Name: Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez l'évaluation des réponses pharmacologiques dans les cultures d'organoides de prostate. Cette méthode permet d'étudier comment le génotype influence la réponse aux médicaments et de modéliser la résistance aux traitements.

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K.P. est soutenu par NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. est soutenu par HHMI; CA193837; Ca092629; CA224079; CA155169; CA008748; et Starr Cancer Consortium. W.R.K. est soutenu par La Fondation néerlandaise contre le cancer/KWF Buit 2015-7545 et la Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

Tous les travaux décrits dans ce protocole ont été exécutés avec des organoïdes murines précédemment établis et des organoïdes patient-dérivés. Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux lignes directrices du Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Tous les tissus dérivés du patient ont été recueillis conformément aux règles et règlements du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB : 12001).
1. Préparation moyenne et tampon
<ol><li>Décongeler la matrice de membrane du sous-sol (p. ex. Matrigel) à 4 oC pendant la nuit avant de commencer l'expérience. Gardez-le sur la glace pendant l'utilisation.</li>
	<li>Placer les plaques de culture à 37 oC pendant 24 h avant les expériences. Cela aidera le dôme de matrice de membrane de sous-sol (ci-après désigné sous le nom de dôme de matrice) pour polymériser. Les organoïdes de placage sont décrits à l'étape 2.1.2.</li>
	<li>Préparer le milieu organoïde selon le protocole établi5.</li>
	<li>Préparer le milieu organoïde sans l'ajout du facteur de croissance épidermique (EGF; voir Tableau des matériaux pour les composants). EGF supprime la sortie transcriptionnelle AR et confère une résistance anti-androgène5.</li>
	<li>Préparer le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum bovin fœtal (SGF). REMARQUE: Ce support est utilisé pour inhiber la digestion enzymatique avec le remplacement de la trypsine dans les sections 2-4.</li>
	<li>Préparer des solutions médicamenteuses selon le protocole du fabricant. Pour l'enzalutamide/mdv3100 (ci-après appelé anti-androgène de deuxième génération), préparez une solution de stock de 100 M en sulfoxide de diméthyle (DMSO). Le stock peut être stocké à -20 oC pendant jusqu'à 6 mois et n'a pas besoin d'être frais.</li>
</ol>2. Isolement, digestion enzymatique, et établissement des organoïdes
<ol><li>Isoler les organoïdes de la prostate de la souris ou des tissus humains selon les protocoles précédemment établis5,7. Une brève description est fournie ci-dessous.<ol>
<li>Mince et enzymatiquement digérer le tissu de la prostate pour produire une suspension à cellule unique. Dans cette expérience, 1 mL de 5 mg/mL de collagène de type II dans ADMEM/F12 a été utilisé pour la digestion de 50 mg de tissu prostatique.</li>
		<li>Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min, compter les cellules, les resuspendre dans la matrice membranaire du sous-sol, et la plaque à la densité appropriée5,7 dans les dômes de matrice sur les plaques de culture organoïde pré-chauffées (plaquage est indiquée dans la figure 1A).</li>
		<li>Laisser les dômes se solidifier et ajouter des supports sur le dessus des dômes afin qu'ils soient complètement recouverts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivez des organoïdes à la quantité désirée pour les applications en aval. Le nombre de cellules peut être déterminé par des méthodes de comptage standard. Consultez la section spécifique à l'application du protocole pour plus de détails sur la densité.</li>
	<li>À l'aide d'une pipette P1000, dessiner le médium et la pipette de haut en bas pour perturber. Lorsque la matrice de membrane du sous-sol est complètement perturbée, transférer la suspension à un tube conique de 15 ml. Ne placez pas plus de 10 dômes par tube conique unique de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et laver la pastille cellulaire avec 5 ml de PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 4 ml de remplacement de trypsine. Digérer de 5 à 10 min en secouant à 37 oC. Ajouter un volume égal de milieu organoïde - 10% FBS pour inhiber le remplacement de la trypsine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et le suspendre dans 1 ml de PBS.</li>
	<li>Filtrer la suspension à l'air d'un filtre de 40 m pour assurer une suspension à cellule unique. Quantifier le numéro de cellule à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un dispositif de comptage équivalent. REMARQUE : Si l'obtention de cellules individuelles viables est difficile, utilisez le tri du débit pour obtenir une solution cellulaire unique.</li>
</ol>3. Évaluer la capacité de formation des organoïdes
REMARQUE : Pour déterminer le pourcentage de cellules qui peuvent générer un organoïde, un analyse d'ensemencement peut être effectué comme un proxy pour le potentiel de tige/progéniteur. La capacité de formation d'organoïdes est également importante pour définir un nombre d'ensemencement de cellules pour les essais de viabilité.
<ol><li>Diluer la suspension cellulaire obtenue à l'étape 2,7 à 100 cellules par 10 L de la suspension à l'aide du milieu organoïde contenant 10 'M Rho kinase inhibiteur Y-27632.</li>
	<li>Transférer 1 100 cellules (110 l de suspension) dans un nouveau tube conique.</li>
	<li>Ajouter 285 l de matrice de membrane de sous-sol et resuspendre les cellules. Cela se traduira par une concentration de matrice de 70 %. REMARQUE : La dilution de la matrice de membrane de sous-sol pendant l'ensemencement réduit considérablement la variation de la taille du dôme, causée par la viscosité de la matrice protéique.</li>
	<li>Cellules de graines dans 35 l de dômes de matrice dans une plaque de puits préréchauffée de 24, résultant en 200 cellules/puits. La plaque 3-5 se reproduit par échantillon (voir également la méthode de placage à la figure 1A et à l'étape 2.1.2).</li>
	<li>Pour s'assurer que les cellules restent dans le dôme de matrice, retournez la plaque et placez-la dans un incubateur de cellules pour solidifier la matrice de membrane de sous-sol.</li>
	<li>Après 10 min, retirer la plaque de l'incubateur et ajouter le milieu contenant l'inhibiteur de la kinase Rho.</li>
	<li>Rafraîchir le milieu tous les 2 jours. Après 7 jours, quantifier le nombre d'organoïdes. Gardez l'inhibiteur de la kinase Rho dans les médias tout au long de l'expérience.</li>
	<li>Comptez le nombre d'organoïdes établis par dôme et calculez le pourcentage d'organoïdes formés sur le nombre total de cellules plaquées (200 cellules). REMARQUE : Les ratios d'établissement organoïde varient de 3 % à 60 % selon le type de cellule et le génotype.</li>
</ol>4. Détermination des réponses pharmacologiques des organoïdes
<ol><li>Poursuivant à partir de l'étape 2.7, graines 1.000-10.000 cellules dans un dôme de matrice. Utilisez l'efficacité de formation des organoïdes et la vitesse de croissance comme un proxy pour déterminer le nombre final de la cellule. REMARQUE : Les numéros de cellulaire recommandés sont fournis dans le tableau 1. Utilisez trois à cinq répliques par condition par analyse. Utilisez une concentration finale de 70% de matrice de membrane de sous-sol pour réduire les erreurs de tuyauterie induites par la viscosité.</li>
	<li>Graine 35 'L de dômes de matrice dans une plaque de 24 puits et laisser les dômes se solidifier comme fait dans la section 3 (voir également la méthode de placage dans la figure 1A et l'étape 2.1.2). Ajouter le milieu contenant l'inhibiteur de la kinase Rho et le médicament de choix. Cette méthode peut être appliquée à tous les médicaments, mais dans ce protocole, un anti-androgène de deuxième génération est utilisé à 10 M pour un exemple. Pour déterminer la demi-concentration inhibitrice maximale (IC50), effectuer un journal10 incrémental, et comme un contrôle, utiliser le véhicule dans lequel le médicament a été dissous.</li>
	<li>Rafraîchissez le milieu tous les deux ou trois jours et analysez les organoïdes le jour 7 pour déterminer la réponse pharmacologique du médicament. Les critères temporels peuvent varier entre le choix de l'expérience et de la drogue. REMARQUE : Les organoïdes n'ont pas besoin d'être trypsinisés pour effectuer ces essais.</li>
	<li>Pour garder les organoïdes intacts, à l'aide d'une pipette P1000, dessinez le médium et la pipette de haut en bas pour perturber la matrice de membrane du sous-sol.</li>
	<li>Lorsque la matrice de membrane du sous-sol est complètement perturbée, transférer la suspension à un tube conique de 15 ml. Ne transférez pas plus de 10 dômes matriciels par tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Tirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS.</li>
	<li>Resuspendre les organoïdes dans 1 ml de PBS et perturber les organoïdes à l'aide de trituration et d'une pipette Pasteur en verre.</li>
	<li>Quantifier le nombre de fragments d'organoïdes. Les graines 5 se reproduisent contenant 100 fragments d'organoïdes tels que décrits à l'étape 2.1.2.</li>
	<li>Effectuer l'exemple de viabilité cellulaire tel que décrit ci-dessous à la section 7.</li>
</ol>5. Isolement d'ARN des organoïdes
REMARQUE : Les méthodes à base de colonnes disponibles dans le commerce donnent une bonne quantité et une bonne qualité d'ARN. Pour assurer une bonne quantité d'ARN, utilisez un minimum d'un dôme par échantillon; cependant, l'utilisation de trois dômes est recommandée, qui peut être ensemencée dans un seul puits d'une plaque de 12 puits.
<ol><li>Ajouter le mercaptoéthanol (1 %) au tampon de lyse de glutathion dans le kit d'isolement d'ARN.</li>
	<li>Retirez le milieu des dômes de membrane du sous-sol contenant des organoïdes et ajoutez 750 l de ce tampon. Pipette de haut en bas à l'aide d'une pipette P1000. Vérifiez que toute la matrice de membrane du sous-sol a été dissoute.</li>
	<li>Ajouter 750 l d'éthanol à 70 % et mélanger par pipetting. Transférer par la suite 700 l du mélange à la colonne, centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min, et répéter avec le reste du lysate.</li>
	<li>Effectuer les lavages et le traitement DNase sur colonne selon les instructions du fabricant. L'ARN d'Elute dans 30-50 'L d'eau RNAse-free.</li>
	<li>Mesurer les concentrations à l'aide d'un fluoromètre à l'OD à 260 nm et 280 nm et entreposer à -80 oC ou continuer avec des applications en aval.</li>
</ol>6. Isolement des protéines des organoïdes
REMARQUE : Pour l'isolement des protéines, préparez un tampon RIPA standard contenant des inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase (Tableau des matériaux). L'utilisation d'au moins trois dômes est recommandée, qui peut être ensemencée dans un seul puits 12.
<ol><li>À l'aide d'une pipette P1000, dessinez le milieu de la cellule avec les dômes de membrane du sous-sol contenant des organoïdes et des pipettes de haut en bas pour perturber la matrice de membrane du sous-sol.</li>
	<li>Lorsqu'elle est complètement perturbée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS glacé. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 4 ml de remplacement de trypsine. Digdion de 5 à 10 min en secouant à 37 oC.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de milieu organoïde - 10% FCS pour inhiber le remplacement de la trypsine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. REMARQUE : Après centrifugation, aucune matrice de membrane de sous-sol ne devrait être visible dans la pastille.</li>
	<li>Retirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS glacé. Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans un tampon de lyse de 300 l à l'aide d'un tuyauphe P1000, puis transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.</li>
	<li>Incuber sur la glace pendant 10 min et ensuite sonicate 2x pour 30 s chacun à l'eau refroidie avec une température de 4 oC. Placez le tube sur la glace et effectuez la quantification des protéines en utilisant des méthodes standard.</li>
	<li>Dénaturer la protéine en ajoutant du sulfate de dodécyl de sodium (SDS) contenant du colorant de chargement et faire bouillir pendant 5 min à 95 oC. Conserver les lysates à -80 oC ou continuer avec des applications en aval.</li>
</ol>7. L'assoucande de viabilité cellulaire avec des organoïdes
REMARQUE : La viabilité des cellules peut être évaluée à l'aide du kit d'analyse de viabilité cellulaire disponible dans le commerce et d'un lubraméricain. Préparer les tampons selon les instructions du fabricant. Cinq répliques par condition sont recommandées : une réplique composée d'un dôme de matrice de membrane de membrane de sous-sol de 35 l l dans un puits d'une plaque de 24 puits.
<ol><li>Retirez le milieu de la culture organoïde, en prenant soin de laisser les dômes de matrice intacts.</li>
	<li>Ajouter 65 L de PBS et pipette de haut en bas pour perturber le dôme de matrice.</li>
	<li>Ajouter 100 L du tampon du kit d'assay de viabilité de la cellule et le suspendre à nouveau par pipetting.</li>
	<li>Incuber à température ambiante (RT) pendant 10 min en secouant.</li>
	<li>Transférer 100 l de mélange sur une plaque non translucide adaptée au luminomètre et effectuer la lecture selon les instructions du fabricant pour le kit d'évaluation de la viabilité de la cellule.</li>
</ol>8. Préparation d'organoïdes pour le xénogreffe
REMARQUE : Les organoïdes sont également propices à la greffe sous-cutanée chez les deux animaux immunodéprimés, ainsi que chez les souris isogéniques. Pour s'assurer que les organoïdes injectés se distinguent in vivo, étiquetez les organoïdes avec un fluorophore constitutivement exprimant5. Il est recommandé d'effectuer une expérience pilote pour la greffe en utilisant 5 x 105 cellules à 2 x 106 cellules par injection, avec des incréments de 5 x 106 cellules, que l'efficacité de greffe varie entre les lignées organoïdes.
<ol><li>À l'aide d'une pipette P1000, dessinez le médium et la pipette de haut en bas pour perturber la matrice de membrane du sous-sol. Lorsqu'elle est complètement perturbée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. REMARQUE : Ne transférez pas plus de 10 dômes de matrice par tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Retirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 4 ml de remplacement de trypsine. Digdion de 5 à 10 min en secouant à 37 oC.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de milieu organoïde - 10% FBS pour inhiber le remplacement de la trypsine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et le suspendre dans 1 ml de PBS. Filtrer la suspension à l'air d'un filtre de 40 m pour assurer une suspension à cellule unique. Quantifier les cellules à l'aide de méthodes standard.</li>
	<li>Faites tourner et resuspendles les cellules de l'inhibiteur de la PBS et de Rho à une concentration de 2 x 106 cellules par 100 l (voir le tableau 2 pour les concentrations cellulaires et le nombre absolu de cellules nécessaires pour des concentrations variables). Utilisez un volume égal de matrice de membrane de sous-sol pour générer une suspension 1:1. Placez la suspension sur la glace.</li>
	<li>Injecter des cellules selon les protocoles standard et surveiller la croissance du xénogreffe en utilisant des méthodes standard8.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162 (2), 454(2015).</li>
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</ol>

C.L.S siège au conseil d'administration de Novartis; est cofondateur d'ORIC Pharmaceuticals et co-inventeur de l'enzalutamide et de l'apalutamide; est conseiller scientifique pour Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra et PMV; et est cofondateur de Seragon, racheté par Genentech/Roche en 2014. W.R.K. est coinventeur et titulaire de brevets en technologie organoïde.

Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance aux antiandrogènes et découvrir les vulnérabilités thérapeutiques potentielles nécessite de tester des réponses pharmacologiques dans des systèmes modèles imitant le cancer de la prostate. Décrit ici est un protocole détaillé pour l'analyse fiable des réponses pharmacologiques dans les organoïdes de prostate patients-dérivés et génétiquement modifiés et la préparation de ces échantillons d'organoïdes pour des applications en aval.
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La résistance aux médicaments est l'un des principaux problèmes cliniques dans le traitement du cancer. Le traitement du cancer de la prostate métastatique (PCa) est principalement dirigé vers l'axe de signalisation des androgènes. Les thérapies antiandrogènes de prochaine génération (par exemple, enzalutamide et abiraterone) ont montré le grand succès clinique, mais pratiquement tous les PCa progressent par-même vers un état androgène-indépendant, ou cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC).
Le profilage génomique et transcriptomique récent du CRPC a indiqué qu'il y a trois mécanismes généraux de résistance dans le cancer de la prostate : 1) activant des mutations ayant pour résultat la restauration du récepteur d'androgène (AR) signalant1; 2) activation de la signalisation de pontage, comme illustré dans un modèle préclinique pour la résistance de thérapie anti-androgène de prochaine génération dans laquelle l'activation du récepteur de glucocorticoid (GR) peut compenser la perte de signalisation d'AR2; et 3) le processus récemment identifié de plasticité de lignée, dans lequel les cellules de tumeur acquièrent la résistance en changeant des lignées d'un type de cellule dépendant de la cible de drogue à un autre type de cellule qui n'est pas dépendant de ceci (qui, dans PCa, est représenté en tant que AR-négatif et/ou maladie neuroendocrine [NEPC])3,4. Cependant, les mécanismes moléculaires qui causent la résistance aux médicaments ne sont pas compris. En outre, la résistance anti-androgène acquise peut mener aux vulnérabilités thérapeutiques qui peuvent être exploitées. Par conséquent, il est essentiel d'évaluer les réponses des médicaments dans les systèmes modèles qui imitent les phénotypes et les génotypes des patients.
Les organoïdes de la prostate sont des cultures organotypiques cultivées dans une matrice de protéines 3D avec un milieu défini. Fait important, les organoïdes de la prostate peuvent être établis à partir de tissus bénins et cancéreux d'origine murine ou humaine, et ils conservent des caractéristiques phénotypiques et génotypiques trouvées in vivo5,6. Fait important, les cellules sensibles aux anti-androgènes PCa et CRPC sont représentées dans le recueil actuel des organoïdes. En outre, les organoïdes de prostate sont facilement génétiquement manipulés utilisant CRISPR/Cas9 et shRNA5. Ainsi, les organoïdes de prostate sont un système modèle approprié pour tester des réponses de drogue et élucider des mécanismes de résistance. Ici, un protocole détaillé est décrit pour effectuer des essais de drogue et analyser des réponses pharmacologiques utilisant des organoïdes de prostate.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale 200 nM</td></tr><tr><td>ADMEM/F12</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>12634028</td><td>Composant du milieu organoïde</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>17504-044</td><td>Composant du milieu organoïde</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire</td><td>Fisher</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>Titre cellulaire Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale 1 nM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale 50 ng/ml pour la souris, 5 ng/nl pour l’homme</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 ng/ ml</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 5 ng/ml</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>35050079</td><td>Composant du milieu organoïde</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FABRIQUÉ EN INTERNE</td><td>N/A</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale 10 mM</td></tr><tr><td>Matrigel (facteur de croissance réduit & Sans rouge de phénol)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td>Composant du milieu organoïde</td></tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale 1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 mM</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>Peprotech ou cellules 293t transfectées stables avec construction Noggin (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-10C</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale Milieu conditionné à 10 % ou 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptavidine</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-109</td><td>Composant du milieu organoïde</td></tr><tr><td>Inhibiteurs de la phospatase</td><td>Merck Millipore</td><td>524629</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandine E2</td><td>Tocris</td><td>3632464</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>Merck Millipore</td><td>539131</td><td></td></tr><tr><td>R-SPONDIN</td><td>Cellules 293t transfectées par Peprotech ou stables avec construction R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-38</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale Milieu conditionné à 10 % ou 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>Minikit RNA-easy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=152121-30-7&amp ; interface=CAS %20No.& lang=fr& region=US& focus=product">152121-30-7</a></td><td>Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 &mu ; M</td></tr><tr><td>TryplE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>Composant du milieu organoïde : Concentration finale 10 &mu ; L</td></tr></tbody></table>

les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Présenté ici est un protocole pour étudier la pharmacodynamique, le potentiel de cellules souches, et la différenciation de cancer dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes de prostate sont des cultures réactives d'androgène, tridimensionnelles (3D) cultivées dans un milieu défini qui ressemble à l'épithélium prostatique. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des modèles sauvages-type et génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé. Fait important, les organoïdes dérivés du patient ressemblent étroitement aux tumeurs en génétique et en biologie tumorale in vivo. En outre, les organoïdes peuvent être manipulés génétiquement à l'aide de systèmes CRISPR/Cas9 et shRNA. Ces génétiques contrôlées rendent la culture organoïde attrayante en tant que plate-forme pour tester rapidement les effets des génotypes et des profils mutationnels sur les réponses pharmacologiques. Cependant, les protocoles expérimentaux doivent être spécifiquement adaptés à la nature 3D des cultures organoïdes pour obtenir des résultats reproductibles. Décrits ici sont des protocoles détaillés pour effectuer des essais d'ensemencement pour déterminer la capacité de formation d'organoïdes. Par la suite, ce rapport montre comment effectuer des traitements médicamenteux et analyser la réponse pharmacologique par des mesures de viabilité, l'isolement des protéines et l'isolement de l'ARN. Enfin, le protocole décrit comment préparer des organoïdes pour le xénogreffe et les essais de croissance in vivo subséquents utilisant la greffe sous-cutanée. Ces protocoles produisent des données hautement reproductibles et sont largement applicables aux systèmes de culture 3D.

Efficacité de l'ensemencement La capacité de formation d'organoïdes est déterminée par phénotype et génotype. Les cellules basales de la prostate de type sauvage (WT) ont montré une capacité de formation organoïde supérieure (30 %-40 %) par rapport aux cellules lumineuses (3%) (Figure 1A). Après l'établissement d'organoïdes, la capacité de formation a augmenté radicalement. En règle générale, 25 % à 30 % des cellules dériv...

Présenté ici est un protocole pour étudier des réponses pharmacologiques dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes ressemblent beaucoup à la biologie in vivo et récapitulent la génétique des patients, ce qui en fait des systèmes modèles attrayants. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des prostates sauvages de type, des modèles génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé.

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Ce protocole fournit des méthodes standard et reproductibles pour évaluer les réponses pharmacologiques dans les cultures organoïdes de la prostate. Les cultures organoïdes de la prostate fournissent un système in vitro qui préserve de nombreux aspects de la biologie in vivo et de la réponse pharmacologique en permettant aux cellules d’adopter une structure tridimensionnelle dans une matrice membranaire du sous-sol. Nous sommes particulièrement enthousiastes à l’idée d’utiliser ces méthodes pour évaluer comment le génotype dicte la réponse pharmacologique dans la prostate et pour modéliser la résistance aux médicaments.Ces méthodes peuvent être appliquées aux systèmes de culture organoïde qui utilisent la méthode de placage dôme. Cependant, les composants dans les médias tels que les facteurs de croissance peuvent différer selon le type de tissu. La démonstration visuelle permettra une discussion plus spécifique et détaillée des étapes du protocole et de leur différe des nombreux autres systèmes de culture organoïde publiés à la disposition des chercheurs.La culture organoïde prend généralement plus de temps que la culture cellulaire bidimensionnelle. Assurez-vous d’allouer plus de temps à ces méthodes. Commencez par isoler les organoïdes de la prostate de la souris ou des tissus humains.Hacher et digérer enzymatiquement le tissu pour produire une suspension à cellule unique, puis recueillir les cellules par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes. Comptez les cellules et réutilisez-les dans la matrice membranaire du sous-sol. Ensuite, plaquez-les à la densité appropriée dans les dômes matriciels sur des plaques de culture organoïdes préchauffées.Les dômes doivent être à deux millimètres l’un de l’autre et du côté du puits. Une fois solidifié, ajouter doucement les supports du côté du puits pour éviter de perturber la matrice. Une fois que les dômes se sont solidifiés, ajouter des supports sur le dessus du dôme afin qu’ils soient complètement couverts.Cultivez des organoïdes à la quantité désirée pour les applications en aval déterminant le numéro de cellule avec des méthodes de comptage standard. Lorsque les organoïdes sont prêts à l’emploi, dessinez le milieu avec une pipette Pten00 et pipette de haut en bas pour perturber la matrice membranaire du sous-sol. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 millilitres et une centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes.Aspirer le supernatant et laver la pastille cellulaire avec cinq millilitres de PBS. Répétez la centrifugation, puis resuspendez la pastille en quatre millilitres de remplacement de trypsine et laissez-la digérer pendant cinq à dix minutes tout en secouant à 37 degrés Celsius. Ajouter un volume égal de milieu organoïde avec 10%FBS pour inhiber le remplacement de la trypsine et centrifuger le tube à 300 fois g pendant cinq minutes.Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en un millilitre de PBS. Filtrez ensuite les cellules à l’aide d’un filtre de 40 micromètres pour assurer la suspension d’une seule cellule et comptez-les à l’aide d’un hémomètre. Diluer la suspension cellulaire à 100 cellules par 10 microlitres à l’aide d’un milieu organoïde avec 10 inhibiteurs micromolaires de rho kinase Y27632.Transférer 1100 cellules dans un nouveau tube conique et ajouter 285 microlitres de matrice membranaire du sous-sol, ce qui se traduira par une concentration matricielle de 70%. Ensuite, ensemencer les cellules dans 35 microlitres de dômes matriciels dans une plaque préchauffée de 24 puits en s’assurant de plaquer trois à cinq répliques par échantillon. Retournez la plaque et placez-la dans un incubateur cellulaire pour solidifier la matrice du sous-sol.Après 10 minutes, retirer la plaque de l’incubateur et ajouter le milieu contenant l’inhibiteur de la rho kinase. Actualisez le milieu tous les deux jours et après sept jours, comptez le nombre d’organoïdes établis par dôme et calculez le pourcentage d’organoïdes formés à partir du nombre total de cellules. Après avoir isolé les organoïdes comme décrit précédemment, graine 1000 à 10 000 cellules dans le dôme matricielle en utilisant l’efficacité de la formation organoïde et la vitesse de croissance comme un proxy pour déterminer le nombre final de cellules.Puis ensemencer 35 microlitres de dômes matriciels dans une plaque de 24 puits et laisser le dôme se solidifier. Ajouter le milieu contenant l’inhibiteur de rho kinase et le médicament de choix. Effectuer un journal 10 incrémentiel pour déterminer la concentration inhibitrice à moitié maximale à l’aide du véhicule dans lequel le médicament a été dissous comme un contrôle.Rafraîchissez le milieu tous les deux à trois jours et analysez les organoïdes le septième jour pour déterminer la réponse pharmacologique au médicament en effectuant un test de viabilité cellulaire tel que décrit dans le manuscrit. Pour plaquer les fragments organoïdes sans trypsinisation, utilisez une pipette Pten00 pour aspirer le milieu et la pipette de haut en bas pour perturber la matrice membranaire du sous-sol. Lorsque la matrice est complètement perturbée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 millilitres et une centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes.Aspirer le supernatant et ajouter cinq millilitres de PBS. Après le lavage, resuspendez les organoïdes en un millilitre de PBS et perturbez les organoïdes par trituration avec une pipette pasteur en verre. Quantifier le nombre de fragments organoïdes et de graines cinq répliques avec 100 fragments comme décrit précédemment.Sept jours plus tard, effectuer un test de viabilité cellulaire selon les instructions manuscrites. Les cellules basales de prostate de type sauvage ont démontré la formation organoïde supérieure comparée aux cellules luminales. Une augmentation mineure de la formation organoïde a été réalisée avec crispr-Cas9-2000 perte de Pten ou P53 et la perte des deux capacités de formation accrues.Les effets des molécules anti androgènes sur la croissance ont été testés chez des organoïdes murins avec différents génotypes. La perte de P53 n’a pas causé de résistance aux molécules anti androgènes, mais la perte de Pten a augmenté la résistance. La double perte de P53 et de Pten, cependant, a eu comme conséquence la résistance complète.L’inhibition des récepteurs androgènes a également modifié les phénotypes. Les organoïdes supprimés de type sauvage Pten et P53 ont démontré la diminution de la taille organoïde de lumen tandis que les organoïdes avec la perte de Pten et de P53 étaient phénotypiquement inchangés. Comme prévu, lorsque ces cellules ont été greffées sous-cutanée dans le flanc, seuls les organoïdes Pten et P53 doublement supprimés ont grandi.Deux organoïdes distincts de cancer de la prostate humains MSKPCA2 et MSKPCA3 ont été examinés pour leur réponse aux molécules anti-androgènes. La prolifération des organoïdes MSKPCA2 a été fortement inhibée tandis que les organoïdes MSKPCA3 sont restés inchangés. MSKPCA2 a exprimé des niveaux élevés de récepteurs androgènes et FKBP5 ainsi que des protéines luminales caractéristiques.MSKPCA3 a également exprimé des marqueurs basaux et mésenchymaux et n’a montré aucune expression de FKBP5 suggérant que ces organoïdes modélisent un phénotype non-luminal androgène-indépendant. Les organoïdes doivent être perturbés périodiquement soit par trypsinisation, soit par trituration avec une pipette en verre afin de rester viables. La fréquence dépend de l’origine et du génotype des espèces.N’importe quel type d’expérience de séquençage ou de protéomique de prochaine génération peut être effectué selon les procédures décrites. Ces expériences étudieraient la base moléculaire des phénotypes et des réponses pharmacologiques. Cette technique tridimensionnelle de culture organoïde permet aux chercheurs d’étudier in vitro les réponses pharmacologiques dans un contexte génétique hautement contrôlé.Cela peut être une alternative fiable à de longues études in vivo.

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Nous présentons ici un protocole visant à guider la manipulation humaine primaire organoïde la prostate puis indiquent les points de terminaison pour évaluer le phénotype. Semis, entretien de la culture, recouvrement de gel de matrice, quantification morphologique, enrobage et sectionnement, FFIP sectionnement, entier-montez coloration et application d’essais commerciaux sont décrites.

Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

Nous montrons une méthode pour l'autopsie et la dissection des modèles de cancer de la prostate de souris, se concentrant sur la dissection de tumeur de prostate. Un protocole étape par étape pour la génération des organoïdes de tumeur de prostate de souris est également présenté.

Génération d'organoïdes tumoraux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés du cancer de la prostate

Les organoïdes de prostate de souris représentent un contexte prometteur pour évaluer des mécanismes qui règlent la différenciation. Cet article décrit une approche améliorée pour établir des organoïdes de prostate, et introduit des méthodes pour (1) recueillir le lysate de protéine des organoïdes, et (2) fixer et tacher des organoïdes pour la microscopie confocale de monture entière.

Évaluer la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate de la souris à l'aide de la culture organoïde

Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d'os maintiennent l'hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d'optimisation et un protocole pour la culture 3D d'échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l'aide de l'IFC.

Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Ce protocole décrit une évaluation standardisée des sensibilités médicamenteuses aux inhibiteurs de signalisation ciblés dans des modèles organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC.

Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR

Ce protocole décrit une méthode semi-automatisée pour les criblages de médicaments organoïdes à débit moyen à élevé et un logiciel d’analyse d’images automatisé indépendant du microscope pour quantifier et visualiser les réponses multiparamétriques et mono-organoïdes aux médicaments afin de capturer l’hétérogénéité intratumorale.

Criblage multiparamétrique de médicaments organoïdes tumoraux à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes à grand champ pour l’analyse en vrac et mono-organoïde

Un protocole détaillé est fourni ici pour établir des organoïdes mammaires humains à partir de résections de tumeurs mammaires dérivées de patientes ou de tissu mammaire normal. Le protocole fournit des instructions complètes étape par étape pour la culture, la congélation et la décongélation d’organoïdes mammaires humains dérivés de patientes.

Établissement et culture d’organoïdes mammaires dérivés de patientes

Les organoïdes tumoraux ont révolutionné la recherche sur le cancer et l’approche de la médecine personnalisée. Ils représentent un modèle de tumeur cliniquement pertinent qui permet aux chercheurs de garder une longueur d’avance sur la tumeur en clinique. Ce protocole établit des organoïdes tumoraux à partir d’échantillons frais de tissus tumoraux pancréatiques et de xénogreffes dérivées de patients d’origine adénocarcinome pancréatique.

Mise en place d’organoïdes tumoraux et de fibroblastes dérivés du cancer du pancréas à partir de tissus frais

L’hétérogénéité du cancer de la prostate et la résistance au traitement restent des défis. Nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes dérivés du patient (PDO) qui préservent les principales caractéristiques tumorales parentales. Ce modèle standardisé soutient le dépistage des médicaments et les progrès de la médecine de précision.

Établissement et maintenance d’organoïdes du cancer de la prostate dérivés de patients : un protocole expérimental détaillé

Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin à base d’organoïdes prostatiques cultivé en 2D. Elle comprend la dissociation organoïde, l’ensemencement cellulaire, la différenciation, l’évaluation de l’intégrité épithéliale et l’infection in vitro par Escherichia coli uropathogène. Le modèle offre une accessibilité apicale et convient à l’étude des interactions hôte-pathogène, surmontant ainsi les limites des systèmes organoïdes 3D traditionnels.

Génération d’un modèle à base d’organoïdes prostatiques de souris pour étudier les interactions hôte-pathogène

Découvrez l'évaluation des réponses pharmacologiques dans les cultures d'organoides de prostate. Cette méthode permet d'étudier comment le génotype influence la réponse aux médicaments et de modéliser la résistance aux traitements.

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques (Vidéo) | JoVE Journal

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

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