 100 nanolitres de solution protéique à 1,65 milligramme par millilitre, dans un rapport un à un avec solution de réservoir dans la première goutte, à un volume final de 200 nanolitres. Et ajouter 66 nanolitres de solution protéique avec 134 nanolitres de solution de réservoir, à un volume final de 200 nanolitres dans la deuxième goutte. Ensuite, scellez immédiatement la plaque avec du ruban adhésif de trois pouces de large.

Ensuite, rangez les plateaux dans un stockage d’imageur de cristallisation, à 20 degrés Celsius. Vérification automatique des images collectées, pour la présence de cristaux, à partir de deux jours après le stockage des plaques. Pour la production de stock de semences, transférer la goutte entière contenant le cristal d’intérêt, dans 50 microlitres de solution d’état de cristallisation, dans le flacon fourni, à partir d’un kit de génération de semences.

Et vortex le stock de graines, avec 20 secondes de pulsation et 10 secondes de repos, pendant trois minutes. Ensuite, diluer périodiquement le stock de graines, en un à 10 incréments, jusqu’à un à 10 000. Et stocker les dilutions à quatre degrés Celsius, jusqu’à nouvel usage.

Un à deux jours avant l’expédition au synchrotron, couper la bande du haut du puits, avec le cristal d’intérêt. Et ajouter 0,5 microlitres de solution de cristallisation contenant 12%un, deux cryoprotecteur dio propane, directement au puits. Déloger doucement le cristal avec une boucle cryo.

Bouclez le cristal du puits et rangez le cristal contenant de la boucle cryo dans une rondelle immergée dans de l’azote liquide, jusqu’à l’expédition pour la diffraction des rayons X. Après avoir reçu les données de diffraction des rayons X, traiter les intensités à l’échelle dans le serveur STAR et ISO. Utilisation d’une moyenne d’indexation de cristallographie aux rayons X, de 1,2 pour la surface limite de diffraction pour les données.

Et chargez sur Phoenix. Pour déterminer la structure, utilisez la structure des rayons X de GCN4 comme modèle de recherche pour le remplacement moléculaire, en utilisant MRage à Phoenix. La structure 4DMD, sera définie comme un ensemble.

Et la solution MRage s’adaptera avec succès à la partie structure, correspondant à l’adaptateur de bobines en bobines terminales fin de NEMO-EEAA. au modèle de recherche, pour les deux chaînes dans le dimère. La protéine sur-exprimée apparaît à une bande, à environ 14 marqueurs de poids moléculaire kilodalton, avant la première purification de la colonne IMAC.

Et affiche une bande de monomères et une bande de dimères, à 14 et 28 kilodaltons, respectivement, après la première élitution. Le clivage TEV est pratiquement complet, après l’élitution, à travers la deuxième colonne IMAC. Presque entièrement comme un dimère, au poids moléculaire attendu.

Chromatographie d’exclusion de taille, affiche un pic unique, échappant entre 60 à 65 millilitres, qui répondent au dimère. Le criblage fin produit des cristaux qui peuvent être utilisés pour produire un stock de semences pour la production de cristaux NEMO-EEAA, pour la collecte de données. Ici, les profils de diffraction des cristaux NEMO-EEAA représentatifs sont affichés.

L’analyse structurale de la protéine NEMO-EEAA, révèle une bobine en bobine parallèle irrégulière homodimeric, approximativement 175 angstroms dans la longueur. La région régulière en bobines en bobines englobe la séquence idéale de l’adaptateur à bobines bobines, à la fin du terminus. Et les deux premiers heptades de la séquence appropriée NEMO.

Une bobine en bobine régulière, est également présente au terminus C. À partir de nemo résidus 97 et englobant le terminal C idéal adaptateur bobine bobine. La structure liée bêta IKK, affiche une confirmation plus ouverte bobine bobine, pour accueillir le ligand.

Avec un espacement interhelical plus grand de un à 2,2 angstroms dans cette région. La structure d’un ligand dans NEMO, offre une nouvelle cible pour la conception des inhibiteurs par des méthodes de calcul. Et pour le criblage visuel des poches de liaison avec les bibliothèques de petites molécules.

Nous avons maintenant un chemin pour la cristallisation de la construction nemo conçu dans complexe avec de petites molécules ligands. Aider au développement et à l’optimisation d’une nouvelle classe d’inhibiteurs.