Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer

Cette méthode permet de faire la culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions strictes de bas fer et de purifier les vésicules membranaires du filtrate à faible culture du fer. Puisque la limitation de fer est connue pour stimuler la production de vésicule de membrane, ce protocole produit l’abondance élevée des vésicules pures de membrane qui peuvent être utilisées pour d’autres essais biochimiques ou fonctionnels. Lorsque nous démontrons le protocole utilisant le Smegmatis Mycobacterium, la souche nonvirulent, ce protocole peut être suivi dans les installations BSL-2 utilisant Mycobacterium tuberculosis, la souche virulente.

Pour commencer, préparez un litre de milieu minimal en dissolvant cinq grammes de phosphate de monopotassium, cinq grammes de L-asparagine, 20 millilitres de glycérol et deux grammes de dextrose dans 900 millilitres d’eau déionisée dans un récipient en plastique. Réglez le pH à 6,8 avec cinq hydroxyde de sodium normal et ajustez le volume à un litre avec de l’eau déionisée. Ajouter ensuite 50 grammes de résine de chélating métallique et agiter doucement à l’aide d’une barre magnétique pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, arrêtez l’agitation et laissez le sédiment de résine pendant environ 30 minutes. Stériliser et retirer le reste de la résine de la solution par filtration à travers une unité de filtre de 22 microns avec un récepteur en plastique. Maintenant, compléter le milieu minimal avec 0,5 milligramme par litre de chlorure de zinc, 40 milligrammes par litre de sulfate de magnésium, et 0,1 milligramme par litre de sulfate de manganèse.

Inoculer une seule colonie de VTT en deux millilitres de bouillon mycobactérien moyen complété par l’enrichissement ADN. Incuber avec agitation à 37 degrés Celsius. Lorsqu’il y a croissance visible, extraire deux millilitres de la culture et mesurer l’OD 540 sur un spectrophotomètre.

Arrêtez l’incubation lorsque l’OD 540 atteint 0,8, ce qui indique la phase logarithmique tardive. Étendre 200 microlitres de la culture logarithmique tardive sur les plaques d’agar mycobactériennes complétées par 0,2 glycérol, 0,5% tween 80 et ADN. Inoculer au moins cinq assiettes.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius. Et après une semaine, la croissance bactérienne est visible comme une couche confluente. Ensuite, mouiller un coton-tige stérile dans un milieu minimal de fer faible.

Utilisez cet écouvillon pour recueillir les bactéries dans les plaques d’agar. Inoculer les bactéries en 100 millilitres de faible teneur en fer minimal dans un tube. Recueillir suffisamment de bactéries pour préparer une suspension avec un OD 540 d’un.

Diluer la suspension 10 fois à un litre avec un milieu minimal à faible teneur en fer et la diviser en deux bouteilles en plastique stériles. Ensuite, transférez deux millilitres de la culture dans un tube de culture de cinq millilitres. Ajouter 10 microlitres de 10% de volume par volume tyloxapol.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius pendant 14 jours. Transférer la culture à cinq tubes de centrifugeuse conique de 225 millilitres et centrifugeuses à 2 850 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Recueillir le supernatant de culture avec une pipette de 50 millilitres et filtre stériliser à travers un filtre de 0,22 micron.

Pour isoler les MEV, transférez le filtrate de culture dans un système d’ultrafiltration cellulaire agité placé à quatre degrés Celsius et filtrez le concentré à une pression inférieure à 50 PSI à travers une membrane de coupure de 100 kilodaltons. Puis centrifugeuse le filtrate de culture concentrée à 15 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et recueillir le supernatant dans des tubes d’ultracentrifugation en polycarbonate. Centrifugeuse le supernatant à 100 000 fois g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Après cela, retirez le supernatant et resuspendez les granulés membranous dans un total d’un millilitre de PBS stérile par pipetting doux. Mélanger 0,5 millilitres de la suspension à granulés avec 1,5 millilitres de solution 60% iodixanol au fond d’un tube d’ultracentrifugeuse à parois minces en polypropylène. Superposez cette suspension MVE iodixanol 45% avec un millilitre de 40%35%30%25%et 20% de solutions iodixanol et un millilitre de PBS en haut.

Centrifugeuse à 100 000 fois g pendant 18 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez une seringue Hamilton d’un millilitre pour recueillir les fractions de gradient de densité d’un millilitre à partir du sommet. Diluer chaque fraction recueillie à 20 millilitres avec PBS et centrifugeuse à 100 000 fois g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Retirez le supernatant et resuspendez en 0,5 millilitres de PBS. Conserver les tubes à quatre degrés Celsius. Pour effectuer l’analyse des lipides membranaires, combinez 10 microlitres de chaque fraction de gradient avec la sonde à membrane fluorescente TMA-DPH à une concentration finale d’un microgramme par millilitre dans 50 microlitres de PBS dans chaque puits d’une plaque noire de 96 puits.

Incuber les plaques à 33 degrés Celsius pendant 20 minutes. Mesurer la fluorescence à 360 nanomètres pour l’excitation et 430 nanomètres pour l’émission. Dans ce protocole, les MEV ont été purifiés par la sédimentation différentielle dans un gradient de densité.

Dans les conditions décrites, les MEV ont été séparés principalement dans la fraction de gradient trois qui correspond à 25% iodixanol. Les protéines associées aux vésicules ont été concentrées dans la fraction trois indiquée par l’analyse de tache de point. La coloration négative a également confirmé la présence de MEVs dans la fraction trois et l’analyse de nanoparticules a montré que la taille du MEV était d’environ 100 nanomètres.

La concentration en protéines et en lipides normalisée en unités formant des colonies a montré une augmentation d’environ huit fois le rendement en MEV en fer faible par rapport à des conditions de fer élevées. L’analyse de tache de point a montré un signal plus intense des marqueurs MEV-associés dans des fractions de gradient de densité de la culture limitée de MTB de fer que des cultures suffisantes de VTT de fer. Suivez les instructions pour la préparation du milieu minimal afin d’assurer des conditions limitées en fer et de prévenir la contamination des vésicules membranaires par des agrégats de lipoprotéines.

Les vésicules de membrane mycobactérienne purifiées de cette manière peuvent être employées pour la caractérisation biochimique et l’analyse fonctionnelle.