Name: Isolement des microglies spécifiques à la région de lhémisphère cérébral dune souris adulte pour le séquençage profond de lARN à une seule cellule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez l'isolement de microglies cérébrales chez la souris adulte pour le séquençage ARN à cellule unique. Cette méthode semi-automatisée révèle l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies en santé et maladie.

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Nous remercions Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno et Spyros Darmanis pour leur aide lors de l'élaboration de ce protocole. Nous remercions également le Stanford Shared FACS Facility, en particulier Meredith Weglarz et Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) pour leur grand soutien pour le tournage. Ce travail est financé par la Fondation JPB et la Fondation Vincent J. Coates.

Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l'Université Stanford, qui sont conformes aux lois et aux politiques nationales et étatiques. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité administratif sur les soins aux animaux de laboratoire de l'Université Stanford.
REMARQUE: Toutes les compositions de solution et de mémoire tampon sont fournies dans tableau des matériaux.
1. Préparation le jour de l'isolement cellulaire
<ol><li>Préparer les réactifs suivants et les refroidir sur la glace : moyen A (50 mL), tampon de tri cellulaire à activation magnétique (MCS) (30 mL), tampon FACS (25 mL), saline tamponnée en phosphate (PBS; 30 mL), DNase (320 l) et inhibiteur de la RNase (30 l). REMARQUE: Les volumes fournis ici sont suffisants pour isoler les microglies de 4 régions du cerveau (par exemple, cortex, cervelet, hippocampe et striatum) d'un seul hémisphère cérébral de souris. Échelle si plus de tissus sont utilisés.</li>
	<li>Placer quatre homogénéisateurs d'once propre de 2 ml sur la glace et ajouter 2 ml de Moyen A avec 80 l de DNase (12 500 unités/mL) et 5 l d'inhibiteur de la RNase dans chaque homogénéisateur Dounce. Refroidir les pistons dans des tubes de 15 ml.</li>
	<li>Étiqueter quatre plats Petri de 6 cm avec des régions cérébrales pour la collecte des tissus et ajouter 200 l de moyen froid A dans chaque plat sur glace. Ajouter environ 5 ml de Moyen A dans un plat Petri de 6 cm pour la dissection. REMARQUE: Avant d'être utilisé, assurez-vous que tous les réactifs sont stériles et adaptés aux applications d'ARN. Les outils de banc et de dissection doivent être nettoyés et pulvérisés avec la solution de décontamination de RNase (Tableau des matériaux).</li>
</ol>2. Dissection de région de cerveau
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 30 min.
<ol><li>Injecter 400 à 500 l de kétamine/xylazine (24 mg/mL de kétamine et 2,4 mg/mL de xylazine) dans le péritoine d'une souris de stade juvénile à adulte (1 mois). REMARQUE: Une souris mâle est utilisée ici pour l'illustration, mais l'un ou l'autre sexe est approprié.</li>
	<li>Attendez 5 min et pincez une patte postérieure pour assurer le manque de rétraction.</li>
	<li>Utilisez immédiatement une aiguille de 26 G x 3/8 pour effectuer la perfusion transcardique avec 20 à 30 ml de PBS glacé jusqu'à ce que le tampon s'épuise sans sang visible.</li>
	<li>Décapiter la souris avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Utilisez de petits ciseaux pour ouvrir la peau pour exposer le crâne sous-le-champ, puis coupez à travers la suture sagittale, la suture lambdoidal et la suture coronale. Utilisez des forceps pour retirer les deux côtés de l'os pariétal et de l'os interpariétal sans endommager le tissu, et déplacez soigneusement le cerveau dans le plat Petri de dissection avec A moyen.</li>
	<li>Utilisez une lame pré-réfrigérée pour couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères. REMARQUE: Les quatre régions de cerveau décrites ici d'un seul hémisphère produisent des nombres suffisants de microglies pour des applications d'ARN-seq unicellulaires ou en vrac. L'autre hémisphère peut être utilisé pour l'immunohistochimie ou la validation in situ de l'ARN.</li>
	<li>Séparez le cervelet du lobe cortical et du tronc cérébral avec #55 forceps et transférez le tissu dans un plat Petri de collection.</li>
	<li>Utilisez #55 forceps pour disséquer soigneusement l'hippocampe et le striatum du cortex et transférer chaque tissu dans un plat Petri collection.</li>
</ol>3. Dissociation des tissus mécaniques
REMARQUE: Gardez les cellules et les réactifs au frais tout le temps, sauf pendant les étapes de coloration. Cette étape devrait prendre 30 min.
<ol><li>Hacher chaque tissu cérébral à l'arme de rasoir en morceaux fins de3 mm.</li>
	<li>Utilisez une pipette de 1 ml (avec des pointes coupées) pour transférer des morceaux de tissu dans les homogénéisateurs Dounce préréfrigérés, contenant chacun 2 ml de Moyenne A avec inhibiteur de la DNase et de la NAse.</li>
	<li>Homogériser le tissu en tordant lentement le piston dans et hors de l'homogénéisateur Dounce pendant 6 à 10 coups complets, jusqu'à ce qu'aucun morceau visible ne soit présent. REMARQUE: Douncing tue les neurones et la plupart des autres cellules gliales, mais laisser les cellules microgliales plutôt intactes. L'insuffisance et le sur-douncing peuvent mener au faible rendement des cellules.</li>
	<li>Transférer les tissus dissociés dans des tubes de 50 ml à travers des passoires de 70 m.</li>
	<li>Rincer chaque homogénéisateur Dounce et piston avec un total de 6 ml de milieu a froid et filtrer la solution de rinçant e à travers la même passoire dans le tube correspondant.</li>
	<li>Transférer les suspensions à une seule cellule (environ 8 ml chacune) dans des tubes coniques de 15 ml et une centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC avec frein 5.</li>
</ol>4. Enlèvement de myéline
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 60 min.
<ol><li>Préparer 1 grande colonne d'épuisement (LD) (pour le cortex) et 3 colonnes de grande sélection (LS) (pour les 3 autres régions) dans un séparateur magnétique (Tableau des matériaux). Rincer chaque colonne avec 3 ml de tampon MCS.</li>
	<li>Une fois la centrifugation terminée, sortir la pipette et jeter le supernatant sans déranger la pastille. Pour les tissus du cortex et du cervelet, resuspendre les cellules dans 850 l'amorti MCS avec 1,8 l d'inhibiteur de la RNase. Pour les tissus de l'hippocampe et du striatum, resuspendre les cellules dans 400 l'amorti MCS avec 0,9 l d'inhibiteur de la RNase. REMARQUE: Les colonnes (LD vs LS) et le volume utilisé pour la resuspension sont optimisés en fonction de la quantité de myéline présente dans le tissu. Si d'autres régions du cerveau sont astoyées, ces conditions peuvent devoir être ajustées en fonction de la taille du tissu et de la quantité de myéline qui peut exister. L'efficacité de l'élimination de la myéline peut être estimée à l'étape 4.9.</li>
	<li>Ajoutez 100 l de perles d'ablation de myéline chacune dans les cellules du cortex et du cervelet et ajoutez 50 l de perles d'ablation de la myéline chacune dans les cellules de l'hippocampe et du striatum.</li>
	<li>Mélanger délicatement les cellules avec des perles et incuber les tubes sur la glace pendant 10 min.</li>
	<li>Porter le volume du tube avec des cellules corticales à 2 ml avec tampon MCS, et tous les autres à 1 ml (c.-à-d., ajouter 1 mL pour les cellules corticales; 500 l pour les cellules hippocampales et striatal; pas besoin d'ajouter un tampon aux cellules cérévelaires).</li>
	<li>Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçant, placez un tube de 15 ml au-dessous de chaque colonne. Chargez les cellules corticales (2 ml) sur la colonne LD, et toutes les autres (1 ml chacune) sur les colonnes LS. Utilisez immédiatement 1 mL de tampon MCS chacun pour laver les tubes d'origine et charger la solution sur les colonnes correspondantes.</li>
	<li>Laver la colonne LD une fois avec 1 mL de tampon MCS et laver chaque colonne LS deux fois avec 1 ml de tampon MCS chaque lavage. Continuer à recueillir la solution de flux pendant le lavage.</li>
	<li>Filtrer les cellules dans des tubes FACS à fond rond à travers des bouchons de passoire de 35 m. REMARQUE: Chaque tube doit recueillir environ 4 ml de suspension à cellule unique appauvrie de la myéline.</li>
	<li>En option, prenez 10 L de la suspension de la cellule et mélangez-la avec 10 l de la solution bleu trypan de 0,4 %. Examinez les cellules sous un microscope de champ lumineux de 10x pour estimer le rendement, le taux de survie et le niveau de myéline résiduelle. REMARQUE: Une préparation réussie devrait générer plus de 90% de cellules vivantes (de forme ronde et à l'exclusion du colorant bleu) avec peu ou pas de débris de myéline.</li>
	<li>Cellules de pellet dans les tubes FACS à 400 x g pendant 5 min à 4 oC, avec frein 5. Versez lentement le supernatant et tamponnez le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendre les cellules dans chaque tube avec 300 l de tampon FACS. REMARQUE: Si le tri MCS est préférable, les perles de CD11b peuvent être employées pour sélectionner des microglies et d'autres cellules myéloïdes suivant l'enlèvement de myéline. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour le scRNA-seq non-plat-basé aussi bien que l'ARN-seq en vrac. La mise en garde de cette approche alternative est que les perles de CD11b ne séparent pas les microglies des autres cellules immunitaires connexes qui sont également positives pour cet antigène.</li>
</ol>5. Staining pour le tri cellulaire activé par fluorescence
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 40 min.
<ol><li>Ajouter 5 ll de souris fc récepteurs bloquer réactif (Tableau des matériaux) dans chaque tube. Incuber 5 min sur glace.</li>
	<li>Ajouter 1 l de CD45-PE-Cy7 et 1 l de CD11b-BV421 dans chaque tube. REMARQUE: Des anticorps avec d'autres fluorophores conjugués peuvent être utilisés. Les anticorps contre TMEM119, un marqueur spécifique pour les microglies homéostatiques9, peuvent également être inclus, mais il est recommandé d'être utilisé avec CD45 et CD11b, parce que certaines sous-populations de microglies peuvent perdre l'expression de surface TMEM119.</li>
	<li>Incuber les tubes sur un shaker pendant 10 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Ajouter 2 mL de tampon FACS pour laver.</li>
	<li>Les cellules pelleteuses à 4 oC, 400 x g pendant 5 min. Verser lentement le supernatant et tamponner le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendre les cellules de chaque tube à l'aide de 400 l de tampon FACS avec 1 l d'inhibiteur de la RNase et 0,5 l d'iodure de propidium (PI, 1:1 000 dilution).</li>
</ol>6. Index FACS Tri
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 1 h.
<ol><li>Suivant la procédure FACS standard, dessinez des portes basées sur la dispersion (à l'exclusion des débris), les cellules individuelles, les cellules vivantes (PI négatif), les microglies et les cellules myéloïdes (CD45,CD11b). REMARQUE: Les cellules microgliales typiques expriment CD45 à des niveaux inférieurs comparés à d'autres macrophages frontaliers, tels que les macrophages périvasculaires et méningés, et donc gating sur CD45 faible CD11b- devrait être suffisant si l'accent de la recherche est des profils d'expression génique dans ces microglies classiques1,2. Cependant, certains sous-ensembles de microglies peuvent avoir une expression CD45 plus élevée et cela est particulièrement vrai pendant le développement ou dans des conditions de maladie. Afin d'assurer une analyse impartiale de l'expression des gènes microglial, les immunophénotypes cD45 élevés et cD45 faibles peuvent être enregistrés par le biais du réglage du tri de l'indice et des deux populations recueillies pour le séquençage et l'analyse en aval. En outre, l'expression de surface TMEM119 peut être utilisée pour cibler la population microgliale homéostatique (voir l'étape 5.2) et analysée avec les niveaux de CD45 et les résultats de séquençage.</li>
	<li>Trier une seule microglie (avec une buse de 100 m) dans des plaques de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 96 puits, contenant 4 ll de tampon de lyse chaque puits (voir le protocole publié14 pour plus de détails). REMARQUE: Le mélange de pointe d'ARN externe du Consortium (ERCC)(tableau des matériaux)peut être ajouté à 1:2.4 x 107 dans le tampon de lyse pour le contrôle de la qualité et la normalisation2.</li>
	<li>Vortex brièvement les plaques et tourner vers le bas à l'aide d'une centrifugeuse banc-dessus.</li>
	<li>Congeler immédiatement les échantillons sur de la glace sèche. Conserver les assiettes à -80 oC jusqu'à la préparation de la bibliothèque. REMARQUE: Alternativement, plus de cellules peuvent être rassemblées dans des tubes de 1.5 ml avec tampon d'extraction d'ARN pour l'ARN-seq en vrac. Selon l'expérience des auteurs, 3 000 cellules sont suffisantes pour générer des bibliothèques de bonne qualité suivant le protocole publié2,14.</li>
</ol>7. Préparation de la bibliothèque à séquençage de l'ARN à cellule unique
REMARQUE: Ici, le protocole publié14 est suivi pour générer des bibliothèques scRNA-seq à l'aide de la robotique de manipulation liquide et quelques modifications. Dans cet article, la procédure n'est décrite que brièvement, et les différences sont mises en évidence. Le traitement simultané de 4 plaques prend environ 2,5 jours.
<ol><li>Décongeler les plaques sur la glace et effectuer la transcription inverse avec l'amorce Oligo-dT30VN (dans le tampon de lyse) pour générer de l'ADNc avec des cycleurs thermiques (tableau 1) : 42 oC 90 min; 70 oC 5 min; 4 oC. Ensuite, amplifiez l'ADNc avec une étape supplémentaire de digestion exonuclée au début (tableau 2) en utilisant le mix maître PCR et les amorces IN situ PCR (ISPCR) ( Tableaudes matériaux) et l'état PCR suivant : 37 oC 30 min; 95 oC 3 min; 23 cycles de 98 oC 20 s, 67 oC 15 s, 72 oC 4 min; 72 oC 5 min.</li>
	<li>Purifez l'ADNc à l'aide de 18 l de perles magnétiques par puits (rapport de 0,7:1). Incuber la plaque sur un support magnétique pendant 5 min et laver les échantillons deux fois avec de l'éthanol fraîchement préparé à 80 %, 80 l par puits à chaque fois. Après le séchage de la plaque pendant 15-20 min, élifier l'ADNc avec 20 l de tampon d'élution par puits. REMARQUE: Pour le contrôle de la qualité, utilisez un analyseur de fragments (analyse de fragments de séquençage de nouvelle génération à haute sensibilité, 1 à 6 000 pb) pour vérifier les distributions de taille et les concentrations d'ADNc, et ne traitez que d'autres échantillons avec un frottis compris entre 500 et 5 000 pb, et supérieur à 0,05 ng/L.</li>
	<li>Pour générer des bibliothèques, mélanger 0,4 L de chaque échantillon d'ADNc avec 1,2 L de réactifs tn5 de tagmentation du kit de préparation de la bibliothèque (Table of Materials) dans une plaque de 384 puits à l'aide d'une machine à pipetage nanolitre, à 55 oC 10 min. REMARQUE: Ici, 1/12.5 du volume de réaction suggéré (5 échantillons ll et 15 l de réactifs de tagmentation) est ajouté afin de réduire les coûts et, entre-temps, d'augmenter le débit. Une machine de pipetage de nanolitre (Table des matériaux)est employée pour transférer des réactifs (ceci et les étapes suivantes) des plaques et à 384 puits.</li>
	<li>Ajouter 0,4 L de tampon de neutralisation pour arrêter la réaction de tagmentation à RT pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 384 index(tableau des matériaux, 0,4 L à l'avant et 0,4 l inverse), 1,2 l de mélange PCR aux échantillons (2 l chacun), et amplifier les bibliothèques en utilisant la condition suivante : 72 oC 3 min; 95 oC 30 s; 10 cycles de 95 oC 10 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min; 72 oC 5 min.</li>
	<li>Regroupez toutes les bibliothèques individuelles (prendre 1 l chacune) à partir de la même plaque de 384 puits ensemble, et utilisez des perles magnétiques(tableau des matériaux,0,7:1 ratio) pour purifier les bibliothèques finales mises en commun.</li>
	<li>Utiliser un fluoromètre (Tableau des matériaux) pour mesurer les concentrations et un bioanalyseur (Tableau des matériaux) pour examiner les distributions de taille des bibliothèques mises en commun avant le séquençage. Ciblez la profondeur de séquençage à 1 million de lectures brutes par cellule.</li>
	<li>Suivez les procédures bioinformatiques standard pour filtrer et couper les lectures de séquençage et effectuer l'alignement2. Utilisez le tableau de comptage et les métadonnées comme entrées pour effectuer l'analyse de clustering avec le paquet Seurat15.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les microglies interagissent activement avec d'autres types de cellules du SNC, et elles sont très sensibles aux stimuli environnementaux. Afin de minimiser les réponses inflammatoires et les changements aberrants dans leur expression génique au cours du processus d'isolement, ce protocole a été simplifié à partir d'une méthode publiée précédemment9, et il est maintenant approprié d'isoler les microglies de plusieurs régions d'un seul hémisphère du cerveau de souris en parallèle. Les tissus et les...

Les microglies, qui représentent 5 % à 10 % de toutes les cellules neurales, sont des macrophages résidents dispersés dans tout le système nerveux central (SNC)1. Protégées derrière la barrière hémato-encéphalique, les microglies typiques d'un cerveau adulte en bonne santé contiennent de nombreux processus fins qui s'étendent rapidement et se rétractent pour interagir avec les neurones et autres cellules gliales du parenchyme. Microglia peut également adopter la morphologie amoeboid associée à une fonction phagocytique accrue au cours de stades de développement spécifiques ou sur les défis immunitaires dans les blessures et la maladie1,2,3,4. De récentes découvertes passionnantes ont clairement démontré que les microglies ne sont en aucun cas des spectateurs passifs aux signaux dérivés du cerveau ou pathologiques, mais jouent un rôle central dans le contrôle du développement du cerveau et de l'homéostasie, par exemple, en soutenant la survie neuronale, en élagant des synapses immatures, en favorisant la différenciation des cellules de lignée d'oligodendrocytes ainsi qu'en angiogenèse1. Comme plus de fonctions de microglies sont élucidés, l'excitation est encore alimentée par des études de génétique humaine, qui ont montré que de nombreux gènes de risque de maladie neurodégénérative, tels que TREM2, sont principalement ou exclusivement exprimés par microglies5,6,7. Compte tenu de leur importance dans le développement et des rôles plausibles de la maladie-moteur, des efforts énormes ont été récemment mis en vue de notre compréhension de la régulation et de la fonction des gènes microglials dans l'espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives1,8.
Le séquençage de l'ARN (ARN-seq) permet une caractérisation impartiale de l'expression génétique spécifique au type cellulaire, qui guide à son tour les scientifiques pour étudier les fonctions génétiques dans les réseaux cellulaires denses7. L'ARN-seq avait été principalement fait sur des échantillons en vrac, menant à la découverte d'une signature de gène microglial homéostatique qui les distingue des autres cellules neurales et immunitaires9. Cependant, une telle approche pourrait négliger les différences moléculaires et fonctionnelles entre les microglies, en particulier celles qui sont présentes de façon transitoire dans le développement, ou associées au vieillissement et à la maladie. En effet, l'ARN-seq unicellulaire (scRNA-seq) offre la sensibilité et la résolution qui ont révolutionné le domaine en révélant l'hétérogénéité précédemment sous-estimée des microglies dans une variété de contextes2,3,10. En outre, en raison de la présence d'autres cellules immunitaires similaires à l'interface de circulation du SNS, scRNA-seq fournit des informations aidant à la conception de nouveaux outils pour séparer et disséquer fonctionnellement ces cellules connexes avec peu de connaissances préalables2,11.
Une gamme variée de plates-formes scRNA-seq ont été inventées, chacune adaptée à certaines applications12. En général, les méthodes à base de gouttelettes, telles que la génomique 10x, sont plus élevées dans le débit avec (des dizaines de) milliers de cellules séquencées dans chaque course, et ils sont moins sélectifs pour l'entrée qui peut contenir des populations de cellules mixtes nécessitant une catégorisation large. Les méthodes basées sur les plaques fournissent une sensibilité plus élevée et lisent la profondeur13,14, ciblant habituellement des populations spécifiques du tri cellulaire pour révéler des différences subtiles ou des transcriptions rares. Étant donné le faible pourcentage de cellules microgliales, en particulier celles qui sont associées au développement ou à la maladie, parmi tous les types de cellules du SNC, il est souvent souhaitable d'isoler les microglies d'une région d'intérêt spécifique et d'obtenir des informations transcriptomiques profondes et complètes afin de comprendre leur hétérogénéité.
Ici, nous fournissons des détails sur la façon d'isoler les microglies de différentes régions du cerveau de souris disséqués à partir d'un seul hémisphère, qui sont utilisés pour une seule cellule (ou en vrac) ARN-seq suivant une procédure semi-automatisée de préparation de bibliothèque à base de plaques. L'autre hémisphère peut alors être utilisé pour la validation histologique. Simplifié à partir d'une méthode9déjà publiée, ce protocole d'isolement vise à maximiser le rendement à partir d'une petite quantité de matériaux de départ, et en attendant maintenir des profils d'expression microgliale endogène. Nous utilisons le tri des cellules activées par la fluorescence (FACS) pour enrichir les microglies (ou d'autres cellules immunitaires connexes d'intérêt) en plaques de 96 puits et miniaturiser les volumes de réactifs pour la préparation de la bibliothèque afin d'augmenter le débit. Nous mettons en évidence cette plate-forme sensible scRNA-seq, bien que d'autres stratégies basées sur les plaques puissent être appliquées. Cette méthode peut être facilement adaptée pour isoler les microglies d'autres tissus disséqués, tels que les blessures ou les foyers de la maladie, et l'âge de la souris peut varier selon presque tous les stades postnatals. L'isolement efficace des microglies régionales pour les études de transcriptomique unicellulaire facilitera une meilleure compréhension de leurs fonctions en santé et en maladie.

<table><tbody><tr><td>5 M Bétaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R0192</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks' Solution saline équilibrée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polystyrène à fond rond de 5 mL, avec capuchon de filtre de cellule</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI, kit d’analyse de fragments NGS haute sensibilité (1 bp &ndash; 6 000 bp)</td><td>Analytique avancée</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>Cat# LS002007</td><td>Solution de travail : 12500 unités/ml</td></tr><tr><td>DTT, Grade moléculaire</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 index)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 index)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 index)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 index)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>Exonucléase lambda (5 U/&mu ; l)</td><td>New England BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>billes d’élimination de la myéline</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cycles)</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>PCRClean DX billes</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P3566</td><td>Coloration : 1:1000</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti souris/humain CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 101236 ; RRID : AB_11203704</td><td>Coloration : 1:300</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti souris CD45, PE / Cy7 (clone 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82 ; RRID : AB_469625</td><td>Coloration : 1:300</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase recombinante</td><td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Transcriptase inverse (100 U/&mu ; l)</td><td>Clontech</td><td>Cat# 639538</td><td>Contenant 5x Tampon Premier brin</td></tr><tr><td><fort>Oligonucléotides</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &mu ; M ISPCR Oligo : 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN primer : 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' (« r » est les forribobases et « + » est pour une base LNA)</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon FACS</td><td></td><td></td><td>Recette : filtre stérile 1 % FBS, 2 mM d’EDTA, 25 mM HEPES dans 1X tampon</td></tr><tr><td></td><td></td><td>PBS MCS</td><td>Recette : filtre stérile 0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans 1X PBS</td></tr><tr><td>Medium A</td><td></td><td></td><td>Recette : 15 mM HEPES, 0,5 % glucose dans 1X HBSS sans phénol red</td></tr><tr><td>Plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 puits Rigi-Plate PCR Microplaques, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>Plaques PCR à coque dure 96 puits</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Others</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur Dounce, 2 ml</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td>357422</tr><tr><td>Grande colonne d’épuisement</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Grande colonne de sélection</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Passoire (70 &mu ; m)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf » target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de fragments</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito HTS robot de pipetage nanolitre</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/ » target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorimètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'arn à une seule cellule

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Comme macrophages résidents dans le système nerveux central, microglies contrôlent activement le développement du cerveau et l'homéostasie, et leurs dysfonctionnements peuvent conduire les maladies humaines. Des progrès considérables ont été réalisés pour découvrir les signatures moléculaires des microglies homéostatiques ainsi que des altérations de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux. Avec l'avènement et la maturation des méthodologies génomiques unicellulaires, il est de plus en plus reconnu que les microglies hétérogènes peuvent sous-tendre les divers rôles qu'elles jouent dans différentes conditions développementales et pathologiques. Une dissection plus poussée d'une telle hétérogénéité peut être obtenue par un isolement efficace des microglies d'une région d'intérêt donnée, suivie d'un profilage sensible des cellules individuelles. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement rapide des microglies de différentes régions du cerveau dans un seul hémisphère de cerveau de souris adulte. Nous démontrons également comment utiliser ces microglies triées pour le séquençage profond d'ARN à cellule profonde à base de plaque. Nous discutons de l'adaptabilité de cette méthode à d'autres scénarios et fournissons des lignes directrices pour améliorer le système afin de tenir compte des études à grande échelle.

Ce protocole décrit une méthode pour isoler et trier les microglies de différentes régions du cerveau dans un hémisphère cérébral perfused adulte, suivie de scRNA-seq. Nous utilisons le douncing pour créer une suspension à cellule unique et aussi comme première étape pour enrichir les microglies. L'insuffisance ou le sur-douncing réduit le rendement. En outre, les cerveaux adultes de souris contiennent des niveaux élevés de myéline, qui peut également réduire l'efficacité de tri et le rendement s'il n'est pas enlevé corr...

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Cette méthode permet une capturisation impartiale de l’expression des gènes des microglies à un niveau unicellique, ce qui peut aider à élucider l’hétérogénéité moléculaire des microglies dans un cerveau sain et diseaseé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une procédure détaillée pour l’isolement rapide des microglies de différentes régions du cerveau et montre comment générer efficacement la base de jeu des bibliothèques RA6 à cellule unique pour le séquençage profond. Pour commencer cette procédure, préparez tous les tampons et solutions nécessaires tels qu’ils sont décrits dans le protocole textuel et refroidissez-les sur la glace.Après avoir euthanasié et décapité la souris, utilisez de petits ciseaux pour ouvrir la peau sur la tête pour exposer le crâne en dessous. Ensuite, coupez à travers la suture sagittale, la suture lambdoidal, et la suture coronale. Utilisez des forceps pour retirer les deux côtés de l’os pariétal et de l’os interpariétal sans endommager le tissu et déplacer soigneusement le cerveau dans une dissection boîte de Petri contenant moyen A.À l’aide d’une lame pré-réfrigérée, couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères.Utilisez le nombre 55 forceps pour séparer le cervelet du lobe cortical et du tronc cérébral. Ensuite, utilisez le nombre 55 forceps pour disséquer soigneusement l’hippocampe et le striatum du cortex et transférer chaque tissu dans une boîte de Pétri de collection séparée. Tout d’abord, utilisez une lame de rasoir pour couper chaque région du cerveau en morceaux fins de moins d’un millimètre cube.À l’aide d’une pipette d’un millilitre avec la pointe coupée, transférer les morceaux de tissu dans des homogénéisateurs Dounce pré-refroidis. Homogénéiser le tissu en tordant lentement le piston dans et hors de l’homogénéiseur Dounce pendant six à 10 coups complets jusqu’à ce qu’aucun morceau visible ne soit présent. Ensuite, transférez les tissus dissociés dans des tubes de 50 millilitres à travers 70 passoires micrométriques.Rincer chaque homogénéiseur et piston Dounce avec un total de six millilitres de milieu froid A puis transférer le rinçage dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation. Centrifugeuse suspension à cellules simples à 400 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avec une pause à cinq. Rincez une grande colonne d’épuisement et trois grandes colonnes de sélection dans un séparateur magnétique avec trois millilitres de MCS.Lorsque la centrifugation pour les échantillons de tissus est terminée, pipette et jeter supernatant sans déranger la pastille. Resuspendez les cellules dans le tampon MCS qui contient l’inhibiteur de la RNase. Ajouter 100 microlitres de perles d’élimination de la myéline à chaque tube contenant des cellules re-suspendues du cortex et du cervelet et ajouter 50 microlitres de perles d’élimination de la myéline à chacun des tubes contenant des cellules re-suspendues de l’hippocampe et du striatum.Incuber les tubes sur la glace pendant 10 minutes. Après cela, ajouter mcs au tube contenant des cellules corticales pour porter son volume jusqu’à deux millilitres et aux tubes restants pour amener chacun de leurs volumes jusqu’à un millilitre. Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçage, chargez deux millilitres de cellules corticales sur la grande colonne d’épuisement et un millilitre de suspension cellulaire sur de grandes colonnes de sélection séparées.Ensuite, lavez les grandes colonnes d’épuisement avec un millilitre de tampon MCS et lavez chaque grande colonne de sélection deux fois à l’aide d’un millilitre de tampon MCS pour chaque lavage. Filtrer les cellules à travers 35 bouchons de passoire à microlitres dans des tubes FACS à fond rond. Centrifuger ces tubes à 400 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules.Puis, versez lentement le surnatant et tamponnez le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendez les cellules dans chaque tube avec 300 microlitres de tampon FACS. Tout d’abord, ajoutez cinq microlitres de récepteurs FC de souris bloquent le reagent à chaque tube.Incuber sur la glace pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de CD45 PE taille sept et un microlitre de CD11B BV421 à chaque tube. Incuber les tubes sur un shaker à température ambiante pendant 10 minutes.Après cela, ajouter deux millilitres de tampon FACS pour laver. Centrifugeuse à 400 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules. Resuspendez les cellules dans chaque tube avec 400 microlitres de tampon FACS contenant un microlitre d’inhibiteur de la RNase et 0,5 microlitres d’iodure de propidium.Suivant la procédure FACS standard, trier les microglies vivantes avec une buse de 100 micromètres en plaques PCR de 96 puits qui contiennent quatre microlitres de tampon de lyse dans chaque puits. Vortex brièvement les plaques et les faire tourner vers le bas à l’aide d’une centrifugeuse bench top. Conserver les assiettes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la préparation de la bibliothèque.Lorsque vous êtes prêt à procéder, décongeler la plaque sur la glace. Utilisez un cycleur thermique pour effectuer une première transcription pour générer de l’ADNC et amplifier l’ADN avec une étape supplémentaire de digestion de l’exonucléase telle qu’elle est décrite dans le protocole de texte. Après cela, purifier l’ADNC en ajoutant 18 microlitres de perles magnétiques à chaque puits.Incuber la plaque sur un support magnétique pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supernatant et lavez les échantillons deux fois avec de l’éthanol fraîchement fait à 80 % à l’aide de 80 microlitres d’éthanol par puits pour chaque lavage. Pour effectuer le tagmentation, utilisez une machine à pipetage nanoliter pour mélanger 0,4 microlitres de chaque échantillon d’ADNC avec 1,2 microlitres de réachemins de tagmentation Tn5 de la trousse de préparation de la bibliothèque dans une plaque de 384 puits à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.Pour arrêter la réaction de tagmentation, ajoutez 0,4 microlitres de tampon de neutralisation à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, à 384 index et 1,2 microlitres de PCR mélangés aux échantillons et amplifier les bibliothèques comme décrit dans le protocole de texte. Mettre en commun toutes les bibliothèques individuelles à partir de la même plaque de 384 puits ensemble et utiliser des perles magnétiques pour purifier les bibliothèques finales en commun.Dans cette étude, les microglies sont isolées du cortex, du cervelet, de l’hippocampe et du striatum de l’hémisphère cérébral d’une souris adulte. La suspension cellulaire préparée est examinée au microscope à l’aide d’un trypan bleu et d’un hémocytomètre pour estimer le rendement, la viabilité cellulaire et l’efficacité de l’ablation de la myéline avant d’effectuer des taches d’anticorps. Le nombre total de cellules à ce stade devrait être supérieur à 30 000 pour le cortex et à plus de 5000 pour les autres tissus.Plus de 90% des cellules devraient être viables avec peu de débris de myéline. Une machine FACS est utilisée pour trier les microglies, qui sont généralement CD45 faible et CD11B positif. L’isolement réussi devrait générer plus de 80% de microglies de toutes les cellules individuelles vivantes, au moins pour le tissu cortical.Une fois que les microglies individuelles sont capturées dans le tampon de lyse, l’ARN est libéré et par la suite inversé transcrit à cDNA, qui est ensuite amplifié pendant 23 cycles. En tant que plate-forme d’électrophoresis capillaire, l’analyseur de fragments et les kits de fragments NGS hautement sensibles fournissent des informations rapides et précises sur la distribution de la taille, ainsi que la quantité de molécules d’ADNC présentes dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Des échantillons montrant un frottis entre 500 et 5000 paires de base et supérieurs à un certain seuil de concentration peuvent être utilisés pour faire des bibliothèques.Les échantillons sont séquencés à une profondeur de plus d’un million de lues brutes par cellule, ce qui sature la puissance de détection de la méthodologie de séquençage de l’ARN à cellule unique. Avec un taux de cartographie d’environ 60% sur 2000 gènes peuvent être détectés par cellule microgliale. Les données précédemment publiées générées à partir de cette méthode d’isolement sont reproduites à partir d’expériences indépendantes, démontrant la sensibilité pour détecter des gènes spécifiques aux microglies à travers la population séquencée.Avec l’information des transcriptions simples de microglies, les chercheurs peuvent découvrir les populations cellulaires uniques dans le contexte de leur intérêt, et étudier plus loin la pertinence fonctionnelle de ces populations nouvellement identifiées.

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Le profilage de l'expression de l'ARN de régions cérébrales murines discrètes nécessite une stratégie de collecte de tissus précise et reproductible. Un protocole utilisant à la fois la section coronale du cerveau et la microdissection assistée par un carottier tissulaire est décrit ici. Le rendement et la qualité de l'ARN total obtenu à partir des échantillons résultants confirment l'utilité de la méthode décrite.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

La vidéo montre une technique permettant d’isoler la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte. Tout d’abord, le cortex subit une segmentation et une homogénéisation pour éliminer les neurones et autres cellules gliales, préservant ainsi la microglie. Ensuite, la suspension cellulaire est exposée à des microbilles magnétiques anti-myéline et à un champ magnétique, séparant efficacement les cellules microgliales et myéloïdes des débris de myéline et des cellules contenant de la myéline.

Isolement de la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme  

Le protocole actuel décrit comment isoler et purifier la microglie hippocampique primaire de souris adultes, suivi d’instructions pour effectuer des enregistrements de cellules entières sur ces cellules fortement isolées.

Isolement et enregistrement par patch-clamp de cellules entières de la microglie de l’hippocampe chez des souris adultes

Ce protocole combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire pour isoler et caractériser les états des cellules microgliales dans le cervelet des cerveaux de souris postnatals précoces. Il utilise la dissociation enzymatique, la centrifugation de Percoll et l’immunomarquage pour révéler l’hétérogénéité des microglies et améliorer la compréhension de leurs rôles dans le développement et la maladie cérébelleux.

Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Découvrez l'isolement de microglies cérébrales chez la souris adulte pour le séquençage ARN à cellule unique. Cette méthode semi-automatisée révèle l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies en santé et maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de lhémisphère cérébral dune souris adulte pour le séquençage profond de lARN à une seule cellule (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

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