Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats

La réparation oesophagère circonstancielle est techniquement provocante dans un modèle de rat, nécessitant le développement de l’oesophage tissu-machiné qui permet la régénération de la muqueuse oesophagique et du muscle sans fuite d’anastomosis oesophagique. Nous avons mis en place un échafaudage tubulaire à deux couches comme modèle pilote, composé d’une nanofibre interne et d’un brin externe d’impression 3D en conjonction avec une anastomose microvasculaire pour minimiser les fuites de salive après la transplantation. La reconstruction oesophagique standard conventionnelle est associée à un large éventail de complications et de morbidité.

Par conséquent, l’ingénierie des tissus oesophagiques peut être une stratégie alternative prometteuse pour développer un modèle d’œsophage du patient indigène. La combinaison d’échafaudage hybride, de culture de bioréacteurs et d’un système de nutrition orale peut être appliquée à tout système qui a un environnement contaminé similaire avec sa pression mécanique continue. Commencez par stériliser un échafaudage d’œsophage imprimé en 3D avec une exposition d’une heure à la lumière ultraviolette, un trempage de 10 minutes dans de l’éthanol et trois lavages avec PBS.

Après le dernier lavage, placez l’échafaud tubulaire à deux couches dans une plaque de culture de tissu non adherent de 24 puits, et ajoutez doucement mais uniformément une fois 10 aux six cellules souches mésenchymales humaines adipeuses par millilitre de matrice de membrane de sous-sol complétées par le milieu de croissance à la surface intérieure de l’échafaud. Utilisez un système de bioréacteur à écoulement pulsatile pour fixer fermement l’échafaud tubulaire ensemencé de cellules au support acrylique dans la chambre de culture du bioréacteur, et ajouter 500 millilitres de milieu de croissance à la chambre. Ensuite, appliquez 1 dyne par centimètre au carré de stress de cisaillement induit par le débit dans une atmosphère humide contenant 5% de dioxyde de carbone.

Après cinq jours, utilisez un kit d’analyse de viabilité LIVE/DEAD pour déterminer les réponses cellulaires à la surface intérieure de l’échafaudage selon les protocoles standard, et imagez les cellules par microscopie confoccale. Avant de commencer l’intervention chirurgicale, confirmer un manque de réponse au réflexe de pédale chez le rat anesthésié, et placer l’animal en position supinée sur un drapé stérile. Utilisez des tondeuses pour enlever les cheveux du site chirurgical et désinfectez la peau exposée avec du BETADINE séquentiel et des gommages à 70 % d’éthanol.

Pour le placement du tube T, faire une incision de la peau et du muscle de la ligne médiane dans l’abdomen du rat, et utiliser une lame de scalpel pour créer un orifice de trois millimètres dans la paroi gastrique antérieure. Insérez la pointe d’un tube T en silicone dans le site du défaut pour le fixer à la paroi de l’estomac, et suture soigneusement le tube au tissu musculaire gastrique. Suture de la paroi abdominale avec suture VICRYL 4-0.

Insérez soigneusement l’extrémité distale du tube T implanté à travers le tunnel sous-cutané à l’arrière du cou, et utilisez un angiocathéter pour connecter un bouchon d’héparine à l’extrémité du tube T pour empêcher le contenu de l’estomac de couler vers l’arrière. Lorsque le capuchon est en place, utiliser des sutures de polyglactine 4-0 pour fermer toutes les couches de la peau abdominale, et placer le rat dans une cage métabolique avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Une semaine après le placement du tube T, préparez le rat à la chirurgie comme démontré.

Placez le rat sous le microscope et faites une incision médiane antérieure du cou dans la peau désinfectée exposée. Séparez les muscles de la sangle pour exposer la structure trachéoesophagale. Isoler le côté gauche de l’œsophage de la trachée.

Séparez soigneusement la partie supérieure de l’œsophage de la glande thyroïde et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour créer un défaut circonférentiel complet de cinq millimètres de long contenant toutes les couches de l’œsophage. Ensuite, insérez une suture 9-0 entre la marge inferoposterior droite du reste et de l’échafaudage supérieurs d’oesophage, et continuez à suturing de droite à gauche entre le reste supérieur d’oesophage et l’échafaudage pour créer une microanastomosis à l’extrémité supérieure du défaut oesophagal distal. Ensuite, anastomose l’échafaudage de la même manière que la marge supérieure du reste inférieur de l’œsophage.

Lorsque les anastomoses sont terminées, poser le rabat de la glande thyroïde environnante sur le site transplanté pour assurer un approvisionnement vasculaire et un entretien stable de la greffe. Ensuite, coudre le muscle sous-cutané et le tissu cutané avec une suture VICRYL 4-0, et placer le rat dans une cage métabolique sur un dispositif de réchauffement infrarouge avec surveillance jusqu’à ce que la conjoncture complète. Après une application même à la paroi interne de l’échafaudage par injection, la matrice mesenchymale humaine de membrane de sous-sol incorporée par cellules souches démontre la morphologie mésenchymale attendue de cellules souches telle qu’évaluée par microscopie électronique de balayage.

Après la transplantation oesophagienne chez les rats avec des défauts oesophagiens circonférentiels complets comme démontré, la greffe est couverte d’un aileron de glande thyroïde pour la fixation stable et l’approvisionnement vasculaire au site implanté. Les rats transplantés oesophagènes restent à 340 grammes jusqu’à environ neuf jours après la procédure, à quel point les animaux diminuent rapidement en poids en raison de diverses causes, entraînant la mort par jour 15. Bien que la plupart des rats développent l’obstruction non-oesophagienne provoquée par des boules de poils, dans l’ensemble il n’y a aucune évidence brute de perforation, fuite d’anastomosis avec la fistule, l’accumulation de séroma, la formation d’abcès, ou la nécrose environnante de tissu mou dans n’importe quel animal expérimental.

La rééthélialisation du site de transplantation peut être confirmée par la coloration d’immunofluorescence pour la kératine, et la couche régénérée de collagène et les fibres d’élastine peuvent être clairement observées par la coloration trichrome de Masson. La régénération de la couche de muscle oesophagique est également démontrée par une néovascularisation abondante telle qu’évaluée par l’analyse immunohistochimique desmin. Le succès de cette procédure repose sur l’entretien stable du tube T par fixation derrière le cou pour fournir une nutrition pendant la reconstruction oesophagique.

Pour surmonter la mortalité tôt typique à cette procédure, la technologie organoïde ou tôt de vascularisation pourrait être appliquée suivant l’implantation oesophagique pour aider dans la reconstruction oesophagique fonctionnelle.